Name: Blocage du flux lymphatique par suturing vaisseaux lymphatiques afferent chez la souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: Apprenez à bloquer le flux lymphatique par suture des vaisseaux lymphatiques afférents chez la souris. Cette méthode chirurgicale minimise les dommages aux cellules endothéliales lymphatiques et permet un contrôle précis du timing du blocage pour étudier l'homéostasie et les réponses immunitaires.

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Les auteurs remercient Ava Zardynezhad pour la relecture du manuscrit. Ces travaux sont appuyés par l’Institut canadien de recherche en santé (IRSC, PJT-156035), la Fondation canadienne pour l’innovation pour la SL (32930) et la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine pour Yujia Lin (81901576).

Tous les travaux sur les animaux doivent être approuvés par le comité institutionnel et gouvernemental d’éthique et de manipulation des animaux.  C’est une opéra tion de non-survie.
1. Préparation des matériaux
<ol><li>Préparer 100 mL d’éthanol à 70 % en mélangeant 70 mL d’éthanol à 100 % avec 30 mL d’eau stérile. Autoclave tous les outils chirurgicaux avant la chirurgie et garder les outils dans 70% d’éthanol avant et pendant la chirurgie pour maintenir la stérilisation.</li>
	<li>Préparer un appareil d’injection.<ol>
<li>Coupez ~30 cm de tube en polyéthylène (0,28 mm de diamètre). Connectez la pointe d’une aiguille de 30 G x 1/2 (aiguille A) à une extrémité du tube de polyéthylène. Déloger soigneusement une autre aiguille de 30 G x 1/2 (aiguille B) et relier le côté cassé à l’autre extrémité du tube de polyéthylène.</li>
		<li>Fixez l’aiguille A à une seringue tuberculine de 1 mL. REMARQUE : Pour ce tube en polyéthylène, 1,6 cm de liquide dans le tube correspond à 1 μL20.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer un mélange kétamine/xylazine 10:1 (10 mg/mL de kétamine et 1 mg/mL de xylazine) dans le chlorure de sodium salin (bactériostatique 0,9 % [w/v]. Préparez la solution fraîchement avant utilisation.</li>
</ol>2. Préparation de l’animal pour la chirurgie
REMARQUE : Utilisez des souris âgées de 6 à 10 semaines. Les souris femelles et mâles peuvent être utilisées. Dans cette étude, des souris femelles C57BL/6 âgées de 6 à 10 semaines ont été utilisées. Cette méthode peut être adaptée à d’autres souches de souris.
<ol><li>Anesthésier la souris en injectant 250 μL du mélange kétamine/xylazine intraperitoneally. Attendez que la souris soit complètement endormie. Assurez-vous que la souris ne réagit pas à une pincement d’un outeil pour détecter l’anesthésie complète.</li>
	<li>Raser la fourrure autour des jambes avec des tondeuses à cheveux.</li>
	<li>Appliquer la crème depilatory autour de la jambe et attendre 5 min. Essuyez la fourrure résiduelle et la crème depilatory à l’aide d’un tissu humide et nettoyez la jambe avec de l’eau stérile. Vaporiser 70% d’éthanol autour de la jambe pour stériliser la zone d’opération. L’éthanol est limité au site d’incision.</li>
</ol>3. Suturing chirurgical des vaisseaux lymphatiques afferents
REMARQUE: La jambe droite est sutured, et la jambe gauche est utilisée comme le contrôle factice. Le protocole de suture lymphatique (étapes 3.1−3.8) prend 20−30 min.
<ol><li>Gardez la souris à une position couchée et fixez-la avec du ruban chirurgical pour exposer la zone d’opération sur la jambe droite.</li>
	<li>Injecter intradermally 5 μL de 1% Evans colorant bleu ou 9 cm du fluide de l’appareil d’injection tube dans le footpad. Masser doucement le pavé pour aider Evans blue à pénétrer dans les vaisseaux lymphatiques. REMARQUE : La seringue à insuline n’est pas facile à contrôler pour l’injection en petit volume. Le volume peut être contrôlé avec plus de précision à l’aide de l’appareil d’injection. Les vaisseaux lymphatiques sont visualisés par colorant bleu sous la peau. Avec une formation approfondie, les deux vaisseaux lymphatiques afferents peuvent être vus à l’œil nu comme des vaisseaux transparents dans le tissu adipeux, parallèlement à l’artère saphenous. Avec une formation approfondie, il est possible de suturer les vaisseaux sans injecter evans colorant bleu dans les cas où il ya des préoccupations de perturbations potentielles de la teinture.</li>
	<li>Sous un microscope disséquant, choisissez un emplacement d’incision de 5 mm à partir du bord inférieur de la fossa popliteal. Faire une petite incision (~5 mm) dans la peau avec des ciseaux. À l’aide de forceps d’opération fine, étirer l’incision, et exposer les vaisseaux lymphatiques de collecte (Figure 1A). REMARQUE : Si nécessaire, un petit fragment de peau peut être enlevé pour exposer les vaisseaux lymphatiques.</li>
	<li>Identifier les deux vaisseaux lymphatiques afferents menant aux PLN sous le microscope disséquant (Figure 1B). REMARQUE : Il y a deux vaisseaux lymphatiques afferents du footpad au pLN. Les deux doivent être sutured pour bloquer le flux lymphatique complètement.</li>
	<li>À l’aide d’un porte-aiguille, insérez prudemment l’aiguille de suture (0,7 métrique ou plus petite) entre le vaisseau lymphatique afferent et l’artère saphénienne et tirez l’aiguille doucement autour du vaisseau lymphatique afferent. Tirez doucement la corde de suture et laissez environ 2 cm de la corde de suture derrière. Utilisez le porte-aiguille pour aider à attacher la corde étroitement pour suturer un vaisseau lymphatique avec le nœud d’un chirurgien (figure 1C). REMARQUE : Le tissu sous l’incision peut se dessécher avec une exposition prolongée à l’air. Faire l’incision aussi petite que possible et effectuer la suture rapidement (c.-à-d., dans les 5 minutes) empêchera le tissu de sécher. Maintenir l’humidité des tissus en appliquant un petit volume de solution saline à l’moyen d’un coton-tige.</li>
	<li>Masser doucement le pavé pour s’assurer qu’aucun colorant Evans Blue ne passe devant le site de suture, puis coupez l’excédent de ficelle avec des ciseaux.</li>
	<li>Effectuez les mêmes étapes de suture (c.-à-d. les étapes 3.5 et 3.6) sur l’autre vaisseau lymphatique afferent(figure 1D). Fermez l’incision cutanée avec la même suture qui a été utilisée pour suturer les vaisseaux à l’étape 3.5 (Figure 1E).</li>
	<li>Pour le contrôle factice, injecter intradermally 5 μL de 1% Evans colorant bleu au pied gauche et masser le footpad pour visualiser les vaisseaux lymphatiques. Ouvrez la peau avec une excision, puis fermez la plaie sans suturer le navire (Figure 1F).</li>
	<li>En option, surveillez les souris opérées pendant 2−4 h. Le côté suture de la jambe devrait montrer l’oedème avec Evans Blue écarté à la cuisse, tandis que la jambe de commande montrera le colorant bleu d’Evans limité dans le footpad. Si les souris se réveillent, un mélange supplémentaire de kétamine/xylazine sera injecté pour rester anesthésié jusqu’à l’euthanasie.</li>
</ol>4. Suivi du flux lymphatique
<ol><li>Immédiatement après la chirurgie, injectez intradermally 10 μL de 2% d’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) dans le pied du contrôle et de la jambe sutured lymphatique.</li>
	<li>Euthanasier les souris avec 400 μL de mélange kétamine/xylazine et effectuer la dislocation cervicale lorsque les souris sont entièrement anesthésiés.</li>
	<li>Recueillir les pLN de la fossa popliteal et retirer soigneusement le tissu adipeux périodal autour des pLN sous le microscope de dissection à 2, 6 et 12 h après l’injection de FITC.</li>
	<li>Intégrer les pLN avec la zone des sinus médullaires face au côté du cryomold dans le composé de température de coupe optimale (OCT) composé (Figure 1G,H).</li>
	<li>Préparer 20 sections congelées de μm à l’aide d’un cryotome.</li>
	<li>Imagez les cryosections sous un microscope confocal pour déterminer la distribution du FITC.</li>
</ol>

<ol><li>Pflicke, H., Sixt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preformed+portals+facilitate+dendritic+cell+entry+into+afferent+lymphatic+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Preformed portals facilitate dendritic cell entry into afferent lymphatic vessels.</a> The Journal of Experimental Medicine. 206, 2925-2935 (2009).</li>
<li>Schmid-Schonbein, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microlymphatics+and+lymph+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Microlymphatics and lymph flow.</a> Physiological Reviews. 70, 987-1028 (1990).</li>
<li>Skalak, T. C., Schmid-Schonbein, G. W., Zweifach, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+morphological+evidence+for+a+mechanism+of+lymph+formation+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">New morphological evidence for a mechanism of lymph formation in skeletal muscle.</a> Microvascular Research. 28, 95-112 (1984).</li>
<li>Johnston, M. G., Hay, J. B., Movat, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+prostaglandin+production+in+various+inflammatory+lesions%2C+measured+in+draining+lymph%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Kinetics of prostaglandin production in various inflammatory lesions, measured in draining lymph.</a> The American Journal of Pathology. 95, 225-238 (1979).</li>
<li>Eisenhoffer, J., Yuan, Z. Y., Johnston, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+the+L-arginine+pathway+plays+a+role+in+the+regulation+of+pumping+activity+in+bovine+mesenteric+lymphatic+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Evidence that the L-arginine pathway plays a role in the regulation of pumping activity in bovine mesenteric lymphatic vessels.</a> Microvascular Research. 50, 249-259 (1995).</li>
<li>Gasheva, O. Y., Zawieja, D. C., Gashev, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contraction-initiated+NO-dependent+lymphatic+relaxation%3A+a+self-regulatory+mechanism+in+rat+thoracic+duct%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Contraction-initiated NO-dependent lymphatic relaxation: a self-regulatory mechanism in rat thoracic duct.</a> Journal of Physiology. 575, 821-832 (2006).</li>
<li>Breslin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor-C+stimulates+the+lymphatic+pump+by+a+VEGF+receptor-3-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor-C stimulates the lymphatic pump by a VEGF receptor-3-dependent mechanism.</a> American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 293, 709-718 (2007).</li>
<li>Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic-cell+trafficking+to+lymph+nodes+through+lymphatic+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels.</a> Nature Reviews. Immunology. 5, 617-628 (2005).</li>
<li>Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-159 (2004).</li>
<li>Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+and+antigen+dispersal+landscapes+regulate+T+cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity.</a> The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).</li>
<li>Kastenmuller, W., Torabi-Parizi, P., Subramanian, N., Lammermann, T., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spatially-organized+multicellular+innate+immune+response+in+lymph+nodes+limits+systemic+pathogen+spread%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A spatially-organized multicellular innate immune response in lymph nodes limits systemic pathogen spread.</a> Cell. 150, 1235-1248 (2012).</li>
<li>Gerner, M. Y., Torabi-Parizi, P., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategically+localized+dendritic+cells+promote+rapid+T+cell+responses+to+lymph-borne+particulate+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Strategically localized dendritic cells promote rapid T cell responses to lymph-borne particulate antigens.</a> Immunity. 42, 172-185 (2015).</li>
<li>Moussion, C., Girard, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+control+lymphocyte+entry+to+lymph+nodes+through+high+endothelial+venules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells control lymphocyte entry to lymph nodes through high endothelial venules.</a> Nature. 479, 542-546 (2011).</li>
<li>Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph-borne+chemokines+and+other+low+molecular+weight+molecules+reach+high+endothelial+venules+via+specialized+conduits+while+a+functional+barrier+limits+access+to+the+lymphocyte+microenvironments+in+lymph+node+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex.</a> The Journal of Experimental Medicine. 192, 1425-1440 (2000).</li>
<li>Mebius, R. E., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+high+endothelial+venules+in+mouse+lymph+nodes+stimulated+by+oxazolone%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">The function of high endothelial venules in mouse lymph nodes stimulated by oxazolone.</a> Immunology. 71, 423-427 (1990).</li>
<li>Mebius, R. E., Streeter, P. R., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+afferent+lymphatic+vessel+interruption+on+vascular+addressin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The influence of afferent lymphatic vessel interruption on vascular addressin expression.</a> Journal of Cell Biology. 115, 85-95 (1991).</li>
<li>Mebius, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+GlyCAM-1%2C+an+endothelial+ligand+for+L-selectin%2C+is+affected+by+afferent+lymphatic+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Expression of GlyCAM-1, an endothelial ligand for L-selectin, is affected by afferent lymphatic flow.</a> Journal of Immunology. 151, 6769-6776 (1993).</li>
<li>Drayton, D. L., Liao, S., Mounzer, R. H., Ruddle, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoid+organ+development%3A+from+ontogeny+to+neogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Lymphoid organ development: from ontogeny to neogenesis.</a> Nature Immunology. 7, 344-353 (2006).</li>
<li>Tomei, A. A., Siegert, S., Britschgi, M. R., Luther, S. A., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+flow+regulates+stromal+cell+organization+and+CCL21+expression+in+a+tissue-engineered+lymph+node+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Fluid flow regulates stromal cell organization and CCL21 expression in a tissue-engineered lymph node microenvironment.</a> Journal of Immunology. 183, 4273-4283 (2009).</li>
<li>Liao, S., Jones, D., Cheng, G., Padera, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+quantitative+measurement+of+collecting+lymphatic+vessel+contraction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Methods%22%5BJournal%5D)">Method for the quantitative measurement of collecting lymphatic vessel contraction in mice.</a> Journal of Biological Methods. 1, 6(2014).</li>
<li>Lin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perinodal+Adipose+Tissue+Participates+in+Immune+Protection+through+a+Lymphatic+Vessel-Independent+Route%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Perinodal Adipose Tissue Participates in Immune Protection through a Lymphatic Vessel-Independent Route.</a> Journal of Immunology. 201, 296-305 (2018).</li>
<li>Gardenier, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diphtheria+toxin-mediated+ablation+of+lymphatic+endothelial+cells+results+in+progressive+lymphedema%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation+Insight%22%5BJournal%5D)">Diphtheria toxin-mediated ablation of lymphatic endothelial cells results in progressive lymphedema.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 1, 84095(2016).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Le blocage du flux lymphatique aura de larges applications dans la manipulation de l’administration d’antigènes au LN dans des conditions saines et maladies. Il est possible d’utiliser cette méthode pour contrôler le moment de l’administration d’antigènes afin d’étudier comment le flux lymphatique continu régule la réponse immunitaire dans l’évacuation des LN. Cette méthode d’interruption du flux lymphatique peut également être utilisée pour étudier comment la lymphe influe sur la compartimentation cellulaire, l’activati...

L’organisation spatiale du système lymphatique fournit un soutien structurel et fonctionnel pour éliminer efficacement le liquide extracellulaire et transporter les antigènes et les cellules présentant des antigènes (APC) vers les LN drainants. Les vaisseaux lymphatiques initiaux (également appelés capillaires lymphatiques) sont hautement perméables en raison de leurs jonctions intercellulaires discontinues, qui facilitent la collecte efficace des fluides, des cellules et d’autres matériaux des espaces extracellulairesenvironnants 1. Les vaisseaux lymphatiques initiaux fusionnent dans la collecte des vaisseaux lymphatiques, qui ont des jonctions intercellulaires serrées, une membrane continue de sous-sol, et la couverture lymphatique de muscle. La collecte des vaisseaux lymphatiques sont responsables du transport de la lymphe recueillie vers les LN drainants et, éventuellement, le retour de la lymphe à la circulation2,3. Les vaisseaux lymphatiques de collecte qui propulsent la lymphe dans le LN drainant sont les vaisseaux lymphatiques afferents4,5,6,7. L’obstruction des vaisseaux lymphatiques afferents peut bloquer le flux lymphatique dans les LNs, qui est une technique utile lors de l’étude de la fonction du flux lymphatique.
Des études antérieures ont montré que le flux lymphatique joue un rôle important dans le transport des antigènes et des APC, ainsi que dans le maintien de l’homéostasie du LN. Il est bien entendu que les APC dérivés des tissus, généralement activés cellules dendritiques migration (CD), voyagent à travers les vaisseaux lymphatiques afferents vers le LN pour activer les lymphocytes T8. L’idée que les antigènes de forme libre, tels que les microbes ou les antigènes solubles, s’écoulent passivement avec la lymphe vers le LN pour activer les APC résidents de LN a gagné l’acceptation au cours dela dernière décennie 9,10,11,12. Les antigènes de forme libre voyageant avec la lymphe prennent quelques minutes après l’infection pour se rendre au LN, et l’activation cellulaire ln-résidente peut se produire dans les 20 minutes après la stimulation. C’est beaucoup plus rapide que l’activation des CD migrateurs, qui prend plus de 8 h pour entrer dans le LN9 drainant. En plus de transporter des antigènes pour initier la protection immunitaire, la lymphe transporte également des cytokines et des DCs au LN pour maintenir son microenvironnement, et pour soutenir l’homéostasie de cellulesimmunitaires 13,14. Auparavant, le blocage du flux lymphatique en suturant les vaisseaux lymphatiques afferents a démontré que la lymphe est nécessaire pour maintenir le phénotype HEV nécessaire pour soutenir la cellule T homéostatique et la cellule B homing à la LN15,16,17. CCL21 est une chimiokine critique qui dirige le positionnement des cellules DC et T dans le LN8,18. Le blocage du flux lymphatique interrompt l’expression du CCL21 dans le LN et interrompt potentiellement le positionnement et/ou l’interaction des cellules DC et T dans le LN19. Ainsi, le blocage du flux lymphatique peut abroger directement ou indirectement l’accès à l’antigène/DC au LN drainant en perturbant le microenvironnement LN qui régule les réponses immunitaires dans le LN. Pour mieux étudier la fonction du flux lymphatique, un protocole expérimental est présenté (figure 1) pour bloquer le flux lymphatique chez la souris en suturant les vaisseaux lymphatiques afferents du pied au pLN. Cette méthode peut être une technique importante pour de futures études sur la fonction lymphatique dans des conditions saines et maladies.

<table><tbody><tr><td>Chlorure de sodium < > 0,9 % solution saline </> forte</td> <td>Baxter</td><td>JB1323</td><td></td></tr> <tr><td>< forte>100 % éthanol</forte></td> <td>Greenfield Global</td><td></td><td>University of Calgary services de distribution UN1170.</td></tr><tr><td><forte>Crème dépilatoire</forte></td><td>Nair</td><td></td><td>Nair Sensitive Formula Épilation Cr&egrave ; moi avec de l’huile d’amande douce et de l’huile pour bébé, 200 ml. Ou un produit similaire.</td></tr><tr><td><colorant bleu Evans >fort</td><td>Sigma Life Science</td><td>E2129-10G</td><td>Pour 1 ml de colorant bleu Evans, ajoutez 0,1 g de bleu Evans à 10 ml de PBS. La solution Evens Blue sera filtrée à travers des filtres de 0,22 mm et maintenue stérile dans des aliquotes de 1 ml.</td></tr><tr><td>Fluorescein isothiocyanate isomere I (FITC)</td><td>Sigma Life Science</td><td>F7250-1G</td><td></td></tr><tr><td>Forceps Dumont #3</td><td>WPI</td><td>500337</td><td></td></tr><tr><td>Forceps Dumont #5</td><td>WPI</td><td>500233</td><td></td></tr><tr><td>Appareil d’injection</td><td></td><td></td><td>Connectez une extrémité du tube en polyéthylène à 30G & fois ; &frac12 ; aiguille. Fixez une seringue de tuberculose de 1 ml à l’aiguille. Déloger la tige de l’aiguille d’un autre 30G & fois ; &frac12 ; aiguille. Insérez l’extrémité émoussée du 30G & times ; &frac12 ; l’arbre de l’aiguille dans l’autre extrémité du tube. Le diamètre intérieur de ce tube est de 0,28 mm. Ainsi, 1,6 cm de liquide dans le tube est 1 &mu ;l.</td></tr><tr><td><fort>Seringue à insuline</td><td>Becton Dickinson and Company (BD)</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>IRIS Forcep straight</td><td>WPI</td><td>15914</td><td></td></tr><tr><td>IRIS scissors</td><td>WPI</td><td>14218-G</td><td></td></tr><tr><td>Kétamine</td><td>Narketan</td><td>DIN 02374994</td><td>Les fournisseurs de kétamine et de xylazine sont généralement soumis à une réglementation institutionnelle et gouvernementale.</td></tr><tr><td>Needles (26Gx3/8)</td><td>Becton Dickinson and Company (BD)</td><td>305110</td><td></td></tr><tr><td>Needles (30Gx1/2)</td><td>Becton Dickinson and Company (BD)</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Paton Needle Holder</td><td>ROBOZ</td><td>RS6403</td><td>Straight, Without Lock ; Dentelé</td></tr><tr><td><fort>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</fort></td><td>Sigma Life Science</td><td>P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>Tube en polyéthylène</td><td>Becton Dickinson and Company (BD)</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>Ruban chirurgical (1.25cmx9.1m )</td><td>Transpore</td><td>1527-0</td><td></td></tr><tr><td>Ruban chirurgical (2.5cmx9.1m )</td><td>Transpore</td><td>1527-1</td><td></td></tr><tr><td>Suture</td><td>Davis and Geck CYANAMID Canada</td><td>11/04</td><td>0.7 métrique monofilament polypropylène</td></tr><tr><td>seringue (1ml)</td><td>Becton Dickinson and Company (BD)</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>VANNAS scissors</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>14122-G</td><td></td></tr><tr><td><forte>Xylazine</forte></td><td>Rompun</td><td>DIN02169606</td><td>Les fournisseurs de kétamine et de xylazine sont généralement soumis à une réglementation institutionnelle et gouvernementale.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fort>Équipement</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fort>Microscope à dissection</fort></td><td>Olympus</td><td></td><td>Olympus S261 (522-STS OH141791) avec source lumineuse : Olympus Highlight 3100</td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Leica</td><td></td><td>SP8</td></tr></tbody></table>

blocage du flux lymphatique par suturing vaisseaux lymphatiques afferent chez la souris

Blocking Lymph Flow by Suturing Afferent Lymphatic Vessels in Mice

Les vaisseaux lymphatiques sont essentiels au maintien de l’équilibre des fluides tissulaires et à l’optimisation de la protection immunitaire en transportant des antigènes, des cytokines et des cellules vers les ganglions lymphatiques drainants (LN). L’interruption du flux lymphatique est une méthode importante lors de l’étude de la fonction des vaisseaux lymphatiques. Les vaisseaux lymphatiques afferents du pied murin aux ganglions lymphatiques popliteal (pLNs) sont bien définis comme les seules voies pour le drainage lymphatique dans les pLN. Le suturing ces vaisseaux lymphatiques afferents peut sélectivement empêcher le flux lymphatique aux pLNs. Cette méthode permet d’interférer dans le flux lymphatique avec des dommages minimes aux cellules endothéliales lymphatiques dans le pLN drainant, les vaisseaux lymphatiques afferents, ainsi que d’autres vaisseaux lymphatiques autour de la région. Cette méthode a été utilisée pour étudier comment la lymphe affecte les venules endothéliales élevées (HEV) et l’expression de chimiokine dans le LN, et comment la lymphe coule par le tissu adipeux entourant le LN en l’absence des vaisseaux lymphatiques fonctionnels. Avec la reconnaissance croissante de l’importance de la fonction lymphatique, cette méthode aura des applications plus larges pour démêler davantage la fonction des vaisseaux lymphatiques dans la régulation du microenvironnement LN et des réponses immunitaires.

Suture des vaisseaux lymphatiques a été utilisé dans les étudesprécédentes 15,16,17,19, où il a servi d’outil important pour étudier la fonction du flux lymphatique avant la biologie moléculaire des vaisseaux lymphatiques a été mieux compris. Le blocage du flux lymphatique interrompt l’homéostasie LN, ce qui conduit à hevs perdre l’expression génétique critique nécessaire pour homing lymphocyte...

Un protocole pour bloquer le flux lymphatique par suturing chirurgical des vaisseaux lymphatiques afferents est présenté.

Blocage du flux lymphatique par suturing vaisseaux lymphatiques afferent chez la souris

Lymphatic vessels are critical in maintaining tissue fluid balance and optimizing immune protection by transporting antigens, cytokines, and cells to ...

Cette méthode interrompt le flux lymphatique avec un minimum de dommages aux cellules endothéliales lymphatiques, et avec un contrôle précis du moment du blocus, il peut être utilisé pour étudier comment le flux lymphatique affecte l’homéostasie et les réponses immunitaires dans le ganglion lymphatique. Jingna Xue, étudiante diplômée de mon laboratoire, aidera à démontrer la procédure. Pour préparer un appareil d’injection, couper environ 30 centimètres de tube de polyéthylène.Connectez la pointe de l’aiguille A à une extrémité du tube. Déloger soigneusement une autre aiguille et relier le côté cassé à l’autre extrémité du tube de polyéthylène. Fixez ensuite l’aiguille A à une seringue à tuberculine d’un millilitre.Immédiatement avant l’utilisation, préparer un mélange kétamine-xylazine 10:1 en solution saline. Après anesthésier la souris en injectant 250 microlitres du mélange kétamine/xylazine intraperitoneally, assurer l’anesthésie complète avec une pincée d’orteil. Raser la fourrure autour des jambes avec des tondeuses à cheveux, puis appliquer de la crème depilatory autour de la jambe.Après cinq minutes, essuyer la fourrure résiduelle et la crème depilatory à l’aide d’un tissu humide, puis nettoyer la jambe avec de l’eau stérile. Vaporiser 70% d’éthanol autour de la jambe pour stériliser la zone d’opération. Placez la souris dans une position couchée, et utilisez du ruban chirurgical pour exposer la zone d’opération sur la jambe droite.Intradermally injecter cinq microlitres de 1%Evans colorant bleu, ou neuf centimètres du fluide de l’appareil d’injection tube dans le coussin du pied droit de la souris. Masser doucement le pavé pour aider le fluide à pénétrer dans les vaisseaux lymphatiques. Sous un microscope disséquant, localiser un site d’incision à cinq millimètres du bord inférieur de la fossa popliteal.À l’aide d’une paire de ciseaux, faire une petite incision d’environ cinq millimètres de longueur. Ensuite, utilisez des forceps d’opération fine pour étirer l’incision et exposer les vaisseaux lymphatiques de collecte. Identifier les deux vaisseaux lymphatiques afferents menant aux ganglions lymphatiques popliteal.À l’aide d’un porte-aiguille, insérez prudemment l’aiguille de suture entre les vaisseaux lymphatiques afferents et l’artère saphenous. Tirez doucement l’aiguille autour des vaisseaux lymphatiques afferents. Tirez soigneusement la corde de suture, en laissant environ deux centimètres de la corde de suture derrière.Utilisez le porte-aiguille pour aider à attacher le nœud d’un chirurgien. Masser doucement le coussin pour les pieds pour s’assurer qu’aucun colorant bleu Evans ne passe devant le site de suture, puis coupez l’excédent de ficelle avec des ciseaux. Suture les autres vaisseaux lymphatiques afferents, puis fermer l’incision cutanée avec la même suture qui a été utilisé pour les vaisseaux lymphatiques.Pour le contrôle factice, intradermally injecter cinq microlitres de 1%Evans colorant bleu dans le coussin du pied gauche, et masser le coussin pour les pieds. Ouvrez la peau avec une incision, puis fermez la plaie sans suturing le navire. Lors de la surveillance de la souris après la chirurgie, la jambe droite devrait montrer l’oedème, avec evans colorant bleu s’étendant à la cuisse, tandis que la jambe de contrôle montrera Evans colorant bleu limité à la garniture du pied.Immédiatement après la chirurgie, injectez intradermally 10 microlitres de 2%FITC dans le coussin droit de pied et la gauche. Deux, six et 12 heures après l’injection de FITC, recueillent les ganglions lymphatiques popliteal des fossa des souris euthanasiées. Retirez soigneusement le tissu adipeux périodal autour des pLN.Intégrer les pLN dans le composé optimal de température de coupe avec la zone médullaire de sinus faisant face au côté du moule de cryo. Utilisez un cryotome pour préparer des sections congelées de 20 microns. Pour déterminer la distribution du FITC dans les pLN, imagez les cryo-sections sous un microscope confocal.Les images confocales capturées deux, six et 12 heures après injection de FITC montrent l’accumulation sensiblement réduite de FITC dans les ganglions lymphatiques popliteal après avoir suturing les vaisseaux lymphatiques afferents. Le FITC résiduel dans les pLNs a été préférentiellement accumulé dans les sinus de ganglion lymphatique. Les images confocales du tissu adipeux périodal montrent quand les vaisseaux lymphatiques sont bloqués par suturing, FITC entre dans le tissu quand les sinus de ganglion lymphatique, mais il n’est pas efficacement distribué dans les ganglions lymphatiques.Lorsque vous essayez cette méthode, il est important de se rappeler que l’insertion de l’aiguille de suture entre le vaisseau sanguin et le vaisseau lymphatique est essentielle. La défaillance de cette étape peut briser les navires. Après avoir effectué cette méthode, il est possible d’immuniser les souris atteintes d’une infection ou d’une autre stimulation immunitaire pour étudier comment le flux lymphatique régule la protection immunitaire.La fonction du flux lymphatique n’est pas bien comprise. Cette méthode peut être utilisée pour étudier les migrations cellulaires dans le ganglion lymphatique en l’absence de flux lymphatique.

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