Différenciation neuronale des cellules souches embryonnaires de souris in vitro

La différenciation neuronale à partir d’essais chez la souris est un excellent modèle pour illustrer les mécanismes clés impliqués dans la neurogenèse. Nous faisons la démonstration d’une méthode optimisée pour la neurogenèse embryoïde à l’aide d’une stratégie de dépistage toro de l’entreprise. Cette technique présente les avantages d’un rendement élevé, d’un faible coût et d’une utilisation facile, et convient à la vulgarisation parmi les laboratoires.

Il s’agit d’un outil puissant pour la recherche en neurosciences. Pour effectuer la différenciation à l’aide du protocole un, ensemencez 20 000 cellules souches embryoïdes de souris dans deux millilitres de milieu de différenciation basal dans chaque puits d’une plaque à six puits recouverte de gélatine à 0,1 %. Après la fixation des cellules, lavez les cellules avec deux millilitres de PBS et ajoutez deux millilitres de milieu de différenciation basale dans chaque puits, puis remettez les cellules dans l’incubateur.

Laissez les cellules se différencier pendant huit jours, en remplaçant le milieu tous les deux jours. Pour réaliser le protocole deux, ajoutez 1,5 million de cellules souches embryoïdes de souris dans une boîte bactérienne non adhésive dans 10 millilitres de milieu de différenciation basale et incubez la plaque à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pour permettre la formation du corps embryoïde. Après deux jours, transférez les agrégats de cellules dans des tubes à centrifuger de 15 millilitres et laissez-les se déposer par gravité.

Retirez le surnageant et ajoutez 10 millilitres de milieu de différenciation basal frais pour remettre en suspension les corps embryoïdes. Ensuite, replantez-les dans un nouveau plat non adhésif et incubez-les pendant deux jours supplémentaires. Recueillir et ensemencer environ 50 corps embryoïdes dans deux millilitres de milieu de différenciation basale par puits sur une plaque à six puits recouverte de gélatine.

Pour l’induction de l’acide rétinoïque, ajoutez deux microlitres de stock de RA dans chaque puits jusqu’à une concentration finale d’une micromolaire. Remettez la plaque dans l’incubateur et différenciez les cellules pendant quatre jours supplémentaires. Pour effectuer la différenciation à l’aide du protocole trois, répétez le protocole deux mais n’attendez que deux jours pour la formation du corps embryonnaire et six jours pour l’induction de la PR.

Le contrôle de la qualité de la formation des corps embryoïdes doit être effectué à l’aide de la microscopie. Seuls ceux qui ont des noyaux brillants peuvent se différencier avec succès dans le processus ultérieur. Pour le protocole quatre, ensemencez 20 000 cellules souches embryonnaires de souris par puits dans les plaques enrobées de gélatine et suivez le protocole un.

Après avoir laissé les cellules se différencier pendant quatre jours, ajoutez deux microlitres de tout le stock de trans RA dans chaque puits et incubez la plaque pendant quatre jours supplémentaires. Pour effectuer le protocole cinq, répétez le protocole quatre, mais commencez l’induction de la PR après seulement deux jours de différenciation. Pour le protocole six, plantez 1,5 million de cellules souches dans une boîte bactérienne non adhésive dans 10 millilitres de milieu N2B27 deux et incubez la plaque à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pour permettre la formation de corps embryoïdes.

Après deux jours, collectez les agrégats cellulaires comme décrit précédemment et remettez en suspension les corps embryoïdes avec 10 millilitres de N2B27 frais milieu deux. Replantez-les dans un nouveau plat bactérien non adhésif et laissez la différenciation pendant encore deux jours. Le quatrième jour, collectez et ensemencez environ 50 corps embryoïdes par puits sur des plaques à six puits recouvertes de gélatine avec deux millilitres de N2B27 moyen deux.

Ajoutez deux microlitres de tout le stock trans RA dans chaque puits et induisez la différenciation pendant quatre jours supplémentaires. Pour réaliser le protocole sept, ensemencez environ 20 000 cellules dans deux millilitres de milieu de différenciation basale par puits sur les plaques recouvertes de gélatine. Après la fixation des cellules et deux lavages avec du PBS, ajoutez deux millilitres de milieu N2B7, deux dans chaque puits et laissez les cellules se différencier pendant huit jours à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Après avoir effectué la différenciation de la première phase à l’aide du protocole trois, ensemencez environ 500 000 dérivés de cellules souches embryonnaires de souris dans deux millilitres de milieu de différenciation basale par puits sur les plaques recouvertes de gélatine à 0,1 %. Divisez au hasard les dérivés en trois groupes afin de tester des protocoles de différenciation en trois phases deux. Incuber la plaque pendant six heures, puis laver les cellules deux fois avec deux millilitres de PBS et ajouter deux millilitres de milieu de différenciation basale N2B27 milieu un ou N2B27 milieu deux à chaque puits, selon le protocole.

Placez les lames dans l’incubateur et laissez les cellules se différencier pendant encore 10 jours, en changeant le milieu correspondant tous les deux jours. Sept protocoles ont été testés afin de déterminer le protocole optimal pour la différenciation des cellules souches embryonnaires de souris en cellules précurseurs générales ou NPC. Les protocoles ont été testés sur des serrures A2lox et 129 cellules et l’état de différenciation de chaque groupe a été suivi à l’aide d’un microscope optique.

La plupart des dérivés d’A2lox et de 129 ont montré des morphologies bien empilées et de type neurite sous le protocole trois, indiquant la formation de NPC. Cependant, les cellules différenciées à l’aide du protocole deux semblaient apoptotiques, ce qui peut être dû au manque de nutriments dans les corps embryoïdes. Pour confirmer davantage la formation de NPC, des cellules positives à la néstine ont été détectées à l’aide d’un test d’immunofluorescence.

Le protocole trois a abouti au pourcentage le plus élevé de cellules positives à la nestine, atteignant respectivement 78 et 69 % dans les dérivés A2lox et 129. Trois protocoles ont été testés pour la différenciation des NPC en neurones. Il a été déterminé que le protocole trois induit le plus efficacement la différenciation.

La plupart des dérivés A2lox et 129 de la phase deux du protocole trois avaient des structures neuronales prolongées avec des neurites clairs et des extensions du corps cellulaire. Les tests d’immunofluorescence ont en outre confirmé la génération de neurones avec le pourcentage de cellules positives à la bêta-tubuline trois jusqu’à 68 et 59 % dans les dérivés A2lox et 129 respectivement, en utilisant le protocole trois. Lors de cette procédure, il est important de s’assurer que les tests chez la souris sont sains et non différenciés avant la différenciation.

De plus, un contrôle de qualité strict doit être effectué après la formation dans les corps d’alésage et avant la différenciation de la deuxième phase. Cette technique fournit un modèle standard pour les chercheurs en neurobiologie et en biologie du développement et devrait être un outil puissant pour illustrer les mécanismes clés impliqués dans la neurogenèse.