Évaluation de l’oxydation cellulaire à l’aide d’une protéine fluorescente verte rougeox-sensible spécifique à compartiment subcellulaire

Évaluateurs actuels du protocole dans le textile, l’état redox change d’une manière intracellulaire compartiment spécifique. Notre protocole permet une meilleure compréhension et un meilleur suivi de tous les mécanismes physiologiques ou pathophysiologiques du stress oxydatif. Cette technique permet la quantification non perturbatrice du rapport carrelé de sulfure d’oeil dans les cellules intactes utilisant une sortie métrique de rapport pour contrebalancer les différences entre les niveaux d’expression de signal, le blanchiment de photo, et les sensibilités de détection.

Ce protocole peut être appliqué à divers organismes, y compris les bactéries dans les plantes. Le premier jour de l’expérience traiter les cellules à partir d’une lignée confluente cellule du cancer du sein pendant deux minutes, avec deux millilitres de 0,2, 5% voyages en EDTA. Lorsque les cellules commencent à détacher arrêter la réaction avec six millilitres de milieu complet et de sédiments les cellules par centrifugation.

Suspendre à nouveau la pastille en cinq millilitres de milieu frais et complet, compter les cellules et les diluer à 1,5 fois 10 à la cinquième cellule par millilitre de milieu complet. Puis graine 1,5 fois 10 à la cinquième cellule par millilitre de cellules par puits dans une plaque de 6 puits, et incuber les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire pendant la nuit. Ou n’ajoutez pas de ligne virale transduction GFP.

Le lendemain matin, ajouter 12,5, 25 et 50 microlitres d’un à 100 dilué six fois 10 à la 10e plaque formant des unités par millilitre d’ajouter aucune solution GFP érodée virale, en milieu complet. Ajoutez cela aux puits appropriés ou à la plaque de 6 puits pour transduire les cellules avec 50, 100 et 200 multiplicités d’infection, respectivement. Lorsque tous les puits échantillonnés ont été transduced avec le virus, retourner les cellules à l’incubateur de culture cellulaire pendant 16 à 24 heures.

Le lendemain, visualisez les cellules par microscopie par fluorescence et remplacez le supernatant par un milieu, sans virus, pour permettre aux cellules de récupérer pendant 24 heures supplémentaires. Pour déterminer l’efficacité optimale de transduction, évaluez l’intensité et la morphologie de fluorescence des cellules par cytométrie d’écoulement. Assurez-vous d’effectuer toutes les procédures qui peuvent causer l’infection par des aérosols ou des éclaboussures dans un niveau de biosécurité deux armoires certifiées de sécurité biologique.

Pour évaluer l’état redox des cellules, le lendemain matin, incuber les cellules et les puits appropriés de la plaque de puits 6 avec 10 peroxyde d’hydrogène micromolaire pendant une heure, avant de détacher les cellules avec 750 microlitres de 0,2 5% gouttes en EDTA par puits, comme démontré. Arrêtez la réaction avec deux millilitres de milieu complet par puits et tirez les supernatants pour chaque condition dans des tubes coniques individuels de 15 millilitres. Sédimenter les cellules par centrifugation et laver les granulés dans 500 microlitres de PBS par puits par centrifugations deux fois.

Après le deuxième lavage, filtrer les suspensions cellulaires à travers des mailles de 40 micromètres dans des tubes compatibles de cytométrie d’écoulement sur la glace, à l’abri de la lumière. Dans le logiciel flow cytomètre, exécuter la multiplicité zéro de l’échantillon de contrôle des infections. Ensuite, analyser le peroxyde d’hydrogène et les cellules non traitées.

Il permettra de calcul du rapport moyen d’intensité fluorescente entre les formes oxydées par rapport aux formes réduites de GFP de ligne, en utilisant la formule comme indiqué. Voici la stratégie de gating pour sélectionner un grand nombre de cellules par cytométrie de flux est montrée. La cytométrie du débit peut également être utilisée pour déterminer la courbe de réponse à la dose pour l’analyse gfp rangée et la multiplicité la plus efficace de l’entrée d’infection.

Selon la multiplicité de l’infection, courbe de réponse de dose dans cette analyse représentative, une multiplicité de 200 d’infection a donné l’expression gfp de route la plus élevée, mais la morphologie cellulaire a été effectuée suggérant la cytotoxicité. Par conséquent, l’efficacité optimale de transduction a été déterminée pour être une multiplicité d’infection de 100. Dans cette analyse de l’état de redox, des intensités de fluorescence de la ligne oxydées et réduites ont été obtenues à partir de l’analyse de cytométrie de débit pour le véhicule et de quatre traitements positifs de peroxyde d’hydrogène de contrôle de 10 micromolaires.

Les histogrammes superposés représentent les changements dans le nombre de cellules dans les 10 micromolaires de peroxyde d’hydrogène et les groupes traités par véhicule ou réduits et oxydés éroder GFP. Le calcul du rapport entre le GFP oxydé et réduit pour cette analyse a indiqué que le peroxyde d’hydrogène de 10 micromolaires a causé une augmentation triple de l’oxydation de la ligne GFP comparée au traitement de véhicule. Avoir des numéros de cellules précis est important pour les calculs irm et la reproductibilité.

Afin d’obtenir des résultats reproductibles, les chercheurs devraient bien mélanger les solutions antivirales pour obtenir des suspensions homogènes. Ce protocole permet aux chercheurs d’étudier les changements rapides du redox en tant que partie intégrante de la vaste gamme de processus cellulaires normaux et de la progression de la maladie en temps réel.