Name: Isolement des noyaux de tissus adipeux pour applications génomiques unicellulaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Apprenez à isoler des noyaux uniques à partir d'adipocytes matures pour des analyses transcriptomiques unicellulaires de haute qualité. Cette méthode robuste minimise les agrégats nucléaires et les débris cellulaires.

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Nous tenons à remercier David Reynolds du noyau Albert Einstein Genomics et Jinghang Zhang du Flow Cytometry Core pour son soutien technique. Nous reconnaissons le soutien des National Institutes of Health (NIH) (DK110426) et des subventions pilotes et de faisabilité du Centre de recherche sur le diabète Einstein-Mount Sinai (DK020541) et du New York Obesity Research Center (DK026687) (tous à K.S.). Nous tenons également à remercier Albert Einstein Cancer Center (CA013330) pour le soutien de base.

Les soins et l’expérimentation des animaux ont été effectués selon les procédures approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Albert Einstein College of Medicine.
1. Préparation des tampons de digestion des tissus et de lyse
<ol><li>Préparer le tampon de digestion des tissus.<ol>
<li>Préparer ~1 mL de tampon de digestion pour chaque gramme de tissu adipeux.</li>
		<li>Peser 1,5 collagènease U/mL D et 2,4 U/mL dispase II et ajouter la solution saline tamponnée de phosphate (PBS).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer le tampon de préparation des noyaux (CNLC).<ol>
<li>Préparer 10 mM HEPES, 1,5 mM de chlorure de magnésium, 10 mM de chlorure de potassium, 250 mM de saccharose et 0,1 % de NP-40 dans de l’eau sans nucléase. Bien mélanger. Le saccharose peut prendre plus de temps à se dissoudre que les autres composants.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer une solution d’albumine de sérum bovin (BSA) à 0,5 %.<ol>
<li>Préparer 0,5 % de BSA en PBS contenant de l’EDTA. Il est recommandé d’utiliser la culture cellulaire filtrée stérile grade PBS (voir Tableau des matériaux).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Digestion enzymatique du tissu adipeux
<ol><li>Disséquer les souris pour extraire le tissu adipeux selon Aune et al.13. Recueillir des tissus isolés dans un plat contenant du PBS. Transférer le tissu dans un essuie-tout pour le sécher. Ensuite, placez le tissu dans un plat propre.</li>
	<li>Ajouter du chlorure de calcium au tampon de digestion à une concentration finale de 10 mM. Ajouter un petit volume de tampon de digestion au plat et hacher soigneusement le tissu adipeux. Le volume de tampon de digestion requis sera basé sur la quantité de tissu isolé. Habituellement ~ 1 mL ou moins est utilisé.</li>
	<li>Ajouter environ la moitié de la quantité de tampon de digestion préparée (p. ex., ~10 mL pour cinq souris) au tissu haché. À l’aide d’une pipette sérologique, transférer l’échantillon dans un tube conique de 50 mL. Ajouter toute quantité restante de tampon pour laver le plat et transférer dans le tube de 50 ml contenant l’échantillon. Pipette de haut en bas plusieurs fois. Incuber ensuite en secouant à 200-210 tr/min à 37 °C pendant 12-15 min.</li>
</ol>3. Isolement des adipocytes
<ol><li>Après incubation, ajoutez 0,5 % de BSA à un ratio de 1:1 à l’échantillon. Bien mélanger en faisant monter et descendre plusieurs fois. Centrifuge l’échantillon à 300 x g pendant 5 min à température ambiante (RT) pour faire tourner la fraction vasculaire stromale (SVF). La fraction d’adipocyte restera dans la couche supérieure de l’échantillon.</li>
	<li>Placez un filtre à cellules de 40 μm au-dessus d’un tube de centrifugeuse conique de 50 m L et filtrez l’échantillon, en recueillant la couche supérieure et en laissant derrière vous le SVF au fond du tube. Transférer la couche supérieure (fraction d’adipocyte) dans un nouveau tube en renversant le filtre à l’envers sur le tube et en utilisant 0,5% de BSA pour inverser le lavage du filtre et recueillir l’échantillon dans le tube.</li>
	<li>Porter le volume total de 0,5 % de BSA à 10-15 mL en fonction de la taille de l’échantillon et de la pipette de haut en bas avec une pipette sérologique ou secouer brièvement de haut en bas pour mélanger l’échantillon. Centrifuge de l’échantillon à nouveau à 300 x g pendant 5 min à RT.</li>
</ol>4. Isolement des noyaux
<ol><li>Utilisez une pointe de pipette à large forage et transférez soigneusement la couche supérieure de l’échantillon vers un filtre à cellules de 100 μm placé sur un nouveau tube préchilled sur la glace, laissant derrière vous tout SVF résiduel.</li>
	<li>Rincer/laver le filtre avec une quantité suffisante de CNLC et jeter le filtre. De ce pas en avant, ayez l’échantillon sur la glace aussi souvent que possible et travaillez rapidement pour éviter les noyaux qui fuient et/ou malsains. Il est utile de préchill tubes microcentrifuge à utiliser dans les prochaines étapes sur la glace.</li>
	<li>Placer l’échantillon sur la glace pendant pas plus de 2 min avec l’inversion douce intermittente du tube pour mélanger. Le temps d’incubation sur la glace doit être optimisé pour la taille de l’échantillon et le type d’adipocytes. Centrifugeuse à 1 000 x g à 4 °C pendant 10 min.</li>
	<li>Retirer le supernatant et resuspender le granulé dans 1 mL de la CNLC. Transférer l’échantillon dans un tube de microcentrifuge propre. Lors du transfert, évitez de toucher les parois du tube, qui contiennent des débris et des lipides. Ajouter l’inhibiteur de 0,6 RNase U/μL à l’échantillon et mélanger. Centrifugeuse à nouveau à 1000 x g à 4 °C pendant 10 min. REMARQUE : La vitesse et le temps de centrifugement devraient être diminués à cette étape pour les échantillons plus petits.</li>
	<li>Retirez le supernatant et resuspendez dans 1 mL de tampon de lavage de noyaux (2% BSA/PBS + 0.6 U/μL RNase inhibiteur).</li>
	<li>Double filtre dans un tube propre avec des filtres empilables de 30 μm. Lavez le filtre avec un petit volume (~300 μL) de tampon de lavage de noyaux. Alternativement, pour les échantillons plus petits, utilisez un filtre de 30 μm qui s’insère dans un tube de microcentrifuge et filtrez directement dedans.</li>
	<li>Confirmez l’isolement réussi des noyaux sains.<ol>
<li>Tacher un petit aliquot de l’échantillon avec trypan et utiliser un compteur cellulaire automatisé pour évaluer la taille morte moyenne et pour cent de cellules mortes. La taille morte moyenne d’un échantillon contenant principalement des noyaux devrait varier entre 7 et 10 μm. La taille des noyaux est habituellement d’environ 8 μm.</li>
		<li>Tacher un petit aliquot de l’échantillon avec DAPI et examiner au microscope avec un objectif 20x ou plus. La membrane nucléaire doit être intacte et les noyaux doivent être ronds.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Étape de nettoyage et de concentration des noyaux FACS
<ol><li>Passez immédiatement à l’étape facs pour nettoyer les noyaux et enlever tout débris excédentaire. La mémoire tampon de collecte doit contenir le tampon de lavage nuclei. Pendant le FACS, la mémoire tampon est diluée. Il est utile de préparer une concentration plus élevée d’inhibiteur de la BSA et de la RNase pour tenir compte de la dilution pendant le tri. Le bloc de collecte FACS doit être en mode de refroidissement.</li>
	<li>Après le tri des noyaux, la centrifugeuse à 500 x g pendant 5 min à 4 °C pour concentrer l’échantillon. Reconstituer dans un volume approprié de tampon de lavage des noyaux pour atteindre une concentration de 500 à 1 500 noyaux/μL. N’essayez pas d’enlever tous les supernatants. Cela entraînera la perte de noyaux.</li>
	<li>Utilisez un hémocytomètre et un aiquot taché DAPI pour un décompte final et pour visualiser les noyaux. Ensuite, procéder immédiatement avec snRNA-seq selon le protocole du fabricant.</li>
</ol>

<ol><li>Cypess, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+importance+of+brown+adipose+tissue+in+adult+humans%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1509-1517 (2009).</li>
<li>van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold-activated+brown+adipose+tissue+in+healthy+men%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cold-activated brown adipose tissue in healthy men.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1500-1508 (2009).</li>
<li>Virtanen, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+brown+adipose+tissue+in+healthy+adults%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Functional brown adipose tissue in healthy adults.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1518-1525 (2009).</li>
<li>Nedergaard, J., Bengtsson, T., Cannon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+evidence+for+active+brown+adipose+tissue+in+adult+humans%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Unexpected evidence for active brown adipose tissue in adult humans.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 293 (2), E444-E452 (2007).</li>
<li>Saito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+incidence+of+metabolically+active+brown+adipose+tissue+in+healthy+adult+humans%3A+effects+of+cold+exposure+and+adiposity%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity.</a> Diabetes. 58 (7), 1526-1531 (2009).</li>
<li>Yoneshiro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruited+brown+adipose+tissue+as+an+antiobesity+agent+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Recruited brown adipose tissue as an antiobesity agent in humans.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3404-3408 (2013).</li>
<li>Cypess, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+human+brown+adipose+tissue+by+a+%CE%B23-adrenergic+receptor+agonist%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Activation of human brown adipose tissue by a β3-adrenergic receptor agonist.</a> Cell Metabolism. 21 (1), 33-38 (2015).</li>
<li>Song, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-+and+high-thermogenic+brown+adipocyte+subpopulations+coexist+in+murine+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Low- and high-thermogenic brown adipocyte subpopulations coexist in murine adipose tissue.</a> The Journal of Clinical Investigation. 130 (1), 247-257 (2020).</li>
<li>Cinti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CL316%2C243+and+cold+stress+induce+heterogeneous+expression+of+UCP1+mRNA+and+protein+in+rodent+brown+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%3A+Official+Journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">CL316,243 and cold stress induce heterogeneous expression of UCP1 mRNA and protein in rodent brown adipocytes.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 50 (1), 21-31 (2002).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+stress+induces+glycolytic+beige+fat+formation+via+a+myogenic+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Thermal stress induces glycolytic beige fat formation via a myogenic state.</a> Nature. 565 (7738), 180-185 (2019).</li>
<li>Bakken, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+compared+in+matched+cortical+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types.</a> PloS One. 13 (12), e0209648(2018).</li>
<li>Roh, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Transcriptional+and+Epigenomic+Profiling+from+Specific+Cell+Types+within+Heterogeneous+Tissues+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Transcriptional and Epigenomic Profiling from Specific Cell Types within Heterogeneous Tissues In Vivo.</a> Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).</li>
<li>Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+differentiation+of+stromal+vascular+cells+to+beige%2Fbrite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50191(2013).</li>
<li>Zheng, G. X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+digital+transcriptional+profiling+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells.</a> Nature Communications. 8, 14049(2017).</li>
<li>Pollen, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-coverage+single-cell+mRNA+sequencing+reveals+cellular+heterogeneity+and+activated+signaling+pathways+in+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Low-coverage single-cell mRNA sequencing reveals cellular heterogeneity and activated signaling pathways in developing cerebral cortex.</a> Nature Biotechnology. 32 (10), 1053-1058 (2014).</li>
<li>Hayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+full-length+total+RNA+sequencing+uncovers+dynamics+of+recursive+splicing+and+enhancer+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-cell full-length total RNA sequencing uncovers dynamics of recursive splicing and enhancer RNAs.</a> Nature Communications. 9 (1), 619(2018).</li>
<li>Satpathy, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+single-cell+chromatin+landscapes+of+human+immune+cell+development+and+intratumoral+T+cell+exhaustion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion.</a> Nature Biotechnology. 37 (8), 925-936 (2019).</li>
<li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+epitope+and+transcriptome+measurement+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells.</a> Nature Methods. 14 (9), 865-868 (2017).</li>
<li>Peterson, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+quantification+of+proteins+and+transcripts+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells.</a> Nature Biotechnology. 35 (10), 936-939 (2017).</li>
<li>Gaublomme, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+multiplexing+with+barcoded+antibodies+for+single-nucleus+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics.</a> Nature Communications. 10 (1), 2907(2019).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Une méthode simple et robuste pour isoler les noyaux simples et étudier l’hétérogénéité des tissus adipeux est présentée. Comparé au séquençage de l’ARN des tissus entiers, ce flux de travail offre une vue impartiale de l’hétérogénéité cellulaire et des marqueurs spécifiques à la population. Ceci est significatif et novateur pour l’avancement de la biologie des adipocytes, du métabolisme moléculaire et de la recherche sur l’obésité.
Ce protocole est particulièrement optimisé pour l’application...

Des études ont montré que le tissu adipeux brun (BAT) a une capacité remarquable de dissiper l’énergie. Deux types d’adipocytes thermogéniques avec des caractéristiques développementales distinctes existent chez les rongeurs et les humains : les adipocytes beiges et les adipocytes bruns classiques. Alors que les adipocytes bruns classiques sont situés principalement dans les dépôts de BAT interscapulaires, les adipocytes beiges émergent sporadiquement dans le tissu adipeux blanc (WAT) en réponse à certains indices physiologiques, tels que l’exposition chronique au froid, un processus appelé « brunissement » ou « beiging ». Grâce à l’utilisation de l’imagerie avancée, il est maintenant clair que les humains adultes ont des dépôts substantiels de UCP1+ BAT, en particulier dans la région supraclaviciculaire1,2,3,4. La quantité de BAT humain adulte est inversement corrélée avec l’adiposité et peut être augmentée par des signaux externes, tels que l’exposition chronique au froid5,,6 ou β3-adrénergique récepteur agoniste7. Les dépenses énergétiques sous médiation du BAT peuvent offrir une approche viable pour lutter contre l’obésité.
Jusqu’à récemment, les adipocytes thermogéniques étaient considérés comme une population homogène. Cependant, des études ont révélé l’existence de plusieurs sous-types ou sous-populations distincts dans l’origine développementale, l’utilisation du substrat et le transcriptome8,9,10. Par exemple, un type d’adipocyte beige qui utilise de préférence le glucose pour la thermogenèse, l’adipocyte g-beige, a été récemment décrit10. La compréhension incomplète des types de cellules dans les tissus adipeux bruns et beiges et l’absence de marqueurs spécifiques constituent une barrière critique à l’étude de leurs fonctions biologiques.
Les méthodes traditionnelles d’isolement des sous-populations de cellules sont basées sur l’expression de quelques gènes marqueurs connus. Les progrès récents en génomique unicellulaire permettent l’utilisation de données d’expression génique globale de cellules uniques pour fournir une estimation impartiale du nombre de sous-populations dans un tissu. Le but ultime de ce protocole est de déterminer tous les sous-types de tissus adipeux sous divers stimuli thermogéniques à une résolution unicellulaire. Contrairement à d’autres tissus et types de cellules, la détermination des sous-types cellulaires du tissu adipeux est difficile en raison de la fragilité des adipocytes remplis de lipides. Cet article introduit un protocole robuste pour isoler les noyaux simples du tissu adipeux pour l’application en aval au séquençage de l’ARN. Fait important, la littérature récente comparant le séquençage de l’ARN uni-noyaux (snRNA-seq) et les ensembles de données de séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) ont révélé que le snRNA-seq est comparable au scRNA-seq dans la détection de type cellulaire, et supérieur dans la couverture cellulaire pour un tissu complexe comme le cerveau11. Ce protocole combine une méthode de centrifugation de gradient de densité optimisée pour les tissus adipeux par Rosen et al.12 avec une étape de « nettoyage » de noyaux avec un trieur à grande vitesse MoFlo XDP. Comme on le voit dans les résultats représentatifs, une analyse de 7 500 noyaux simples provenant du tissu adipeux brun intercapulaire de souris a identifié plusieurs types de cellules dans des adipocytes bruns apparemment homogènes. Dans l’ensemble, ce protocole simple et robuste peut être appliqué à l’organisation au niveau tissulaire des adipocytes et des cellules adipose-résidentes, à l’identification des gènes marqueurs spécifiques au sous-type et au phénotypage de développement des souris adipeuses sélectives par KO/transgéniques.

<table><tbody><tr><td>solution de rinçage autoMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>PBS avec EDTA ; stérile à filtre</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A1595</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>21115</td><td></td></tr><tr><td>Filtre à cellules 100 &mu ; m</td><td>Corning</td><td>431752</td><td></td></tr><tr><td>Filtre à cellules 40&mu ; m</td><td>Corning</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>CellTrics (30 &mu ; m)</td><td>Sysmex</td><td>04-004-2326</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase D</td><td>Roche</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL Compteur de cellules automatisé</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Roche</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>P217-3</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers (30 & micro ; m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-458</td><td>Filtres empilables</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>MoFloXDP Trieur de cellules</td><td>Beckman Coulter</td><td>ML99030</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Protector Inhibiteur de RNase</td><td>Roche</td><td>3335402001</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Fisher</td><td>S5-3</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement des noyaux de tissus adipeux pour applications génomiques unicellulaires

Isolation of Adipose Tissue Nuclei for Single-Cell Genomic Applications

Les graisses brunes et beiges sont des tissus adipeux spécialisés qui dissipent l’énergie pour la thermogenèse par ucp1 (Uncoupling Protein-1) --voies indépendantes. Jusqu’à récemment, les adipocytes thermogéniques étaient considérés comme une population homogène. Cependant, des études récentes ont indiqué qu’il existe plusieurs sous-types ou sous-populations qui sont distincts dans l’origine développementale, l’utilisation du substrat, et le transcriptome. Malgré les progrès de la génomique unicellulaire, la décomposition impartiale des tissus adipeux en sous-types cellulaires a été difficile en raison de la nature fragile des adipocytes remplis de lipides. Le protocole présenté a été développé pour contourner ces obstacles par l’isolement efficace des noyaux simples des tissus adipeux pour les applications en aval, y compris le séquençage de l’ARN. L’hétérogénéité cellulaire peut ensuite être analysée par séquençage de l’ARN et des analyses bioinformatiques.

Les noyaux d’adipocytes non triés contiennent des débris et des doublets qui créent du bruit et un fond élevé dans le séquençage de l’ARN unicellulaire en aval. La stratégie représentative de porte FACS est indiquée à la figure 1. Les noyaux ont d’abord été sélectionnés en fonction de la diffusion vers l’avant (FSC) et de la dispersion latérale (SSC) (A),puis, seuls les singlets ont été sélectionnés en fonction de la combinaison de la largeur...

Cette publication décrit un protocole pour l’isolement des noyaux des adipocytes matures, la purification par le tri activé par fluorescence, et la transcriptomique de niveau unicellulaire.

Isolement des noyaux de tissus adipeux pour applications génomiques unicellulaires

Brown and beige fat are specialized adipose tissues that dissipate energy for thermogenesis by UCP1 (Uncoupling Protein-1)-dependent and independent ...

La décomposition du tissu adipeux en sous-types a été difficile parce que la nature fragile de l’adipocyte. Ce protocole a été développé pour surmonter cela par l’isolement efficace des noyaux simples. Ce flux de travail fournit des noyaux simples hautement purifiés avec des agrégats nucléaires réduits au minimum et des débris cellulaires.Ceci est avantageux pour le profilage transcriptome à cellule unique de milliers de cellules. Ce protocole simple et robuste peut être appliqué pour étudier l’organisation des adipocytes au niveau des tissus dans leurs cellules résidentes adipeuses. Et en particulier, au développement du phénotypage, de l’adipeux KO et des souris transgéniques.La démonstration visuelle de ce protocole est essentielle afin que les personnes qui n’ont pas beaucoup d’expérience dans la manipulation des adipocytes puissent reproduire et perspicacité dans l’hétérogénéité adipeuse. Après avoir recueilli le tissu adipeux des souris, tapotez-le à l’aide d’une serviette en papier et placez-le dans un plat propre. Ajouter le chlorure de calcium au tampon de digestion à une concentration finale de 10 mM.Ensuite, ajouter un petit volume au tissu et bien le hacher. Ajouter environ la moitié de la quantité de tampon de digestion préparé au tissu haché. Et utilisez une pipette sérologique pour transférer l’échantillon dans un tube de centrifugeuse de 50 mL.Laver le plat avec le tampon restant et l’ajouter au tube de 50 mL. Pipette l’échantillon de haut en bas à plusieurs reprises. Puis, l’incuber pendant 12 à 15 minutes à 37 degrés Celsius tout en secouant à 200 à 210 rpm.Après l’incubation, ajouter 0,5 %BSA à l’échantillon à un rapport de volume de 1 à 1 et bien mélanger au pipetage. Centrifugeuse l’échantillon à 300 xg pendant cinq minutes à température ambiante pour faire tourner la fraction stromovasculaire laissant la fraction d’adipocyte sur le dessus. Filtrer la fraction supérieure par un filtre cellulaire de 400 m dans un tube de 50 mL.Ensuite, retournez le filtre à l’envers sur le tube et transférez les adipocytes dans un nouveau tube en utilisant 0,5% BSA pour inverser le filtre. Porter le volume total de la BSA à 10 à 15 mL et pipette l’échantillon de haut en bas avec pipette sérologique. Puis, centrifugez-le à nouveau à 300 xg pendant cinq minutes à température ambiante.Après centrifugation, utilisez une pointe de pipette à alésage large pour transférer soigneusement la couche supérieure de l’échantillon à un filtre cellulaire de 100 m au-dessus d’un nouveau tube pré-refroidi sur la glace. Rincez le filtre avec une quantité suffisante de tampon de préparation des noyaux, puis jetez-le. À partir de ce pas en avant, gardez un échantillon sur la glace et travaillez rapidement.Laisser l’échantillon sur la glace jusqu’à deux minutes en inversant le tube par intermittence pour mélanger. Puis, centrifugeuse à 1000 xg et 4 degrés Celsius pendant 10 minutes. Retirer le supernatant et réutiliser la pastille dans 1 mL de tampon de préparation des noyaux.Transférer l’échantillon dans un tube de microcentrifugeuse propre en prenant soin d’éviter de toucher les parois de l’ancien tube. Ajouter 0,6 unité par inhibiteur de la RNase L et mélanger. Ensuite, centrifugez l’échantillon pendant encore 10 minutes.Retirer le supernatant et réutiliser une pastille et 1 mL de tampon de lavage des noyaux. Filtrez doublement l’échantillon dans un tube propre à l’aide de filtres empilables de 30 m. Ensuite, lavez les filtres avec environ 300 L de tampon de lavage de noyaux.Pour confirmer l’isolement réussi des noyaux sains, tacher un petit aliquot de l’échantillon avec trypan et utiliser un compteur de cellules automatisé pour évaluer la taille morte moyenne et le pourcentage de cellules mortes. Taches dans un petit aliquot de l’échantillon avec DAPI et l’examiner au microscope avec un objectif de 20X ou plus. Les noyaux doivent être ronds et avoir une membrane nucléaire intacte.Les flèches blanches indiquent les noyaux sans membrane intacte. Après avoir nettoyé les noyaux avec facs, concentrez cet échantillon en centrifugant à 500 xg pendant cinq minutes à 4 degrés Celsius. Ensuite, reconstituez-le dans un volume approprié de tampon de lavage des noyaux.Pour atteindre une concentration de 50 à 1500 noyaux par L et procéder à un seq d’ARN de noyaux unicell cellules. Pour éliminer les débris cellulaires et les doublets, les noyaux d’adipocytes sont triés pour la taille et la granularité afin d’exclure les agrégats et les multipletes nucléaires. Et enfin pour les événements positifs DAPI.Cette stratégie de classement se traduira par des noyaux simples hautement purifiés avec un minimum d’agrégats et de débris. Lorsqu’ils sont inspectés par microscopie, les noyaux triés doivent être ronds et avoir une membrane intacte. La purification réussie des noyaux peut également être exécutée avec qRT-PCR en temps réel utilisant des amorces pour l’ARNm Ucp1 naissant, un gène marqueur pour les adipocytes bruns.La plate-forme de chrome a déterminé un transcriptome de 7500 noyaux du tissu adipeux brun interscapulaire murin. Sept types de cellules différents ont été révélés avec la réduction de la dimensionnalité t-SNE et le clustering k-means. Tous les amas ont exprimé Fabp4, un gène d’adipocyte de casserole et un sous-ensemble ont exprimé un niveau élevé d’ARNm Ucp1.Noyaux isolés, puis confirmés bien que ce protocole peut être soumis à pratiquement n’importe quelle plate-forme d’expression génique de niveau unicell cellule, y compris le chrome de 10x génomique.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Genetics

Génétique

Grâce à la connexion drastique et négative entre l'obésité et d'autres comorbidités, la recherche sur le rôle adipeux joue dans la maladie et la santé globale est justifiée. Nous présentons un protocole pour l'isolement et l'excision de dépôts adipeux permettant l'étude du tissu adipeux à l'aide in situ et des procédés in vitro.

Localisation, identification, et l&#39;excision des dépôts adipeux murin

L’isolement des noyaux uniques repose sur la dissociation et la perméabilisation à base de détergent de la membrane cellulaire, étapes qui nécessitent une optimisation et sont sujettes à l’introduction d’artefacts techniques. Nous démontrons un protocole sans détergent et sans enzymes pour l’isolement rapide des noyaux intacts directement à partir de tissus entiers, donnant des noyaux appropriés pour l’ARN-seq mono-noyau (snRNA-Seq) ou ATAC-seq.

Isolation des noyaux par tissu entier à l’aide d’une méthode sans détergent et sans enzymes

Ce protocole décrit l’approche technique permettant d’isoler des sous-populations de cellules stromales adipogènes et fibro-inflammatoires à partir de dépôts de tissu adipeux blanc (WAT) intra-abdominal murin par tri cellulaire activé par fluorescence ou séparation immunomagnétique des billes.

Isolement de sous-populations de cellules stromales adipogènes et fibro-inflammatoires à partir de dépôts adipeux intra-abdominaux murins

Cette étude décrit une nouvelle méthode d’isolement des adipocytes bruns murins pour l’analyse de l’expression des gènes et des protéines.

Isolement des adipocytes bruns du tissu adipeux brun interscapulaire murin pour l’analyse de l’expression génique et protéique

Ici, nous présentons un protocole pour isoler des noyaux de haute qualité à partir de reins de souris congelés qui améliorent la représentation des types de cellules rénales médullaires et évitent les artefacts d’expression génique de la dissociation des tissus enzymatiques.

Isolement de noyaux à partir de reins de souris adultes pour le séquençage de l’ARN mononucléaire

Ici, nous présentons un protocole pour isoler les noyaux des tissus hépatiques archivés surgelés pour le séquençage de l’ARN mononoyau, le séquençage ATAC et la multiomique articulaire (RNA-seq et ATAC-seq).

Isolement de noyaux de tissu hépatique surgelé pour la multiomique unicellulaire

Nous présentons un protocole de dosage de la chromatine accessible par la transposase avec séquençage à haut débit (ATAC-seq) spécifiquement sur les adipocytes en utilisant le tri des noyaux avec des tissus adipeux isolés de souris rapporteures transgéniques avec marquage par fluorescence nucléaire.

ATAC-Seq spécifique aux adipocytes avec tissus adipeux par tri des noyaux activés par fluorescence

Nous présentons ici un protocole décrivant la préparation des noyaux cellulaires. Après la microdissection et la dissociation enzymatique du tissu cardiaque en cellules individuelles, les cellules progénitrices ont été congelées, suivies de l’isolement de cellules viables pures, qui ont été utilisées pour le séquençage de l’ARN mononucléaire et le test mononucléique pour la chromatine accessible à la transposase avec des analyses de séquençage à haut débit.

Isolement de noyaux à partir de cellules progénitrices cardiaques de souris pour le profilage de l’épigénome et de l’expression génique à une résolution unicellulaire

L’étude décrit un protocole simple, rapide et partiellement automatisé pour isoler des noyaux de haute qualité à partir de tissus de mammifères congelés pour le séquençage de l’ARN de noyaux uniques en aval.

Un protocole simple, rapide et partiellement automatisé pour l’isolement de noyaux uniques à partir de tissus de mammifères congelés pour le séquençage d’un seul noyau

La biologie du tissu adipeux intermusculaire (IMAT) est largement inexplorée en raison de l’accessibilité limitée des tissus humains. Ici, nous présentons un protocole détaillé pour l’isolement des noyaux et la préparation de banques d’IMAT humain congelé pour le séquençage de l’ARN à noyaux uniques afin d’identifier la composition cellulaire de ce dépôt adipeux unique.

Isolement de noyaux à partir de tissu adipeux intermusculaire humain et séquençage d’ARN à noyaux uniques en aval

Apprenez à isoler des noyaux uniques à partir d'adipocytes matures pour des analyses transcriptomiques unicellulaires de haute qualité. Cette méthode robuste minimise les agrégats nucléaires et les débris cellulaires.

Isolement des noyaux de tissus adipeux pour applications génomiques unicellulaires

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