Name: Essai méthylé d’immunoprécipation d’ARN pour étudier la modification m5C dans Arabidopsis (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Découvrez l'essai méthylé d'immunoprécipation d'ARN (MeRIP) pour identifier les transcrits modifiés en m⁵C dans Arabidopsis. Cette méthode combine immunoprécipitation et séquençage profond pour étudier les méthylations de l'ARN.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ces travaux ont été soutenus par une allocation de doctorat IMPRS à E.S., une bourse de longue durée de l’EMBO à V.P., et des fonds internes MPI-MPP à F.K. Une partie de ces travaux a également été financée par le PLAMORF, un projet qui a reçu des fonds du Conseil européen de la recherche (CER) dans le cadre du programme horizon 2020 de recherche et d’innovation de l’Union européenne (accord de subvention n° 810131). Les auteurs remercient Federico Apelt pour l’analyse bioinformatique et les commentaires sur le manuscrit, ainsi que Mathieu Bahin et Amira Kramdi pour l’analyse bioinformatique.

1. Préparation de l’ARN
<ol><li>Moudre 200 mg de tissu végétaux en poudre dans de l’azote liquide, en s’assurant que le tissu reste gelé tout au long de la procédure.</li>
	<li>Extraire l’ARN du tissu végétal désiré suivant un protocole acide d’extraction de guanidinium thiocyanate-phénol-chloroforme. Pour diminuer la possibilité de contaminer l’ARN avec l’ADN pendant la séparation de phase, utilisez 1-bromo-3-chloropropane au lieu de chloroforme.<ol>
<li>Ajouter 1 mL de reagent d’extraction d’ARN contenant du thiocyanate de guanidine et du phénol acide au tissu végétal broyé (500 μL par tissu de 100 mg). Bien mélanger en inversant et assurez-vous que tous les tissus sont mouillés. Incuber pendant 10 min à température ambiante pour dissocier les complexes ribonucléoprotéines.</li>
		<li>Centrifugeuse de 10 min à 12 000 x g à 4 °C et transfert du supernatant dans un nouveau tube de 1,5 mL.</li>
		<li>Ajouter 200 μL de 1-bromo-3-chloropropane (100 μL par 500 μL de réagent d’extraction d’ARN) et vortex vigoureusement.</li>
		<li>Centrifugeuse pendant 15 min à 12 000 x g à 4 °C et transfert de la phase aqueuse supérieure (environ 500 μL) dans un nouveau tube de 1,5 mL.</li>
		<li>Ajouter 1 volume d’isopropanol (500 μL) et 0,1 volume de 3 M de pH d’acétate de sodium 5,5 (50 μL), bien mélanger en inversant et précipiter 10 min à -20 °C. REMARQUE : L’utilisation de l’acétate de sodium (NaOAc) est recommandée afin d’augmenter les précipitations d’ARN. Le protocole peut être mis en pause à ce stade en prolongeant les précipitations d’ARN pendant quelques heures ou même toute la nuit.</li>
		<li>Centrifugeuse pendant 30 min à 12 000 x g à 4 °C et jeter le supernatant.</li>
		<li>Laver la pastille deux fois avec 500 μL de 80% EtOH, centrifugeuse pendant 5 min à 12 000 x g à 4 °C et jeter.</li>
		<li>Laver la pastille une fois avec 500 μL 99% EtOH, centrifugeuse pendant 5 min à 12 000 x g à 4 °C et jeter.</li>
		<li>Sécher la pastille de 5 à 10 minutes et dissoudre en 30 μL de H2O sans RNase. REMARQUE : Utilisez plutôt n’importe quel protocole d’extraction d’ARN de choix (p. ex., un système basé sur des colonnes). Si une digestion DNase est incluse dans le protocole, sautez-la dans l’étape suivante (étape 1.3).</li>
	</ol></li>
	<li>Mesurer la concentration d’ARN (p. ex., à l’utilisation d’un spectrophotomètre) et digérer 20 μg d’ARN avec du DNase. REMARQUE : L’ADN est riche en m5C et l’anticorps ne fait pas de distinction entre l’ADN et l’ARN.<ol>
<li>Dans une réaction typique de DNase, traitez 10 μg d’ARN dans une réaction de 50 μL. Mélanger les composants suivants et incuber la réaction (s) à 37 °C pendant 30 min : 10 μg d’ARN x μL Tampon 10x DNase 5 μL DNase 1 μL (2 unités) H2O sans RNase jusqu’à 50 μL</li>
		<li>Retirez l’enzyme soit en ajoutant un volume approprié de réacgage d’inactivation DNase (si elle est incluse dans le kit DNase et selon les instructions du fabricant) soit en effectuant une étape de nettoyage (p. ex., purification des colonnes ou extraction de phénol/chloroforme).</li>
	</ol></li>
	<li>Vérifiez la qualité et la pureté de l’ARN isolé par électrophorèse capillaire et procédez si le numéro d’intégrité de l’ARN (RIN) est supérieur à 7, pour s’assurer que les échantillons sont de bonne qualité.</li>
	<li>FACULTATIF : Enlevez l’ARN ribosomal pour enrichir les échantillons dans la teneur en ARNm à l’aide d’un kit d’enlèvement de rRNA et selon le protocole du fabricant.<ol>
<li>Utilisez l’ARN traité par DNase de l’étape précédente pour la réaction d’épuisement rRNA(s). Effectuez plusieurs réactions si la quantité totale d’ARN est supérieure à la quantité maximale suggérée pour la réaction.</li>
		<li>Notez que seulement 5-10% de la quantité d’entrée sera récupérée après épuisement de rRNA. Procéder à l’ARN appauvri rRNA (quantité égale pour tous les échantillons) et ignorer les quantités mentionnées dans les étapes suivantes, comme ils se réfèrent à l’ARN total. REMARQUE : Pour une comparaison et une description des méthodes disponibles d’épuisement de rRNA voir références 38,39,40. rRNA est la majeure partie de l’ARN total et est m5C méthylé dans de nombreux organismes.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparez à l’avance des transcriptions in vitro (IVT) pour être utilisées comme séquences d’ARN de contrôle et ajoutez-les dans les échantillons.<ol>
<li>Produire deux IVT distincts à l’aide d’un kit de transcription in vitro, l’un avec des nucléosides non méthylés et l’autre où le RCTP est remplacé par 5-méthyl-rCTP, pour servir de contrôles négatifs et positifs dans MeRIP, respectivement. Les transcriptions préparées étaient celles de l’EGFP et de Renilla luciferase. REMARQUE : Les IVT ne devraient pas exister dans le transcriptome de l’organisme que vous analysez. Si les IVT proviennent du même modèle (p. ex., les deux EGFP), ajoutez le contrôle positif et négatif dans deux échantillons différents. Si leur séquence est différente (p. ex., EGFP et Renilla), ils peuvent être ajoutés au même échantillon.</li>
		<li>Spike dans chaque échantillon 0,1 ng IVT par 3 μg d’ARN, comme contrôles.</li>
	</ol></li>
	<li>Sonicate l’ARN à environ 100 fragments de nt. REMARQUE : Les conditions de cisaillement de l’ARN doivent être ajustées à l’avance et elles diffèrent pour chaque sonicateur. Pour le modèle utilisé ici, la sonication est effectuée avec les conditions suivantes: Puissance de pointe 174, Facteur de service 10, Cycles /burst 200, 17 min.<ol>
<li>Sonicate la même quantité d’ARN pour tous les échantillons, au moins 12 μg d’ARN par échantillon dans 80 μL de volume total (min 60 μL, max 100 μL), rempli de H2O sans RNase.</li>
	</ol></li>
	<li>Confirmer l’efficacité de la sonication et la concentration des échantillons d’ARN par électrophoresis capillaire. La taille moyenne de l’ARN fragmenté devrait être d’environ 100 nt.</li>
</ol>2. Immunoprécipation de l’ARN méthylé (MeRIP)
<ol><li>Dans les tubes à faible liaison, ajouter 9 μg d’ARN sonique et H2O sans RNase jusqu’à 60 μL (ou plus, selon la concentration).</li>
	<li>Dissocier les structures secondaires en chauffant l’ARN à 70 °C dans un bain d’eau pendant 10 minutes et en refroidissant pendant 10 minutes supplémentaires dans un mélange d’eau glacée.</li>
	<li>Divisez l’échantillon en trois parties : un tiers (20 μL, si 60 μL ont été prélevés à l’étape 2.1) est enregistré dans un tube séparé à -80 °C comme échantillon d’entrée. Remplissez les 40 μL restants de H2O sans RNase jusqu’à 860 μL, puis divisez-les en deux tubes à faible liaison : un pour ip et un pour le contrôle Mock (430 μL chacun).</li>
	<li>Ajouter aux deux tubes : 50 μL de tampon MeRIP 10x 10 μL d’inhibiteur du RNase 10 μL d’anticorps α m5C (10 μg) dans l’échantillon IP par 10 μL de H2O dans l’échantillon Mock REMARQUE : Le clone d’anticorps utilisé précédemment n’est plus disponible dans le commerce. Cependant, n’importe quel anticorps monoclonal anti-5-méthylcytosine devrait fonctionner de la même manière. Les anticorps doivent être testés pour la spécificité avant d’être utilisés pour MeRIP11,23.</li>
	<li>Sceller les tubes avec du parafilm et incuber pendant 12-14 heures à 4 °C, avec rotation aérienne.</li>
	<li>Le lendemain, préparez les perles magnétiques de protéine G pour la reliure.<ol>
<li>Pour chaque tube (contrôle IP ou Mock), utilisez 40 μL de perles. Ajouter la quantité totale de perles (# de tubes x 40 μL, par exemple, pour 2 échantillons IP et 2 échantillons simulés, 160 μL de perles sont nécessaires) dans un tube de 15 mL et lavent trois fois avec 800 μL de tampon MeRIP 1x par échantillon (# de tubes x 800 tampon μL, par exemple, 3,2 mL pour 2 échantillons IP et 2 échantillons de maquettes).</li>
		<li>Effectuez des lavages à température ambiante pendant 5 min avec rotation aérienne, recueillez les perles à l’aide d’un support magnétique et jetez le tampon de lavage. Après le troisième lavage, resuspendez les perles dans le même volume de tampon MeRIP 1x que le volume initial de perles prises (# de tubes x 40 μL, par exemple, 160 μL de tampon MeRIP 1x pour 2 échantillons IP et 2 simulacres). REMARQUE : La quantité de perles de protéines G utilisées est déterminée par la capacité de liaison des perles pour le type d’anticorps spécifique et la quantité d’anticorps utilisée. Dans ce cas, les perles ont une capacité contraignante d’environ 8 μg de souris IgG par mg de perles et 30 mg/mL de concentration. Par conséquent, 40 μL sont suffisants pour lier environ 9,6 μg d’anticorps.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajouter 40 μL de perles résuspendées à chaque échantillon IP et Mock et incuber pendant 2 heures supplémentaires à 4 °C, avec rotation aérienne.</li>
	<li>Placez les tubes sur une grille magnétique pendant 1 min et jetez le supernatant ou enregistrez-le comme un contrôle (échantillon d’ARN non lié).</li>
	<li>Lavez les perles 5 fois en réutilisant 700 μL de tampon 1x MeRIP fourni avec 0,01% de Tween 20 et en couveant pendant 10 min à température ambiante avec rotation aérienne.</li>
	<li>Resuspendez les perles lavées en 200 μL de tampon de digestion Proteinase K et ajoutez 3,5 μL de Proteinase K. Incubez pendant 3 heures à 50 °C, en secouant à 800 rpm. Parfois, feuilletez manuellement le fond du tube si un sédiment de perles se forme pendant l’incubation.</li>
	<li>Extraire l’ARN par ajout de 800 μL de reagent d’extraction d’ARN et suivre un protocole acide d’extraction de thiocyanate-phénol-chloroforme de guanidinium, et continuer comme dans l’étape 1.2. Pour augmenter la visibilité de la pastille d’ARN, un co-précipitant coloré peut être ajouté dans l’isopropanol à l’étape de précipitation. Resuspendez la pastille en 20 μL de H2O sans RNase (ou égale au volume d’entrée maintenu à l’étape 2.3).</li>
</ol>3. Analyse en aval
<ol><li>Soumettez les échantillons d’entrée et de propriété intellectuelle pour le séquençage à extrémité unique avec 50 bases de longueur de lecture (SE50).</li>
	<li>Coupez les adaptateurs finaux de 3' à l’aide du cutadapt41 et jetez les lectures plus courtes que 48 nt.</li>
	<li>La carte taillée se lit sur le génome d’Arabidopsis (annotation TAIR10) à l’aide de STAR42 avec une coupure de 6 % pour les inadéquations et la taille maximale de l’intron de 10 kb. Conservez des lectures cartographiées de façon unique pour une analyse plus approfondie.</li>
	<li>Identifier les fragments d’ARN enrichis dans les échantillons de propriété intellectuelle par rapport à l’entrée à l’aide de deux méthodes distinctes et tenir compte de ceux qui sont trouvés significativement enrichis par les deux.<ol>
<li>Tout d’abord, détectez les pics MeRIP-seq à l’aide de l’appelant de pointe MACS243 sur les adresses IP poolées par rapport à l’entrée.</li>
		<li>Deuxièmement, suivez l’analyse de l’appel de pointe MeRIP-seq tel que décrit dans Meyer et coll.22 et Yang et coll.17.<ol>
<li>À l’aide de scripts R personnalisés, divisez le génome en 25 fenêtres distinctes et comptez le nombre de lectures cartographiées de façon unique pour chaque fenêtre en fonction de la position du dernier nucléotide cartographié (puisque les lectures proviennent de 100 fragments d’ARN nt).</li>
			<li>Calculer les fenêtres considérablement enrichies dans les échantillons ip par rapport à l’entrée avec le test Fisher Exact. Utilisez la procédure Benjamini-Hochberg pour corriger pour plusieurs tests.</li>
			<li>Gardez les pics considérablement enrichis qui s’étendent sur au moins deux fenêtres consécutives et jetez les pics qui ne couvrent qu’une seule fenêtre.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Identifier les régions annotées du génome (transcriptions) avec des pics significativement enrichis trouvés par les deux méthodes.</li>
	<li>Alternativement ou de manière complémentaire, testez des cibles d’ARN spécifiques pour leur enrichissement dans les échantillons de propriété intellectuelle.<ol>
<li>Reverse transcrire l’ARN (même volume d’échantillons d’entrée, ip et simulacre) avec des hexamers aléatoires.</li>
		<li>Effectuez un PCR quantitatif en temps réel sur les cibles choisies, en comparant Input, IP et Mock via la méthode ΔΔCt. REMARQUE : Le produit généré ne doit pas être supérieur à 100 pb, car il s’agit de la taille moyenne de la fragmentation.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Trixl, L., Lusser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+RNA+modification+5-methylcytosine+and+its+emerging+role+as+an+epitranscriptomic+mark%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+RNA%22%5BJournal%5D)">The dynamic RNA modification 5-methylcytosine and its emerging role as an epitranscriptomic mark.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 10 (1), 1-17 (2019).</li>
<li>Mongan, N. P., Emes, R. D., Archer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+analysis+of+RNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Detection and analysis of RNA methylation.</a> F1000Research. 8, 559(2019).</li>
<li>Cantara, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+modification+database%2C+RNAMDB%3A+2011+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The RNA modification database, RNAMDB: 2011 update.</a> Nucleic Acids Research. 39, SUPPL 1 195-201 (2011).</li>
<li>Boccaletto, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MODOMICS%3A+a+database+of+RNA+modification+pathways.+2017+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 303-307 (2018).</li>
<li>Agris, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bringing+order+to+translation%3A+the+contributions+of+transfer+RNA+anticodon-domain+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">Bringing order to translation: the contributions of transfer RNA anticodon-domain modifications.</a> EMBO reports. 9 (7), 629-635 (2008).</li>
<li>Chow, C. S., Lamichhane, T. N., Mahto, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+Nucleotide+Repertoire+of+the+Ribosome+with+Post-Transcriptional+Modifications%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Expanding the Nucleotide Repertoire of the Ribosome with Post-Transcriptional Modifications.</a> ACS Chemical Biology. 2 (9), 610-619 (2007).</li>
<li>Gigova, A., Duggimpudi, S., Pollex, T., Schaefer, M., Koš, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cluster+of+methylations+in+the+domain+IV+of+25S+rRNA+is+required+for+ribosome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A cluster of methylations in the domain IV of 25S rRNA is required for ribosome stability.</a> RNA. 20 (10), New York, N.Y. 1632-1644 (2014).</li>
<li>Motorin, Y., Helm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tRNA+Stabilization+by+Modified+Nucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">tRNA Stabilization by Modified Nucleotides.</a> Biochemistry. 49 (24), 4934-4944 (2010).</li>
<li>Shatkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capping+of+eucaryotic+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Capping of eucaryotic mRNAs.</a> Cell. 9 (4), 645-653 (1976).</li>
<li>Shen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N+6+-Methyladenosine+RNA+Modification+Regulates+Shoot+Stem+Cell+Fate+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">N 6 -Methyladenosine RNA Modification Regulates Shoot Stem Cell Fate in Arabidopsis.</a> Developmental Cell. 38 (2), 186-200 (2016).</li>
<li>Cui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Methylcytosine+RNA+Methylation+in+Arabidopsis+Thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">5-Methylcytosine RNA Methylation in Arabidopsis Thaliana.</a> Molecular Plant. 10 (11), 1387-1399 (2017).</li>
<li>Huber, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+abundance+of+5-hydroxymethylcytosine+in+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Formation and abundance of 5-hydroxymethylcytosine in RNA.</a> ChemBioChem. 16 (5), 752-755 (2015).</li>
<li>Zuber, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uridylation+and+PABP+Cooperate+to+Repair+mRNA+Deadenylated+Ends+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Uridylation and PABP Cooperate to Repair mRNA Deadenylated Ends in Arabidopsis.</a> Cell Reports. 14 (11), 2707-2717 (2016).</li>
<li>Luo, G. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+features+of+the+m6A+methylome+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Unique features of the m6A methylome in Arabidopsis thaliana.</a> Nature Communications. 5 (1), 5630(2014).</li>
<li>Wan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+high-throughput+deep+m6A-seq+reveals+unique+differential+m6A+methylation+patterns+between+three+organs+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide high-throughput deep m6A-seq reveals unique differential m6A methylation patterns between three organs in Arabidopsis thaliana.</a> Genome Biology. 16 (1), 1-26 (2015).</li>
<li>David, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-Wide+Mapping+of+RNA+5-Methylcytosine+in+Arabidopsis+mRNAs+and+Noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-Wide Mapping of RNA 5-Methylcytosine in Arabidopsis mRNAs and Noncoding RNAs.</a> The Plant Cell. 29 (3), 445-460 (2017).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((m5C+Methylation+Guides+Systemic+Transport+of+Messenger+RNA+over+Graft+Junctions+in+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">m5C Methylation Guides Systemic Transport of Messenger RNA over Graft Junctions in Plants.</a> Current Biology. 29 (15), 2465-2476 (2019).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+analysis+of+pseudouridylation+of+mRNA+and+non-coding+RNAs+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide analysis of pseudouridylation of mRNA and non-coding RNAs in Arabidopsis.</a> Journal of Experimental Botany. 70 (19), 5089(2019).</li>
<li>Chmielowska-Bąk, J., Arasimowicz-Jelonek, M., Deckert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+search+of+the+mRNA+modification+landscape+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">In search of the mRNA modification landscape in plants.</a> BMC Plant Biology. 19 (1), 421(2019).</li>
<li>Liang, Z., Riaz, A., Chachar, S., Ding, Y., Du, H., Gu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+Modifications+of+mRNA+and+DNA+in+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Epigenetic Modifications of mRNA and DNA in Plants.</a> Molecular Plant. 13 (1), 14-30 (2020).</li>
<li>Dominissini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topology+of+the+human+and+mouse+m6A+RNA+methylomes+revealed+by+m6A-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq.</a> Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).</li>
<li>Meyer, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Analysis+of+mRNA+Methylation+Reveals+Enrichment+in+3%27+UTRs+and+near+Stop+Codons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Analysis of mRNA Methylation Reveals Enrichment in 3' UTRs and near Stop Codons.</a> Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).</li>
<li>Edelheit, S., Schwartz, S., Mumbach, M. R., Wurtzel, O., Sorek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+mapping+of+5-methylcytidine+RNA+modifications+in+bacteria%2C+archaea%2C+and+yeast+reveals+m5C+within+archaeal+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide mapping of 5-methylcytidine RNA modifications in bacteria, archaea, and yeast reveals m5C within archaeal mRNAs.</a> PLoS genetics. 9 (6), 1003602(2013).</li>
<li>Dominissini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+N1-methyladenosine+methylome+in+eukaryotic+messenger+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The dynamic N1-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA.</a> Nature. 530 (7591), 441-446 (2016).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+mapping+reveals+reversible+and+dynamic+N1-methyladenosine+methylome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide mapping reveals reversible and dynamic N1-methyladenosine methylome.</a> Nature Chemical Biology. 12 (5), 311-316 (2016).</li>
<li>Hotchkiss, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quantitative+separation+of+purines%2C+pyrimidines%2C+and+nucleosides+by+paper+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The quantitative separation of purines, pyrimidines, and nucleosides by paper chromatography.</a> Journal of Biological Chemistry. 175 (175), 315-332 (1948).</li>
<li>Wyatt, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurence+of+5-Methyl-Cytosine+in+Nucleic+Acids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Occurence of 5-Methyl-Cytosine in Nucleic Acids.</a> Nature. 166, 237-238 (1950).</li>
<li>Dubin, D. T., Taylor, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methylation+state+of+poly+A-containing-+messenger+RNA+from+cultured+hamster+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The methylation state of poly A-containing- messenger RNA from cultured hamster cells.</a> Nucleic Acids Research. 2 (10), 1653-1668 (1975).</li>
<li>Amort, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+5-methylcytosine+profiles+in+poly%28A%29+RNA+from+mouse+embryonic+stem+cells+and+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain.</a> Genome Biology. 18 (1), 1-16 (2017).</li>
<li>Hussain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSun2-mediated+cytosine-5+methylation+of+vault+noncoding+RNA+determines+its+processing+into+regulatory+small+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">NSun2-mediated cytosine-5 methylation of vault noncoding RNA determines its processing into regulatory small RNAs.</a> Cell Reports. 4 (2), 255-261 (2013).</li>
<li>Khoddami, V., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+direct+targets+and+modified+bases+of+RNA+cytosine+methyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Identification of direct targets and modified bases of RNA cytosine methyltransferases.</a> Nature biotechnology. 31 (5), 458-464 (2013).</li>
<li>Squires, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+occurrence+of+5-methylcytosine+in+human+coding+and+non-coding+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA.</a> Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-methylcytosine+promotes+mRNA+export+-+NSUN2+as+the+methyltransferase+and+ALYREF+as+an+m5C+reader%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">5-methylcytosine promotes mRNA export - NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader.</a> Cell Research. 27 (5), 606-625 (2017).</li>
<li>Burgess, A., David, R., Searle, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+tRNA+and+rRNA+5-methylcytosine+in+the+kingdom+Plantae%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Conservation of tRNA and rRNA 5-methylcytosine in the kingdom Plantae.</a> BMC Plant Biology. 15 (1), 199(2015).</li>
<li>Schaefer, M., Pollex, T., Hanna, K., Lyko, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+cytosine+methylation+analysis+by+bisulfite+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">RNA cytosine methylation analysis by bisulfite sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 37 (2), (2009).</li>
<li>Weber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome-wide+and+promoter-specific+analyses+identify+sites+of+differential+DNA+methylation+in+normal+and+transformed+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Chromosome-wide and promoter-specific analyses identify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells.</a> Nature Genetics. 37 (8), 853-862 (2005).</li>
<li>Auxilien, S., Guérineau, V., Szweykowska-Kulińska, Z., Golinelli-Pimpaneau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+tRNA+m+%285%29+C+methyltransferase+Misu+is+multisite-specific%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">The human tRNA m (5) C methyltransferase Misu is multisite-specific.</a> RNA Biology. 9 (5), 1331-1338 (2012).</li>
<li>Adiconis, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+RNA+sequencing+methods+for+degraded+or+low-input+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples.</a> Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).</li>
<li>Petrova, O. E., Garcia-Alcalde, F., Zampaloni, C., Sauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+rRNA+depletion+procedures+for+the+improved+analysis+of+bacterial+biofilm+and+mixed+pathogen+culture+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of rRNA depletion procedures for the improved analysis of bacterial biofilm and mixed pathogen culture transcriptomes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 41114(2017).</li>
<li>Huang, Y., Sheth, R. U., Kaufman, A., Wang, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+and+cost-effective+ribonuclease-based+rRNA+depletion+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Scalable and cost-effective ribonuclease-based rRNA depletion for transcriptomics.</a> Nucleic Acids Research. 48 (4), 20(2020).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads%5BTitle%5D)+AND+%22EMBnet.journal%22%5BJournal%5D)">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10(2011).</li>
<li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAR%3A+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+Analysis+of+ChIP-Seq+%28MACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biology. 9 (9), 137(2008).</li>
<li>Saletore, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+birth+of+the+Epitranscriptome%3A+deciphering+the+function+of+RNA+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">The birth of the Epitranscriptome: deciphering the function of RNA modifications.</a> Genome Biology. 13 (10), 175(2012).</li>
<li>Schwartz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cracking+the+epitranscriptome%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Cracking the epitranscriptome.</a> RNA. 22 (2), 169-174 (2016).</li>
<li>Zhao, B. S., Roundtree, I. A., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-transcriptional+gene+regulation+by+mRNA+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (1), 31-42 (2016).</li>
<li>Keith, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobilities+of+modified+ribonucleotides+on+two-dimensional+cellulose+thin-layer+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Mobilities of modified ribonucleotides on two-dimensional cellulose thin-layer chromatography.</a> Biochimie. 77 (1-2), 142-144 (1995).</li>
<li>Feederle, R., Schepers, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+specific+for+nucleic+acid+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Antibodies specific for nucleic acid modifications.</a> RNA Biology. 14 (9), 1089-1098 (2017).</li>
<li>Linder, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleotide-resolution+mapping+of+m6A+and+m6Am+throughout+the+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome.</a> Nature Methods. 12 (8), 767-772 (2015).</li>
<li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+N+6+-Methyladenosine+%28m+6+A%29+Map+Using+Photo-Crosslinking-Assisted+m+6+A+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">High-Resolution N 6 -Methyladenosine (m 6 A) Map Using Photo-Crosslinking-Assisted m 6 A Sequencing.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (5), 1587-1590 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Arn porte plus d’une centaine de modifications de base distinctes4 qui forment l’épitranscriptome44. Ces modifications ajoutent une couche supplémentaire de régulation de la traduction et de la signalisation (examinéeen 5,6,8,20,45,46). Les premières études ont permis de détecter la présence de modifications post-transcriptionnelles surl’ARN 28,47, mais les ARN modifiés spécifiques doivent être identifiés afin de comprendre le rôle de l’épitranscriptomie. MeRIP a été conçu comme une méthode pour cartographier les sites de méthylation de l’ARN transcriptome-large21,22. Il peut être adapté à toute modification, si un anticorps spécifique est disponible.
La principale force de ce protocole est que c’est relativement simple, sans danger pour l’ARN et l’utilisateur (par exemple, 5-azaC est très toxique pour les plantes et les humains) et ne nécessite pas de séquence ou de modifier l’information enzymatique. En outre, l’enrichissement des ARN méthylés par la propriété intellectuelle augmente les chances de détecter de faibles ARNH abondants, contrairement au séquençage de la bisulfite qui ne contient pas d’étape d’enrichissement. Lorsque deux séries de MeRIP sont effectuées, l’enrichissement dans les fragments d’ARN contenant des sites de méthylation augmenteencore 22. Une des limitations de MeRIP, particulièrement une fois appliquée aux études de méthylation d’ARNm, est la grande quantité d’ARN exigée comme entrée pour l’essai. L’étape ribodepletion – ou poly(A) – réduira l’arrière-plan causé par l’ARN ribosomal fortement modifié, mais elle enlève plus de 90 % de l’ARN total. L’ADN doit également être complètement éliminé car il est riche en cytosines 5 méthylés. Un autre inconvénient est la résolution inférieure de la position exacte de la méthylation. La sonication de l’ARN avant l’incubation avec l’anticorps contribue à cette direction en rétrécissant la région contenant la modification à 100-200 nucléotides. Lorsque le MeRIP est combiné avec un séquençage profond, la résolution de la prédiction du site m5C augmente à mesure que les lectures de séquençage forment une distribution gaussienne autour du site potentiel de méthylation. En outre, la spécificité de l’anticorps doit être confirmée avant l’analyse (p. ex., avec des essais de taches à points d’ARN, effectués avec des oligos synthétisés avec des nucléotides modifiés), cependant, dans quelle mesure un anticorps peut effectivement faire la distinction entre des modifications étroitement liées (p. ex., m6A et m6Am) est un argument dans le domaine48,49. En outre, les ARN hautement structurés pourraient interférer avec l’interaction anticorps-antigènes, une autre restriction qui est principalement abordée avec la fragmentation et la dénaturation de l’ARN avant la propriété intellectuelle. Au contraire, le séquençage de la bisulfite, qui est également affecté par les structures secondaires, n’inclut pas d’étape de fragmentation et cela pourrait être l’une des raisons qui causent l’écart entre les sites m5C et les ARNM prédits par le séquençage de la bisulfite16 et le MeRIP-seq11,17. D’autres modifications de cytosine (p. ex., hm5C) sont également résistantes à la déamination35 à 100 mentations 24 h/24.
Les modifications apportées à MeRIP-seq comprennent une étape de liaison croisée, soit avec l’introduction d’un ribonucleoside photoactivatable (photo-crosslinking-assisté m6A-seq, PA-m6A-seq 50) ou en utilisant la lumière UV pour créer des liens croisés anticorps-ARN après l’IP (miCLIP49, méthode différente de la miCLIP décrite dans l’introduction30, mais aussi avec la résolution individu-nucléotide). À l’avenir, et à mesure que les connaissances sur la méthylation de l’ARN s’accumulent, des approches plus ciblées pourraient être préférables, basées sur les enzymes modificateurs et/ou les séquences consensuelles où la méthylation apparaît. L’identification des protéines du lecteur est essentielle à la compréhension de la fonction moléculaire et de signalisation des modifications post-transcriptionnelles. La technologie de séquençage nanopore permet déjà l’identification directe des nucléotides modifiés sans traitement préalable del’ARN 17, mais il y a encore place à l’amélioration dans ce domaine en ce qui concerne la profondeur de la séquence et l’analyse bioinformatique. Dans l’ensemble, MeRIP-seq est actuellement une approche établie, fiable et impartiale pour identifier les transcriptions de l’ARN méthylé.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61231">Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis</a>. The author list was updated.
The author list was updated from:
Eleftheria Saplaoura1, Valentina Perrera2, Friedrich Kragler1 
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology 
2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua
to:
Eleftheria Saplaoura1, Valentina Perrera2, Vincent Colot3, Friedrich Kragler1 
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology 
2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua 
3Biologie de l&#39;Ecole Normale Sup&#233;rieure (IBENS),&#160;Paris, France

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61231">Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis</a>. The author list was updated.

Erratum: Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis

Dans les trois royaumes de la vie, les espèces d’ARN subissent des modifications post-transcriptionnelles et la recherche sur ces modifications biochimiques fonctionnellement pertinentes est appelée « épitranscriptomics ». Epitranscriptomics est un champ en pleine croissance et diverses méthodes sont en cours de développement pour étudier et cartographier les modifications sur les molécules d’ARN (examinéesdans 1,2). Plus d’une centaine de modifications de l’ARN ont été trouvées, détectées dans les ARN, les ARN, d’autres ARNN, ainsi que dans lesARNM 3,4. Bien que la présence et la fonction de modifications post-transcriptionnelles chimiquement diverses dans les ARN et les ARNr soientlargement étudiées 5, 6,7,8,seulementrécemmentont des modifications d’ARNm ont été caractérisées. Dans les plantes, de nombreuses modifications de l’ARNm ont été identifiées à ce jour, y compris m7G à la structure du bouchon9, m1A10, hm5C11,12, et l’uridylation13. Cependant, seulement m6A10,14,15, m5C11,16,17, et pseudouridine18 ont été cartographiés transcriptome-large dans Arabidopsis. Les modifications de base post-transcriptionnelles de l’ARNm sont impliquées dans plusieurs processusde développement 19,20.
L’une des approches les plus couramment utilisées en épitranscriptomics est l’immunoprécipitation méthylé de l’ARN couplée à un séquençage profond (MeRIP-seq). MeRIP-seq a été développé en 2012 pour étudier m6A dans les cellules mammifères21,22. Il nécessite l’utilisation d’un anticorps pour la modification souhaitée et vise à enrichir pour les fragments d’ARN transportant le nucléotide modifié. Il est généralement suivi d’un séquençage profond pour identifier et cartographier les fragments enrichis ou le PCR quantitatif pour vérifier des cibles d’ARN spécifiques. L’exactitude du MeRIP est basée sur la spécificité de l’anticorps pour reconnaître le nucléotide modifié sur des modifications similaires (p. ex., m5C et hm5C11,23). Outre m6A, MeRIP-seq a également été appliqué pour étudier la méthylation del’ARNM1A et m 5 C dansplusieurs organismes 11,17,23,24,25.
La méthylation de la cytosine à la cinquième position de carbone (m5C) est la modification de l’ADN la plusrépandue 26,27 et l’une des modifications d’ARN les pluscourantes trop 3,4. Alors que m5C a été détecté dans les ARNM eucaryotes en 197528, seulement récemment ont des études axées sur la cartographie de la modification transcriptome-large, dans le codage et le non-codage ARN11,16,17,23,29,30,31,32,33,34.
Les méthodes alternatives utilisées dans larecherche sur l’ARNm 5 C comprennent la conversion chimique de cytosines non méthylées en uracils (séquençage de la bisulfite) et des analyses d’immunoprécipitation basées sur une liaison irréversible d’un méthyltransferase de cytosine d’ARN connu vers ses cibles ARN (miCLIP, aza-IP). En bref, le séquençage de bisulfite exploite la caractéristique de la cytosine 5-méthylé pour être résistant au traitement de bisulfite de sodium qui désamine les cytosines non modifiées à l’uracil. La méthode a d’abord été développée pour l’ADN, mais adaptée à l’ARN aussi et de nombreuses études ont choisi cette approche pour détecter les sites m5C dansl’ARN 16,23,29,32,34,35. MiCLIP et aza-IP nécessitent des connaissances préalables sur la méthyltransferase de cytosine de l’ARN et l’utilisation de l’anticorps respectif. Dans le cas du miCLIP (méthylation individu-nucléotide-résolution de liaison croisée et immunoprécipitation), le méthyltransferase porte une mutation unique d’acide aminé de sorte qu’il se lie au substrat d’ARN mais ne peut pas êtrelibéré 30. Dans l’aza-IP (immunoprécipitation arn 5-azacytidine-médiée), la liaison irréversible est formée entre le nucléoside de 5 azaC et la méthyltransferase de cytosine d’ARN une fois exogènement fournie 5-azaC est incorporée par des polyméses d’ARN dans une molécule cibled’ARN 31.
Le principal avantage de ces trois méthodes est qu’elles permettent une cartographie unique de résolution nucléotide de m5C. En outre, miCLIP et aza-IP fournissent des informations sur les cibles spécifiques d’un méthyltransferase de cytosine d’ARN sélectionné, déchiffrant plus profondément le mécanisme et le rôle des modifications post-transcriptionnelles d’ARN. Toutefois, l’approche MeRIP-seq permet d’identifier les régions m5C à l’échelle du transcriptome sans aucune connaissance préalable requise et évite les conditions chimiques et de température difficiles, telles que le traitement de la bisulfite ou l’incubation avec 5 azaC. Le séquençage du MeRIP et de la bisulfite peut être inhibé par des structuresd’ARN secondaires 36. L’étape de fragmentation qui est incluse dans l’analyse MeRIP avant l’immunoprécipitation vise à faciliter la liaison anticorps et à augmenter la résolution del’identificationm 5 C.
Une autre méthode digne de mention est la spectrométrie de masse (SP) des nucléosides d’ARN. La SP peut détecter et distinguer tout type de modification à la fois sur l’ADN et sur l’ARN. Brièvement, l’ARN est extrait et DNase digéré, puis desalted et digéré aux nucléosides simples. Les nucléosides d’ARN sont analysés par un spectromètre de masse. Cette méthode peut être utilisée pour quantifier les niveaux de chaque modification et elle ne repose pas sur un anticorps ou une conversion chimique. Cependant, un inconvénient majeur est qu’il fournit des informations en vrac sur la présence de modifications de l’ARN. Afin de cartographier les modifications, la SP doit être combinée avec des informations sur la digestion et le séquençage de la RNase sur des molécules d’ARN spécifiques, comme dans le cas de l’ARNt humain Leu(CAA)37.
Ici, nous décrivons et discutons l’essai de MeRIP comme utilisé pour étudier la méthylationd’ARNde m 5 C dans Arabidopsis17.

<table><tbody><tr><td>anticorps anti-m5C</td><td>ZymoResearch</td><td>A3001 (discontinué), A3002 disponible</td><td>Clone 10G4 (discontinué), 7D21 disponible</td></tr><tr><td>Puce et réactifs pour l’électrophorèse capillaire</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td>RNA 6000 Nano kit</td></tr><tr><td>Dnase</td><td>Ambion</td><td>AM1907</td><td>TURBO Kit sans ADN</td></tr><tr><td>Co-précipitant d’acides nucléiques</td><td>Ambion</td><td>AM9515</td><td>Glycoblue, 15 mg/mL</td></tr><tr><td>Kit de transcription in vitro</td><td>Promega</td><td>P1300</td><td>T7 Système de production d’ARN à grande échelle RiboMAX</td></tr><tr><td>Tubes réactionnels à faible liaison</td><td>Kisker Biotech</td><td>G017</td><td>Tubes de microcentrifugation de 1,7 ml</td></tr><tr><td>Protéines G Billes magnétiques</td><td>Invitrogen</td><td>10003D</td><td>Dynabeads Protéine G</td></tr><tr><td>Protéinase K</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td>20mg/mL solution mère, grade</td></tr> <tr>ARN<td>Inhibiteur de la RNase</td><td>Promega</td><td>N2615</td><td>RNasin Plus 40 U/&mu ; l</td></tr><tr><td>kit d’élimination de l’ARNr</td><td>Epicentre</td><td>RZPL11016</td><td>Kit d’élimination de l’ARNr Ribo-Zero (Feuille de plante)</td></tr><tr><td>Tubes de sonication</td><td>Covaris</td><td>520045</td><td>microtube AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm</td></tr><tr><td>réactif d’extraction d’ARN</td><td>Ambion</td><td>15596018</td><td>TRIzol reagent</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Machine d’électrophorèse capillaire</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td>2100 Bioanalyzer System</td></tr><tr><td>Rack magnétique</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>DynaMag-2</td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>abandonné</td><td>modèle 5417R Rotator</td></tr><tr><td></td><td>Benchmark</td><td>R4040</td><td>RotoBot Mini</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Covaris</td><td>500217</td><td>S220 Spectrophotomètre</td></tr> <tr><td></td><td>à ultrasons focalisésThermoFisher Scientific</td><td>ND-ONEC-W</td><td>NanoDrop OneC</td></tr><tr><td>Bain</td><td>d’eau GFL</td><td>1012</td><td>1012 Bain d’incubation</td></tr></tbody></table>

essai méthylé d’immunoprécipation d’arn pour étudier la modification m5c dans arabidopsis

Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis

Les modifications secondaires de base sur l’ARN, telles que m5C, affectent la structure et la fonction des molécules modifiées d’ARN. Immunoprécipitation et séquençage de l’ARN méthylé (MeRIP-seq) est une méthode qui vise à enrichir l’ARN méthylé et, en fin de compte, à identifier les transcriptions modifiées. En bref, l’ARN sonicated est incubé avec un anticorps pour les cytosines 5-méthylées et précipité avec l’aide des perles de protéine G. Les fragments enrichis sont ensuite séquencés et les sites potentiels de méthylation sont cartographiés en fonction de la distribution des lues et de la détection maximale. MeRIP peut être appliqué à n’importe quel organisme, car il ne nécessite aucune séquence antérieure ou de modifier les connaissances enzymatiques. En outre, outre la fragmentation, l’ARN n’est soumis à aucun autre traitement chimique ou de température. Cependant, MeRIP-seq ne fournit pas de prédiction à nucléotide unique du site de méthylation comme le font d’autres méthodes, bien que la zone méthylé puisse être réduite à quelques nucléotides. L’utilisation de différents anticorps spécifiques à la modification permet à MeRIP d’être ajusté pour les différentes modifications de base présentes sur l’ARN, élargissant ainsi les applications possibles de cette méthode.

Un schéma de la méthode est fourni à la figure 1. Les premières étapes critiques du protocole sont d’obtenir un ARN de bonne qualité (RIN ≥ 7) et de le sonifier à environ 100 fragments de nt. L’efficacité des deux étapes est examinée par une machine d’électrophoresis capillaire à base de copeaux. Dans la figure 2A, une course représentative d’un bon échantillon d’ARN est indiquée. L’échantillon est dilué 1:10 avant chargement sur la puce afin d’avoir une concentration qui est dans la gamme de détection du kit utilisé (5-500 ng/μL). Le même échantillon est également exécuté après la sonication et est indiqué dans la figure 2B. Remarquez la présence d’un pic uniforme déplacé vers la gauche du diagramme, à une taille d’environ 100 nucléotides. La concentration plus faible est causée à la fois par la perte d’ARN pendant la fragmentation, mais aussi par l’augmentation du volume des échantillons (60-100 μL, étape 1.7.1).
La qualité des échantillons IP et Mock peut être évaluée par qRT-PCR. À cette fin, les IVT à pointes servent de contrôles positifs et négatifs : l’IVT méthylé, où, dans toutes les positions cytosines il y a m5C, devrait être fortement enrichi dans l’échantillon ip; au contraire, l’IVT non méthylé ne devrait pas avoir de différence entre IP et Mock. Les amorces utilisées dans l’analyse qRT-PCR pour les deux IVTs de contrôle(EGFP et Renilla luciferase) sont répertoriées dans le tableau 1. En effet, comme le montre la figure 3, environ 80 % de l’IVT méthylé a été récupéré dans l’échantillon ip, et seulement environ 2 % dans le Simulacre. Pour le contrôle non méthylé, la récupération a été inférieure à 1 % dans les échantillons IP et Mock. Cela vérifie l’efficacité du MeRIP que les fragments d’ARN méthylés ont été précipités et enrichis, et est un bon indicateur que les échantillons peuvent être utilisés pour l’analyse en aval. En outre, l’enrichissement par pli de l’IVT non méthylé (ip/mock ratio) peut être appliqué comme seuil pour estimer l’importance de l’enrichissement dans les analyses qRT-PCR.
Après avoir aligné les lectures sur le génome (figure 4), les algorithmes d’appel de pointe décrits dans les étapes 3.4.1 et 3.4.2 sont appliqués pour identifier les fenêtres statistiquement significatives, enrichies dans les échantillons de propriété intellectuelle par rapport à l’entrée. Les séquences qui correspondent à ces fenêtres peuvent être utilisées plus loin, par exemple pour rechercher des motifs conservés liés à la méthylation11,17.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig01.jpg"> Figure 1 : Représentation schématique du protocole MeRIP-seq. Les échantillons d’ARN sont incubés avec un anticorps pour les cytosines 5 méthylés et les complexes sont abattus avec des perles magnétiques de protéine G qui capturent les anticorps avec l’ARN lié. Les échantillons d’ARN élucidés sont analysés par séquençage profond et qRT-PCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/61231fig01large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig02.jpg"> Figure 2 : Résultats représentatifs de l’analyse de la qualité des échantillons d’ARN. (A) Profil représentatif d’un échantillon de plante arn total qualifié. (B) Profil représentatif d’un échantillon d’ARN après sonication à 100 fragments de nt. Fichiers de sortie à partir d’un logiciel d’électrophoresis capillaire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/61231fig02large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig03.jpg"> Figure 3 : analyse qRT-PCR des IVTs de contrôle. Des transcriptions in vitro méthylées et non méthylés ont été employées comme contrôles positifs et négatifs de l’essai de MeRIP, respectivement. Après immunoprécipice, l’IVT méthylé est fortement enrichi dans l’échantillon ip (vert) mais pas dans l’échantillon Mock (sans anticorps anti-m5C; violet). L’IVT non méthylé n’a montré aucun enrichissement et aucune différence entre IP et Mock. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/61231fig03large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig04.jpg"> Figure 4 : Lire l’alignement avant et après le MeRIP autour d’une transcription représentative. Lit aligné sur une transcription spécifique dans l’échantillon d’entrée (rangée supérieure) et dans deux répliques IP (rangée moyenne et inférieure). La boîte noire montre une fenêtre enrichie identifiée de 50 nt de long basée sur macs243 et MeRIP-seq22 analyses d’appel de pointe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/61231fig04large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Cible</td>
			<td colspan="2">Paire d’amorce</td>
			<td colspan="2">Séquence de produit</td>
			<td>Longueur du produit</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">EGFP (egfp)</td>
			<td colspan="2">Pour: 5'- GGCAACTACAAGACCCGCCCC -3'</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">GGCAACTACAAGACCCGCGCCGAG GTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTG GTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTG GTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTG GTGA GTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGC GTGAACCGCATCGAGGAAGGGC GTGAACCGCATCGAGGAAGGGC GTGAACCG</td>
			<td rowspan="2">72 pb</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Rev: 5'- GCCCTTCAGCTCGATGCGGTT -3'</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Renilla luciferase</td>
			<td colspan="2">Pour: 5'- GGAGAATAACTTCTTCGTGGAAAC -3'</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">GGAGAATAACTTCTTCGTGGAAACC ATGTTGCCATCAAAAATCATGAGAA AGTTAGAACCAGAAGAATTTGCAGC AGTTAGAACCAGAAGAATTTGCAGC AGTTAGAACCAGAAGAATTTGCAGC AGTTA</td>
			<td rowspan="2">75 pb</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Rev: 5'- GCTGCAAATTCTTCTGGTTCTAA -3'</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Renseignements sur les amorces et les produits générés pour l’analyse qRT-PCR.
Recettes tampons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/Buffer%20Recipes%20MeRIP.xlsx" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>

L’essai méthylé d’immunoprécipitation d’ARN est une méthode anticorps-basée employée pour enrichir pour des fragments méthylés d’ARN. Couplé à un séquençage profond, il conduit à l’identification des transcriptions portant la modification m5C.

Essai méthylé d’immunoprécipation d’ARN pour étudier la modification m5C dans Arabidopsis

Secondary base modifications on RNA, such as m5C, affect the structure and function of the modified RNA molecules. Methylated RNA Immunoprecipitation and ...

L’immunoprécipitation d’ARN méthylé, également appelée MeRIP, est une méthode conçue pour identifier les groupes méthylés dans des transcriptomes entiers. Il peut être adapté aux extraits d’ARN de nombreux organismes modèles. La méthode est simple, ne nécessite aucun traitement chimique sévère et peut être utilisée pour cartographier toute modification de l’ARN tant qu’une variable spécifique est disponible.Pour extraire l’échantillon d’ARN, broyez d’abord 200 milligrammes de l’échantillon de tissu végétal d’intérêt pour le réduire en poudre dans de l’azote liquide, en veillant à ce que le tissu reste congelé tout au long de la procédure. Ensuite, ajoutez un millilitre de réactif d’extraction d’ARN contenant du thiocyanate de guanidine et du phénol acide au tissu végétal broyé et mélangez bien par inversion, en vous assurant que tout le tissu est humide. Après 10 minutes à température ambiante, centrifugez les échantillons et transférez le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 millilitre.Ajoutez 200 microlitres de 1-bromo-3-chloropropane au surnageant et vortex vigoureusement l’échantillon. Séparez les phases par centrifugation et transférez environ 500 microlitres de la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. Ajoutez 500 microlitres d’isopropanol et 50 microlitres d’acétate de sodium à trois molaires à l’échantillon et mélangez bien par inversion.Incuber l’échantillon pendant 10 minutes à moins 20 degrés Celsius avant de précipiter l’ARN par centrifugation. Après avoir jeté le surnageant, lavez le granulé deux fois avec 500 microlitres d’éthanol à 80 % et une fois avec 500 microlitres d’éthanol à 99 %. Après le dernier lavage, séchez la pastille pendant cinq à 10 minutes avant de la dissoudre dans 30 microlitres d’eau sans RNase.Mesurez la concentration d’ARN sur un spectrophotomètre et digérez 20 microgrammes de l’échantillon d’ARN dans une solution d’eau et de tampon DNase. Après une incubation de 30 minutes à 37 degrés Celsius, utilisez un volume approprié de réactif d’inactivation de la DNase pour éliminer l’enzyme et vérifier la qualité et la pureté de l’ARN isolé par électrophorèse capillaire selon les protocoles standard. Si l’indice d’intégrité de l’ARN de l’échantillon digéré par la DNase est supérieur à sept, ajoutez au moins 12 microgrammes de chaque échantillon d’ARN dans un nouveau tube.Injecter 0,1 nanogramme de chaque transcrit in vitro préalablement préparé, un méthylé et un non méthylé, par trois microgrammes d’échantillon d’ARN et porter le volume final de chaque tube à 80 microlitres avec de l’eau sans RNase. Ensuite, soniser tout le volume de chaque échantillon d’ARN dans des tubes de sonication individuels et confirmer l’efficacité de la sonication et la concentration des échantillons d’ARN par électrophorèse capillaire. La taille moyenne de l’ARN fragmenté devrait être d’environ 100 nucléotides.Pour l’immunoprécipitation de l’ARN méthylé, ajoutez neuf microgrammes de chaque échantillon d’ARN soniqué et jusqu’à 60 microlitres d’eau sans RNase dans de nouveaux tubes individuels à faible liaison et chauffez l’ARN à 70 degrés Celsius dans un bain-marie pendant 10 minutes. À la fin de l’incubation, refroidissez les échantillons pendant 10 minutes dans un bain d’eau glacée et transférez 20 microlitres de chaque échantillon dans un nouveau tube à faible liaison pour un stockage à moins 80 degrés Celsius en entrée. Ajoutez de l’eau sans RNase aux 40 microlitres restants de chaque échantillon jusqu’à un volume final de 860 microlitres et divisez chaque échantillon en un tube à faible liaison pour l’immunoprécipitation et un tube à faible liaison comme échantillon fictif.Ajoutez 50 microlitres de tampon 10X MeRIP et 10 microlitres d’inhibiteur de RNase à chaque échantillon. Ensuite, ajoutez 10 microlitres d’anticorps anti-M5C dans les tubes d’immunoprécipitation et 10 microlitres d’eau dans les tubes fictifs. Scellez les tubes avec du parafilm et incubez les échantillons pendant 12 à 14 heures à quatre degrés Celsius avec rotation aérienne.Le lendemain matin, ajoutez 40 microlitres de billes dans un tube de 15 millilitres par échantillon. Lavez les billes en trois lavages de cinq minutes avec 800 microlitres de tampon MeRIP et une rotation aérienne par échantillon et par lavage, en recueillant les billes sur un aimant après chaque lavage pour permettre de jeter le tampon. Après le troisième lavage, remettre les billes en suspension dans 40 microlitres de tampon MeRIP frais par échantillon et ajouter 40 microlitres de billes remises en suspension à l’immunoprécipitation et aux tubes d’échantillon fictifs pour une incubation de deux heures à quatre degrés Celsius avec rotation aérienne.À la fin de l’incubation, placez les tubes sur une grille magnétique pendant une minute avant de jeter soigneusement le surnageant sans déranger les billes. Lavez les billes cinq fois dans 700 microlitres de tampon MeRIP complété par 0,01 % de Tween-20 pendant 10 minutes par lavage à température ambiante avec rotation aérienne. Après le dernier lavage, mettez les billes en suspension dans 200 microlitres de tampon de digestion protéinase K et 3,5 microlitres de protéinase K pour une incubation de trois heures à 50 degrés Celsius avec agitation à 800 tours par minute.À la fin de l’incubation, extraire l’ARN avec 800 microlitres de réactif d’extraction d’ARN et le protocole d’extraction acide de thiocyanate de phénol chloroforme de guanidinium tel que démontré. Après l’extraction, mettez en suspension la pastille d’ARN extraite dans exactement 20 microlitres d’eau sans RNase. Cette figure montre une analyse représentative d’un bon échantillon d’ARN.Dans le même échantillon après sonication, la présence d’un pic uniforme décalé vers la gauche à une taille d’environ 100 nucléotides peut être observée. La concentration plus faible est causée à la fois par la perte d’ARN lors de la fragmentation et par l’augmentation du volume de l’échantillon. La qualité de l’immunoprécipitation et des échantillons simulés peut être évaluée par PCR quantitative par transcriptase inverse.Dans cette analyse représentative, environ 80 % du transcrit in vitro méthylé a été récupéré dans l’échantillon d’immunoprécipitation, tandis que seulement environ 2 % ont été récupérés dans l’échantillon fictif. Pour le témoin non méthylé, le taux de récupération était inférieur à 1 % dans les échantillons d’immunoprécipitation et les échantillons fictifs. Après un séquençage approfondi et l’alignement des lectures sur le génome, des algorithmes d’appel de pics peuvent être appliqués pour identifier les fenêtres statistiquement significatives qui sont enrichies dans les échantillons d’immunoprécipitation par rapport à l’entrée.À l’aide des données de séquençage, nous pouvons identifier le motif auquel la méthylation de l’ARN se produit le plus souvent et ce motif peut servir d’appât pour faire tomber des protéines de liaison spécifiques.

methylated-rna-immunoprecipitation-assay-to-study-m5c-modification

Research

Recherche

JoVE Journal

Genetics

Génétique

L'imprinting est un phénomène dans l'usine et la reproduction des mammifères. Méthylation de l'ADN joue un rôle important dans les mécanismes de l'empreinte. Isoler l'endosperme et la détermination du statut de méthylation de gènes soumis à empreinte dans...

Détermination de méthylation de l&#39;ADN des gènes soumis à empreinte dans les Arabidopsis Endosperme

Une approche fiable et utile pour détecter les modifications des histones sur les gènes de plantes spécifiques est décrite. L'approche combine immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) et en temps réel de PCR quantitative. Elle permet la détection des modifications des histones sur des gènes spécifiques avec un rôle dans divers processus physiologiques.

Détection des modifications des histones dans les feuilles des plantes

Immunoprécipitation de la chromatine est une technique puissante pour l'identification des sites d'ADN d'Arabidopsis protéines de liaison in vivo. Cette procédure comprend la réticulation de la chromatine et la fragmentation, une immunoprécipitation avec des anticorps sélectifs contre la protéine d'intérêt, et l'analyse qPCR de l'ADN lié. Nous décrivons un test simple de ChIP optimisé pour les plantes d'Arabidopsis.

Immunoprécipitation de la chromatine test pour l&#39;identification de Arabidopsis interactions protéine-ADN<em&gt; In Vivo</em

Une méthode Northern Blot modifiée pour mesurer N6- -methyladenosine (m 6 a) des modifications dans l' ARN est décrite. La méthode actuelle peut détecter des modifications dans divers ARNs et des contrôles en vertu de divers modèles expérimentaux.

Une méthode pour l&#39;ARN de mesure<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Modifications dans les cellules et de tissus

Nouvellement découvert des formes oxydées de la 5-méthylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5FC) et 5-carboxylcytosine (5caC) peut-être représenter des modifications d’ADN distinctes avec des rôles fonctionnels uniques. Un workflow semi quantitatif pour la visualisation de la répartition spatiale des oxi-mCs, profilage d’intensité de signal et colocalisation est décrit ici.

Immunostaining des Modifications de l’ADN : Computational Analysis of Images confocales

Nous décrivons ici un protocole pour la caractérisation biochimique de l’enzyme de RNA-modification de la levure, Mod5 et discuter de comment ce protocole pourrait être appliqué à d’autres enzymes de modification des RNA.

Un test In Vitro pour détecter l’activité ARNt-isopentényl transférase

Ici, un analyse in vitro sans anticorps pour l'analyse directe de l'activité de méthyltransferase sur l'ARN synthétique ou in vitro transcrit est décrit.

Analyse d'activité sans anticorps pour l'analyse de l'activité de méthyltransferase d'ARN

Le rôle des modifications de l’ARN dans les infections virales commence tout juste à être exploré et pourrait mettre en évidence de nouveaux mécanismes d’interaction viral-hôte. Dans ce travail, nous fournissons un pipeline pour étudier les modifications de l’ARN m6A et m5C dans le contexte des infections virales.

Explorer les épitranscriptomes m6A et m5C lors d’une infection virale : un exemple avec le VIH

Ce protocole fournit un flux de travail facile à suivre pour effectuer la purification de l’ARN poly(A), la conversion du bisulfite et la préparation de la bibliothèque à l’aide d’un équipement normalisé pour un échantillon biologique d’intérêt.

Enrichissement de la bibliothèque d’ARNm et de bisulfite-ARNm pour le séquençage de nouvelle génération

Ici, nous présentons un protocole pour évaluer semi-quantitativement les niveaux globaux de m⁶A en utilisant le blot de points. L’ARN total est extrait, dénaturé, taché sur une membrane en nylon, sondé avec un anticorps anti-m⁶A, et visualisé par chimiluminescence. L’intensité du signal, quantifiée par l’analyse en niveaux de gris ImageJ, reflète l’abondance relative de méthylation, offrant un flux de travail reproductible pour la recherche.

Essai par blot de points pour détecter les niveaux globaux de modification de l’ARNde la N 6-méthyladenosine

Ce protocole fournit une approche détaillée pour évaluer les niveaux de modification de m6Ad’ARN spécifique à l’aide de MeRIP-qPCR.

Test MeRIP-qPCR pour détecter les niveaux de modification m6A d’ARN spécifique dans les cellules d’ostéosarcome

Découvrez l'essai méthylé d'immunoprécipation d'ARN (MeRIP) pour identifier les transcrits modifiés en m⁵C dans Arabidopsis. Cette méthode combine immunoprécipitation et séquençage profond pour étudier les méthylations de l'ARN.

Essai méthylé d’immunoprécipation d’ARN pour étudier la modification m⁵C dans Arabidopsis

Explorer plus de vidéos