Name: Imagerie in vivo longitudinale et quantification des îlots pancréatiques humains Greffant et contribution des cellules hôtes dans la chambre oculaire antérieure (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Découvrez l'imagerie longitudinale in vivo des îlots pancréatiques humains greffés dans la chambre oculaire antérieure de souris. Cette méthode permet de surveiller la fonction et la viabilité des îlots avec une résolution subcellulaire.

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Cette étude a été soutenue par le Conseil suédois de la recherche, la zone de recherche stratégique Exodiab, Dnr 2009-1039, la Fondation suédoise pour la recherche stratégique Dnr IRC15-0067 à LUDC-IRC, la Royal Physiographic Society à Lund, Diabetesförbundet et Barndiabetesförbundet.

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Une méthode est présentée pour étudier le processus de greffe de cellules d’îlot pancréatique humaine en observant la participation du tissu de destinataire et de donneur. Après une chirurgie invasive minimale implantant des îlots humains dans la chambre antérieure d’un œil de souris immunodéficient, la souris récupère rapidement dans les minutes qui s' adressent à la chirurgie. La procédure est effectuée sur un œil. En général, à partir de 5 à 7 jours après l’implantation, la cornée est suffisamment guérie pour effectue...

Le diabète sucré décrit un groupe de maladies métaboliques caractérisées par des niveaux élevés de glucose sanguin comme résultats de la production insuffisante d’insuline de la perte ou du dysfonctionnement des cellules bêta d’îlot pancréatique, souvent accompagnés par la résistance à l’insuline. Le diabète de type 1 (T1D) et le diabète de type 2 (T2D) sont des maladies complexes dans lesquelles le dysfonctionnement progressif des cellules bêta provoque le développement de la maladie. Le T1D est précipité par une attaque auto-immune sur les cellules bêta, tandis que le T2D est considéré comme étant motivé par des facteurs métaboliques, bien qu’avec des preuves croissantes de l’inflammation systémique de qualité basse1. La transplantation d’îlots humains donneurs, en particulier pour les patients atteints de T1D, offre le potentiel de fournir un contrôle glycémique physiologique. Cependant, une pénurie de donneurs de tissus et une mauvaise engreffement d’îlots a empêché la transplantation d’îlots de devenir une option thérapeutique courante. Une proportion substantielle de la greffe fonctionnelle d’îlot est perdue dans la période immédiate de posttransplantation (24–48 h) due à l’environnement d’hôte hypoxique, inflammatoire, immunogénique2,3. Pour évaluer l’efficacité des méthodes d’intervention pour l’amélioration de la survie des îlots, un suivi continu de ces transplantations est nécessaire.
In vivo techniques pour l’image et le suivi du sort des îlots pancréatiques humains transplantés après la transplantation reste un défi pour la recherche sur le diabète4,5. À ce jour, les techniques d’imagerie non invasive, y compris la tomographie par émission de positrons (TEP), l’imagerie par résonance magnétique (IRM) ou l’échographie (US) présentent un potentiel de quantification et d’évaluation fonctionnelle des îlots transplantés dans des conditions expérimentales5. Toutefois, compte tenu de la petite taille des îlots, les mesures quantitatives effectuées par ces modalités souffrent d’une résolution insuffisante. La chambre antérieure de l’œil (ACE) comme site de transplantation pour l’observation est une solution d’imagerie non invasive prometteuse offrant effectivement une résolution spatiale plus élevée et une surveillance fréquente sur de longues périodes de temps6. Cette méthode a été exploitée avec succès pour étudier la biologie des îlots de souris (revue dans Yang et coll.7), les réponses immunitaires auto-immunes8, ainsi que la greffe d’îlot humain9,10.
Ici, la méthode de transplantation ACE est combinée avec une approche d’imagerie de 2 photons pour étudier la dynamique du processus d’engraftment de l’îlot pancréatique humain par des enregistrements continus et répétés sur des greffes d’îlots individuels pendant jusqu’à 10 mois après la transplantation. Les propriétés d’imagerie multiphoton de plus grandes profondeurs d’imagerie et de photobleaching global réduit et dommages de photo surmontent les limitations d’imagerie de la microscopie confocale11. La quantification de l’imagerie fluorescente comporte plusieurs étapes, y compris la préparation de l’échantillon d’îlots, la transplantation d’îlots, l’acquisition d’images, le filtrage d’images pour éliminer le bruit ou le fond des îlots, la segmentation, la quantification et l’analyse des données. L’étape la plus difficile consiste généralement à partitionner ou segmenter une image en plusieurs parties ou régions. Cela pourrait impliquer la séparation du signal du bruit de fond, ou le regroupement des régions de voxels en fonction de similitudes de couleur ou de forme pour détecter et étiqueter les voxels d’un volume 3D qui représente la vascularisation des îlots, par exemple. Une fois segmentées, les statistiques telles que la taille du volume d’objets sont généralement simples à extraire. Fourni est une méthode de quantification et d’extraction des données d’imagerie, telles que la segmentation et la visualisation des données. Une attention particulière est accordée à l’élimination de l’autofluorescence dans les îlots humains et à la distinction entre la vascularisation des îlots et la capsule d’îlot formant des cellules destinataires.

<table><tbody><tr><td>Appareil d’anesthésie, par exemple unité d’anesthésie U-400</td><td>Agnthos</td><td>8323001</td><td>utilisé pour l’anesthésie à l’isofluran pendant l’opération et</td></tr> <tr><td>la chambre d’imagerie d’induction 1,4 L</td><td>Agnthos</td><td>8329002</td><td>se connecter via une tubulure à l’interrupteur</td></tr> <tr><td>de routage de gaz</td> U-400 <td>Agnthos</td><td>8433005</td><td>se connecter via une tubulure à l’U-400</td></tr><tr><td>AngioSense 680 EX</td><td>Percin</td><td>Elmer NEV10054EX</td><td>agent d’imagerie injectable, utilisé pour l’imagerie des vaisseaux sanguins dans les greffes d’îlots de Langerhans humains</td></tr><tr><td>Assemblages de tubes d’aspirateur</td><td>Sigma</td><td>A5177-5EA</td><td>se connectent avec des pipettes capillaires tirées pour le prélèvement manuel des îlots de Langerhans</td></tr><tr><td>Buprénorphine (Temgesic) 0,3 mg/ml</td><td>Schering-Plough Europ&eacute ;</td><td>64022</td><td>fluide, pour soulager la douleur</td></tr><tr><td>Pipettes capillaires</td><td>VWR</td><td>321242C</td><td>utilisées avec les ensembles de tubes d’aspirateur</td></tr><tr><td>Dextran-Texas Red (TR), 70kDa</td><td>Invitrogen</td><td>D1830</td> agent <td>d’imagerie pour injection</td></tr><tr><td>Canule oculaire, extrémité émoussée, 25 G</td><td>BVI Visitec/BD</td><td>BD585107</td><td>fabriqué sur mesure à partir du linéateur Tapered Hydrode [Blumenthal], dimensions : 0,5 x 22 mm (25G x 7/8 po) (45 ?), pointe effilée à 30 G ( 0,3mm)</td></tr><tr><td>Gel pour les yeux</td><td>Novartis</td><td></td><td>Viscotears, contient Carbomer 2 mg/g</td></tr><tr><td>Seringue Hamilton 0,5 ml, Modèle 1750 TPLT</td><td>Hamilton</td><td>81242</td><td>Seringue étanche aux gaz de type piston pour injection d’îlots</td></tr><tr><td>Support de tête</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Adaptateur de maintien de tête</td><td>Narishige</td><td>SG-4N-S</td><td>monté sur</td></tr> un <tr><td>masque à gaz</td> à plaque métallique<td>Narishige</td><td>GM-4-S-UST-2</td><td></td></tr> <tr><td>Joint universel solide</td><td>Narishige</td><td>UST-2</td><td>assemblé sur plaque</td></tr> <tr><td>métallique-Plaque métallique sur mesure pour l’assemblage</td><td></td><td></td><td></td> du porte-tête-Dumont</tr> <tr><td>#5, droit</td><td>Agnthos</td><td>0207-5TI-PS ou 0208-5-PS</td><td>fixé à UST-2 (sur mesure)</td></tr><tr><td>Coussin chauffant, fabriqué sur</td><td></td><td></td> mesure, <td>collé à la plate-forme stéréotaxique</td></tr><tr><td>Milieux de culture d’îlots humains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-CMRL 1066</td><td>ICN Biomedicals milieux de</td><td></td><td>culture cellulaire pour îlots</td></tr> <tr><td>humains-HEPES</td><td>GIBCO BRL-L-glutamin</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>GIBCO BRL-Gentamycine</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>GIBCO BRL-Fungizone</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>GIBCO BRL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>-Ciproxfloxacin</td><td>Bayer healthcare AG-Nicotinamide</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Sigma</td><td></td><td></td>Logiciel <td>d’analyse d’images</td></tr><tr><td></td><td>Bitplane</td><td></td><td>Imaris 9</td></tr><tr><td>Logiciel d’acquisition d’images</td><td>Zeiss</td><td></td><td>ZEN 2010</td></tr><tr><td>Lampe infrarouge</td><td>VWR</td><td>1010364937</td><td>utilisée pour garder les animaux au chaud dans la cage de réveil</td></tr><tr><td>Isoflurane Isoflo</td><td>Abott Fluide Scandinavia/Apotek</td><td></td><td>, pour l’anesthésie</td></tr><tr><td>Aiguille 25 G (0,5 x 16 mm), orange</td><td>BD</td><td>10442204</td><td>utilisé comme scalpel</td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri, 90mm</td><td>VWR</td><td>391-0440</td><td></td></tr><tr><td>2-Photon/microscope confocal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-LSM7 MP microscope vertical</td><td>Zeiss-Ti</td><td></td><td></td></tr><tr><td> :Sapphire laser Tsunami</td><td>Spectra-Physics, Mai Tai-lentille</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>longue distance de trempage à l’eau 20x/NA1.0</td><td></td> Zeiss-ET710<td></td><td></td></tr><tr><td>/40m (Angiosense 680)</td><td>Chroma</td><td></td> 288003-ET645<td></td></tr><tr><td>/65m-2p (TR)</td><td>Chroma</td><td></td> NC528423-ET525<td></td></tr><tr><td>/50 (GFP)</td><td></td>Chroma-ET610<td></td><td></td></tr><tr><td>/75 (tomate)</td><td>Chroma-faisceau</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>principal séparateur T680lpxxr</td><td>Chroma</td><td>T680lpxxr</td><td>Miroir dichroïque pour transmettre 690 nm et plus et réfléchir 440 à 650 nm taille 25,5 x 36 x 1 mm</td></tr><tr><td>Tube en polyéthylène (0,38 mm ID, 1,09 mm OD)</td><td>Smiths Medical Danmark</td><td>800/100/120</td><td>pour se connecter avec la seringue Hamilton et la canule oculaire</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Nikon</td><td></td><td>Modèle SMZ645, pour le prélèvement d’îlots</td></tr><tr><td><fort>Stéréomicroscope (Fluorescence)</fort></td><td></td><td></td><td>pour l’imagerie des greffes</td> d’îlots-AZ100</tr> <tr><td>Multizoom</td><td>Nikon</td><td></td><td>grand champ et longue</td></tr> <tr><td>distance-AZ Plan Apo 1x</td><td>Nikon-AZ</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Plan Apo 4x</td><td>Nikon-AZ-FL</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Epiflourescence avec lampe C-LHGFI HG</td><td>Nikon-HG</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Manuel Nouveau Intensilight</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>- Bloc de filtre EPI-FL TEXAS RED</td><td>Nikon</td><td></td><td>contient EX540-580, DM595 et BA600-660-Bloc</td></tr> <tr><td>de filtre Epi-FL G-2A</td><td>Nikon</td><td></td><td>(EX510-560, DM575 et BA590)</td></tr><tr><td>-Bloc de filtre Epi-FL B-2A</td><td>Nikon</td><td></td> <td>(EX450-490, DM505 et BA520)</td></tr><tr><td>-DS-Fi1 Appareil photo numérique couleur (5MP)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringue Nikon 1-ml, Omnitix</td><td>Braun</td><td>9161406V</td><td>pour injection de buprénorphine, utilisé avec une aiguille de 27 G</td></tr><tr><td>Ruban chirurgical</td><td>3M</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imagerie in vivo longitudinale et quantification des îlots pancréatiques humains greffant et contribution des cellules hôtes dans la chambre oculaire antérieure

Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the Anterior Eye Chamber

L’imagerie des cellules bêta est une étape clé vers la compréhension de la transplantation d’îlots. Bien que différentes plates-formes d’imagerie pour l’enregistrement de la biologie des cellules bêta aient été développées et utilisées in vivo,elles sont limitées en termes de résolution à cellule unique et d’enregistrements longitudinals continus. En raison de la transparence de la cornée, la chambre antérieure de l’œil (ACE) chez la souris est bien adapté pour étudier la biologie des cellules d’îlots pancréatiques humains et de souris. Voici une description de la façon dont cette approche peut être utilisée pour effectuer des enregistrements longitudinals continus de greffe et de revascularisation des greffes d’îlots humains individuels. Les greffes d’îlots humains sont insérées dans l’ACE, à l’aide de NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-souris en tant que receveurs. Cela permet l’étude de l’expansion des cellules de receveur par rapport aux donneurs et de la contribution des cellules bénéficiaires dans la promotion de l’encapsulation et de la vascularisation de la greffe. De plus, une approche étape par étape pour l’analyse de l’image et la quantification du volume de l’îlot ou de la vasculature segmentée et de la capsule d’îlot formant des cellules destinataires est décrite.

Des îlots humains non étiquetés ont été transplantés dans l’ACE du NOD femelle de 8 semaines. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-(NOD. ROSA-tomate. Rag2−/−) souris destinataires. Pour empêcher le rejet de tissu humain, les souris knock-out immunodéficientes de Rag2 ont été choisies comme destinataires. Chez ces souris transgéniques, toutes les cellules et tissus ont exprimé une protéine de fluorescence de tomate (mT) ciblée par membrane qui permet un...

Le but de ce protocole est de surveiller en permanence la dynamique du processus d’engraftage des îlots pancréatiques humains et des cellules d’hôte par rapport aux donneurs. Ceci est accompli en transplantant des îlots humains dans la chambre antérieure de l’oeil (ACE) d’un NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-receveur de souris suivi d’une imagerie répétée à 2 photons.

Imagerie in vivo longitudinale et quantification des îlots pancréatiques humains Greffant et contribution des cellules hôtes dans la chambre oculaire antérieure

Imaging beta cells is a key step towards understanding islet transplantation. Although different imaging platforms for the recording of beta cell biology ...

L’ACE est un spectacle d’imagerie optimal. Il prend en charge de le répéter dans l’imagerie in vivo à long terme des cellules d’îlots afin d’étudier leur fonction et leur viabilité dans une situation de greffe. Il peut également être étendu pour étudier d’autres aspects dans des conditions physiologiques et pathologiques en temps réel.L’avantage de la technique ACE réside dans le fait que les mêmes îlots pancréatiques humains individuels peuvent être suivis de façon non invasive avec une résolution subcellulaire pendant une longue période de temps. Les taux de réussite de la thérapie de remplacement des cellules bêta continuent de s’améliorer. Cependant, l’évaluation de l’efficacité de la greffe d’îlot et de la survie in vivo, reste encore difficile.Cette méthode pourrait aider à évaluer et à optimiser les résultats des transplantations d’îlots. Cette approche ne se limite pas aux îlots pancréatiques seulement. Il est également bien adapté pour étudier les tissus affectés.Par exemple, dans les complications diabétiques, comme le glomeruli rénal ou des morceaux de foie, pour n’en nommer que quelques-uns. Pour commencer à placer la souris sur un coussin chauffant chaud, placez-la dans le porte-tête et placez-la sur le masque avant. Utilisez le pouce et l’index pour soulever légèrement la tête.Attachez-le avec les morceaux métalliques sur les côtés. S’assurer que les morceaux d’oreille fixent la tête directement sous les oreilles. Injectez subcutanément la solution de buprénorphine à l’arrière de la souris.Rétractez doucement les paupières de l’œil à transplanter à l’aide de forceps contondants. Sortez l’œil et fixez-le lâchement avec une pince à épiler recouverte d’un tube en polyéthène. Après avoir transféré les paupières dans une boîte de Pétri avec PBS, ramasser environ 20 à 30 îlots dans l’œil cannular.À l’aide d’une aiguille de calibre 25 vers le haut, insérez soigneusement la pointe dans la cornée et faites une seule incision latérale. Soulevez soigneusement la cornée avec la canule préchargée avec des îlots, et relâchez lentement les îlots dans l’œil. Rétractez lentement la canule et appliquez du gel pour les yeux sur l’œil.Après 10 minutes, retirer les forceps, en tenant la paupière et remettre l’œil à sa position normale. Pour l’imagerie des îlots humains implantés avec deux microscopies photons, placez la plate-forme du porte-tête sous le microscope et administrez le gel oculaire sur l’œil comme liquide d’immersion entre la cornée et la lentille. Placez l’œil sous l’objectif et l’image des îlots humains implantés tels que décrits dans le manuscrit du texte.Pour supprimer l’autofluorescence, allez à l’onglet traitement d’image, choisissez l’arithmétique du canal et tapez le canal un moins le canal deux. Cela crée un nouveau canal quatre. Renommez-le vasculature.Répétez ce processus et tapez le canal trois moins canal deux pour créer un nouveau canal cinq et renommer la tomate tout. Pour définir l’îlot créer manuellement une nouvelle surface et choisir de modifier manuellement dans l’assistant. Gardez le pointeur en mode sélectionné et en vue 3D.Et cliquez sur le volume pour visualiser les sections. Dans l’onglet dessin choisir le contour et cliquez sur dessiner pour commencer à dessiner des contours autour de la bordure de l’îlot, en commençant par trancher la position un. Ensuite, déplacez-vous vers une nouvelle position de tranche et répétez les contours de dessin.Terminer avec la dernière tranche sur le dessus de l’îlot et terminer en cliquant sur l’onglet créer la surface. Segment suivant, vasculature d’îlot et fluorescence de tomate d’îlot utilisant le masque d’îlot. Choisissez l’objet masque d’îlot précédemment défini, allez à l’onglet édition et cliquez sur le masque tous onglet, qui ouvre une nouvelle fenêtre.Choisissez le canal vasculature dans le menu dropdown de sélection de canal et activez les options du canal en double avant d’appliquer le masque. Constante à l’intérieur, à l’extérieur et mettre voxels surface extérieure à 0,000 qui crée un nouveau canal six. Renommer cette vasculature d’îlot de canal.Répétez les étapes précédentes et choisissez la tomate tout dans le menu de dropdown de sélection de canal, pour créer le nouveau canal, le renommer, tomate d’îlot. Créez ensuite une nouvelle surface dans le menu scène et choisissez la création automatique dans l’assistant. Définissez le canal source vers la vasculature d’îlot précédemment créée et choisissez la soustraction d’arrière-plan.Utilisez en option des filtres. Choisissez par exemple le volume et ajustez le filtre dans la fenêtre, qui peut supprimer certains objets de service. Finissez l’assistant et nommez le nouvel objet de surface, vasculature d’îlot.Dans l’îlot vasculature objet de service aller à l’onglet d’édition et cliquez sur le masque tous les onglets, qui ouvre une nouvelle fenêtre. Choisissez le canal de tomate d’îlot dans le menu de dropdown de sélection de canal et réglez des voxels en dehors de la surface à 10.000 qui crée un nouveau canal. Renommer ce canal islet tomate vasculature.Pour segmenter le signal fluorescent capsule tomate choisir l’arithmétique du canal dans l’onglet de traitement d’image et le canal de type sept moins canal huit créant le nouveau canal. Renommez-le capsule de tomate. Créez une nouvelle surface telle qu’elle a été décrite précédemment et choisissez des canaux sources, de la vasculature de tomate d’îlot ou une capsule de tomate dans l’assistant.Effectuez ensuite la soustraction de fond. Ouvrez le fichier de rétroscètement de l’îlot et créez une nouvelle surface. Dans l’assistant, choisissez la création automatique et définissez la région d’intérêt.Si nécessaire, ajustez le seuil en intensité absolue. L’objet de surface peut être cliqué sur ou hors tension, pour recouper avec l’intensité correspondante du canal. Une fois terminé fermer l’assistant.Enfin, effectuez la quantification, sélectionnez un objet de surface créé dans le menu scène et rendez-vous à l’onglet statistiques. Pour récupérer des données détaillées sur le volume, choisissez l’onglet détaillé et sélectionnez les valeurs et le volume spécifiques du menu dropdown. Pour récupérer la valeur totale du volume, allez à l’onglet détaillé et choisissez les valeurs moyennes.Ce protocole a été utilisé pour transplanter des îlots humains non étiquetés dans la chambre intérieure de l’œil de souris fluorescentes rouges femelles de huit semaines. Un logiciel d’imagerie interactif a ensuite été utilisé pour extraire des données quantitatives des images. Imagerie in vivo fluorescens, les greffes humaines d’îlot ont été compromises par l’interférence significative de l’autofluorescence de tissu qui n’a pas été observée dans les greffes d’îlot de souris.Pour améliorer le rapport signal/bruit, le canal d’autofluorescence a été soustrait. Ensuite, la limite de l’îlot appelé masque d’îlot et les canaux correspondants ont été définis manuellement. Enfin, la segmentation du signal de tomate dans la vasculature des paupières et la capsule des paupières et le rendu final de la surface ont été utilisés pour extraire des données quantitatives.Ici en tant que session longitudinale représentative d’imagerie de la même greffe humaine d’îlot à deux semaines, deux mois, cinq mois et huit mois après transplantation. Des images MIP de données brutes enregistrées à l’origine, d’images traitées après l’enlèvement de l’autofluorescence de l’îlot et d’un îlot segmenté sont affichées. Lors de l’injection de paupières, assurez-vous de précharger les îlots dans un petit volume et d’utiliser des bras souples à double lumière sur votre microscope stéréo, pour mettre en évidence l’espace de la chambre des yeux afin d’injecter avec succès les îlots dans l’ACE.Après l’imagerie in vivo, les yeux peuvent être fixés et étudiés plus avant pour la coloration des anticorps et l’histologie conventionnelle. Cette technique est très utile pour les études fonctionnelles des îlots humains individuels en temps réel et dans des conditions physiologiques, en particulier dans le contexte de la vascularisation, la viabilité et les études métaboliques.

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Imagerie in vivo longitudinale et quantification des îlots pancréatiques humains Greffant et contribution des cellules hôtes dans la chambre oculaire antérieure (Vidéo) | JoVE Journal

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