Essai cinétique à molécule unique à haut débit parallèle pour le clivage d’ADN spécifique au site

Ce protocole peut être appliqué à tout processus qui entraîne des ruptures d’ADN à double brin, donne des données quantitatives détaillées sur la cinétique. Bien que cette méthode ait une résolution molécule unique, elle mesure jusqu’à 1000 ADN en une seule expérience, fournissant ainsi de bonnes statistiques. L’application principale de cette méthode est d’étudier les mécanismes impliqués dans la liaison et la modification de l’ADN.

Par exemple, nous sommes intéressés à étudier la recherche de cibles d’ADN, qui est pertinente pour toutes les protéines liant l’ADN. Lorsque vous essayez cette technique pour la première fois, n’oubliez pas que les attaches à molécule unique sont délicates, et une fois la forme, doivent être manipulées avec soin. Une proportion appropriée de surfaces fonctionnalisées est essentielle.

Il ya quelques trucs pour faire le flux ainsi. En plus de changer de tubes d’échantillon pendant la collecte de données, la démonstration visuelle peut aider quelqu’un qui est nouveau dans cette procédure. Pour laver les feuillets de couvercle, placez-les dans des pots de coloration et soniquez-les avec de l’éthanol pendant 30 minutes.

Rincez-les soigneusement à l’eau déionisée et distillée, puis plongez-les dans un hydroxyde de potassium molaire et soniquez-les pendant 30 minutes de plus. Répétez la séquence de lavage, en vous assurant de rincer les feuillets de couvercle avec de l’eau après chaque lavage. Conservez les feuillets de couverture nettoyés dans des pots de coloration avec de l’eau.

Utilisez un rasoir propre pour couper des tubes de chargement et de sortie de huit centimètres de long, et insérez-les dans des trous dans une glissière en verre propre. Epoxy le tube et laisser guérir pendant cinq minutes pour le fixer. Appliquez du ruban adhésif à double face pré-coupé avec le motif du canal sur les glissières en verre, et lissez-le avec des forceps en plastique pour obtenir un bon joint.

Peler le support de la bande, et appliquer un glissement de couverture propre, le lisser avec les forceps. Ensuite, époxy le bord de la feuille de couverture pour sceller la cellule d’écoulement et le laisser guérir. Préparez l’ADN étiqueté pour l’attacher en effectuant pcr selon les instructions manuscrites.

Ensuite, purifier le produit PCR avec un kit de nettoyage PCR. Préparez 10 millilitres de tampon A et dégazez-le dans un dessiccateur sous vide pendant au moins une heure. Pour fonctionnaliser la cellule d’écoulement, injectez 25 microlitres d’anti-digoxigenin et de fragments fab dans PBS, dans le canal d’écoulement, à l’aide d’une pointe de chargement de gel pour s’insérer dans le tube PE60.

Incuber la cellule d’écoulement à température ambiante pendant 30 minutes. Après l’incubation, tirer 0,5 millilitres de tampon A à travers le canal avec une seringue, en prenant soin de ne pas introduire d’air dans le canal. Puis, montagne de la cellule d’écoulement sur un microscope inversé.

Branchez le tube de sortie à une pompe à seringues et mettez le tube d’entrée dans un tube de micro centrifugeuse contenant le tampon A.Tirez manuellement au moins 0,5 millilitres de tampon A pour rincer le système et amorcer la pompe. Laissez ensuite la pompe fonctionner à 10 microlitres par minute pendant au moins cinq minutes pour équilibrer le système. Vortex la bouteille de bouillon de perles, et pipette 1,6 microlitres des perles en 50 microlitres de tampon A, puis vortex à nouveau.

Placez les perles sur un séparateur magnétique et pipette sur le tampon. Suspendez-les en 50 microlitres de tampon A et vortexez-les. Après le dernier lavage, suspendre à nouveau les perles dans 100 microlitres de tampon A pour une concentration finale de 160 microgrammes par millilitre.

Préparer 480 microlitres de 0,5 substrat d’ADN étiqueté picomolaire dans le tampon A, et pipette 20 microlitres de suspension de perles dans l’ADN dilué. Déposer le mélange sur un rotateur pendant trois minutes. Après les trois minutes, chargez immédiatement l’échantillon dans le chenal à un débit de 10 microlitres par minute pendant 15 minutes, ou jusqu’à ce qu’une attache de perle suffisante soit observée.

Lavez le canal de toutes les perles libres en changeant le tube d’entrée à un tube frais de tampon A, et en le faisant circuler à 50 microlitres par minute pendant au moins 10 minutes ou jusqu’à ce qu’aucune perle lâche ne soit observée. Et il est utile d’utiliser une vanne en ligne pour couper le débit et changer le tube. Changer de tube en un seul mouvement lisse et s’assurer que les niveaux de liquide dans les tubes d’échantillon neufs et anciens correspondent pour éviter le flux arrière.

Avant de recueillir des données, préparez la concentration correcte de l’enzyme de clivage d’ADN et insérez le tube d’entrée dans l’échantillon. Abaissez l’aimant au-dessus de la cellule d’écoulement. Réglez la pompe pour injecter 80 microlitres d’échantillon à 150 microlitres par minute et commencer la collecte de données.

Une minute après la collecte des données, activez la pompe. Il est indiqué ici une image représentative des perles attachés avant et après la réaction. L’analyse des données a été effectuée pour quantifier le nombre de perles restantes attachés tout au long de la réaction de clivage.

Cette technique a été utilisée pour mesurer les taux spécifiques de clivage de l’ADN du site de Nde1 pour des concentrations de protéines allant de 0,25 à quatre unités par millilitre, et deux concentrations différentes de magnésium. Chaque condition a été reproduite au moins deux fois, avec quelques 100 à 1000 ADN attaché est par expérience. À des concentrations de protéines suffisamment faibles, le taux est proportionnel aux protéines et indépendant du magnésium.

Pour les concentrations élevées de protéines, le taux dépend du magnésium, mais indépendamment de la concentration en protéines. Lorsque vous essayez ce protocole, gardez à l’esprit que les bulles d’air dans le canal de tuyaux et d’écoulement peuvent exécuter l’expérience. Assurez-vous de ne pas laisser d’air dans les lignes pendant le changement de tube, et dégazer tous les tampons avant d’utiliser.

La méthode d’attache permet d’explorer l’effet de la tension dans l’ADN sur la réaction. Ceci peut être réalisé en variant la force d’aimant ou en appliquant le flux pendant la collecte de données.