Amplification isothermale à médiatographie en boucle pour le dépistage de Salmonella dans les aliments pour animaux et la confirmation de Salmonella de l’isolement culturel

Cette méthode LAMP de Salmonella a été incorporée dans le manuel d’analyse bactériologique de la FDA, à la fois comme méthode de dépistage dans les aliments pour animaux et comme méthode de confirmation pour tout isolat présumé de Salmonella. La méthode est rapide, fiable et robuste. Par rapport à la PCR, ses principaux avantages comprennent des tests rapides, une instrumentation simple, un faible taux de faux négatifs et un flux de travail flexible.

Le dépistage rapide d’agents pathogènes tels que la salmonelle joue un rôle important dans la détection rapide d’un produit potentiellement contaminé et peut prévenir les maladies ou les épidémies chez les humains et les animaux. Commencez par préparer des modèles d’ADN pour le test LAMP. Il existe deux types d’échantillons utilisés pour fabriquer des modèles d’ADN.

Pour préparer des modèles à partir d’échantillons d’aliments d’animaux, pesez aseptiquement 25 grammes d’échantillon d’aliments dans un sac filtrant stérile. Ajoutez 225 millilitres d’eau peptone tamponnée stérile dans le sac et incubez-le à 35 degrés Celsius pendant 24 heures. Après l’incubation, transférez un millilitre du côté filtré du sac dans un microtube à centrifuger.

Centrifugez le tube à 900 fois G pendant une minute. Transférez ensuite le surnageant dans un nouveau microtube de centrifugation. Centrifugez l’échantillon à 16 000 fois G pendant deux minutes.

Et pour jeter le surnageant, remettez la pastille en suspension dans 100 microlitres du réactif de préparation d’échantillon et chauffez-la à 100 degrés Celsius pendant 10 minutes dans un bloc de chaleur sec. Ensuite, refroidissez l’échantillon à température ambiante et conservez-le à moins 20 degrés Celsius. Le deuxième type d’échantillon pour ce test LAMP provient directement de cultures de salmonelles présumées.

Pour préparer des modèles d’ADN, transférez 500 microlitres d’une culture de salmonelle pendant la nuit dans un microtube à centrifuger et chauffez-le dans un bloc de chaleur à 100 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, refroidissez l’échantillon à température ambiante et conservez-le à moins 20 degrés Celsius. Pour éviter la contamination croisée, séparez physiquement les zones utilisées pour la préparation du LAMP Master Mix et l’ajout des matrices d’ADN.

Nettoyez les surfaces de travail avec de l’isopropanol et une solution dégradante d’ADN et d’ADN. Ensuite, nettoyez les pipettes et les porte-bandelettes de tube. Décongelez le Master Mix isotherme, le 10X Primer Mix, l’eau de qualité moléculaire, l’ADN de contrôle positif et les matrices d’ADN à température ambiante.

Allumez l’instrument LAMP et entrez les informations d’échantillon appropriées. Préparez le Master Mix LAMP selon les instructions du manuscrit, tourbillonnez et centrifugez-le brièvement, et distribuez 23 microlitres du Master Mix dans chaque puits d’une bande de tubes. Vortex tous les modèles d’ADN et centrifugez-les brièvement.

Ensuite, ajoutez deux microlitres de matrice d’ADN dans le puits approprié et fermez hermétiquement le puits. Retirez la bande tubulaire du support et effleurez-la pour vous assurer que tous les réactifs se sont accumulés au fond du tube. Chargez la bande tubulaire dans l’instrument LAMP et démarrez le fonctionnement de la lampe.

Pendant que la réaction LAMP est en cours, appuyez sur les onglets Température, Amplification et Recuit pour voir les changements dynamiques de divers paramètres pendant l’exécution du LAMP. Les résultats LAMP peuvent être visualisés sur le tableau de bord LAMP en temps réel ou à l’aide du logiciel LAMP. Pour interpréter les résultats sur le tableau de bord, ouvrez la série LAMP qui vous intéresse.

Observez les cinq onglets associés à chaque passage. Les onglets Profil et Température affichent les températures programmées et réelles dans les puits d’échantillon au fur et à mesure que la réaction LAMP se déroule. Les onglets Amplification et Recuit montrent les lectures de fluorescence et les changements de fluorescence pendant les phases d’amplification et de recuit respectivement.

L’onglet Résultats affiche la vue tabulaire des résultats LAMP qui peut être interprétée selon les instructions du manuscrit. La deuxième façon de visualiser les résultats LAMP est d’utiliser le logiciel LAMP. Pour interpréter les résultats à l’aide du logiciel, cliquez sur l’icône Ordinateur dans le panneau de gauche et accédez à l’emplacement du fichier pour charger l’exécution LAMP qui vous intéresse.

Observez les sept onglets associés à chaque passage. Les onglets Profil et Température affichent les températures programmées et réelles dans les puits d’échantillon au fur et à mesure que la réaction LAMP se déroule. Les onglets Amplification et Taux d’amplification affichent les lectures de fluorescence et les changements de fluorescence pendant la phase d’amplification.

Les onglets Recuit et Dérivé de Recuit montrent les lectures de fluorescence et les changements de fluorescence pendant la phase de recuit. L’onglet Résultats affiche une vue tabulaire des résultats LAMP. Il y a quatre colonnes intitulées Nom du graphique, Numéro du puits, Nom du puits et Valeur maximale.

Les dérivées d’ampère, de temps et de recuit des huit échantillons sont présentées. Les résultats peuvent être interprétés selon les instructions du manuscrit. Le tableau de bord LAMP et le logiciel LAMP peuvent être utilisés pour afficher les résultats du test.

Dans cette analyse LAMP, les échantillons S1 à S6 sont des dilutions en série dix fois plus élevées du sérovar ATCC 51741 de Salmonella enterica, allant de 1,1 million à 11 unités formant colonies par réaction. Le témoin positif, ou PC, est Salmonella enterica Serovar Typhimurium LT2 à 17 000 unités formant colonies par réaction, et le témoin sans matrice, ou NTC, est de l’eau de qualité moléculaire. Le puits NTC a un Tmax vierge et une température Aneal d’environ 81 degrés Celsius sur le tableau de bord LAMP, ainsi qu’une Tmax vide et une température de recuit vide dans le logiciel LAMP.

Le puits de contrôle positif a un Tmax de sept minutes et 45 secondes et une température de recuit d’environ 90 degrés Celsius sur les deux plates-formes. Les échantillons S1 à S6 ont un Tmax compris entre six minutes et 30 secondes et 12 minutes et 15 secondes, et une température de recuit d’environ 90 degrés Celsius, ce qui indique une détection positive. Le LAMP est très efficace et génère une grande quantité d’ADN.

Il est donc essentiel d’utiliser les meilleures pratiques de laboratoire pour prévenir la contamination croisée. Utilisez des pratiques similaires lors de la fabrication de vos modèles d’ADN, car les enrichissements à partir d’aliments animaux contaminés peuvent avoir des niveaux élevés de salmonelle. Le dépistage positif des échantillons d’aliments d’origine animale avec le LAMP doit être confirmé par l’isolement de la culture conformément aux procédures du manuel d’analyse bactériologique de la FDA.

Les échantillons négatifs peuvent être signalés comme tels. L’incorporation de cette méthode LAMP dans le manuel d’analyse bactériologique de la FDA ouvre la voie à une application plus large de cette technologie rapide, robuste et conviviale dans les tests de sécurité alimentaire.