Préparation et co-immunoprécipitation d’extrait de protéine de Caenorhabditis elegans

Ce protocole fournit une procédure étape par étape pour la collecte d’échantillons, la préparation d’extraits et l’immunoprécipitation pour la confirmation d’une extraction réussie de protéines et la détection de protéines co-immunoprécipitées d’intérêt. La préparation de l’extrait de protéine peut être effectuée pour un maximum de 24 échantillons et elle est compatible avec un certain nombre d’applications en aval, y compris l’immunoprécipitation et les expériences de réduction de l’ARN. Cette méthode peut être adaptée pour faciliter le test des interactions entre deux ou plusieurs protéines C. elegans endogènes, marquées de manière endogène ou surexprimées dans divers contextes génétiques.

La démonstration visuelle de ce protocole vise à familiariser les chercheurs avec la préparation d’extraits de protéines et l’immunoprécipitation, en espérant encourager ceux qui découvrent les techniques à les utiliser dans leurs recherches. Pour prélever un échantillon de vers, ensemencez d’abord des vers au stade mixte ou synchronisés sur des plaques de milieu de croissance de nématodes solides à la température requise et laissez les vers se développer jusqu’au stade souhaité. À la fin de l’incubation, utilisez un tampon M9 pour laver les vers dans un tube conique de 15 millilitres et granulez les vers par centrifugation.

À la fin de la centrifugation, retirez le surnageant et lavez les vers trois à cinq fois de plus dans un tampon M9 frais par lavage. Lorsque le surnageant n’est plus trouble, effectuez un dernier lavage avec de l’eau doublement distillée et transférez la pastille de ver en vrac dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Granulez les vers avec une centrifugation supplémentaire et jetez le surnageant restant pour obtenir une pastille de ver tassée.

Pour préparer l’extrait de la pastille de ver collectée, ajoutez un volume égal de tampon de lyse 2X glacé à une pastille recommandée de 300 microlitres et mélangez vigoureusement la suspension résultante. Faites tourner l’échantillon pour recueillir le mélange au fond du tube et transférez le contenu du tube dans un tube sans RNAse de 1,5 millilitre contenant des billes métalliques. Après avoir bien bouché le tube, placez l’échantillon dans un homogénéisateur de broyeur à billes à quatre degrés Celsius en veillant à ce que l’échantillon soit équilibré à l’intérieur de l’homogénéisateur.

Homogénéisez l’échantillon à la vitesse la plus élevée pendant quatre minutes avant de le transférer dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre sans billes. Faites tourner l’échantillon pour clarifier l’extrait de protéine et transférez le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 millilitre sur de la glace sans transférer le précipité blanc et trouble au sommet de l’échantillon. Réservez 10 microlitres de l’extrait clarifié pour déterminer la concentration totale en protéines selon les protocoles standard et diluez immédiatement l’échantillon à cinq ou 10 milligrammes de protéines par millilitre de tampon de lyse 1X glacé sur glace.

Pour l’immunoprécipitation de la protéine d’intérêt, réintroduisez d’abord les billes magnétiques en suspension par inversion et transférez 150 microlitres de la suspension de billes 50X dans un tube de 1,5 millilitre. Magnétisez les perles sur de la glace contre un support magnétique pendant environ une minute. Lorsque la solution est claire, jetez le surnageant.

Retirez le tube du support magnétique et lavez les billes avec trois volumes de 300 microlitres de tampon de lyse 1X. Après le dernier lavage, remettez les billes en suspension dans 150 microlitres de tampon de lyse glacé et transférez 75 microlitres de la suspension de billes sur deux milligrammes de l’échantillon d’extrait de protéine. Après une incubation d’une heure à quatre degrés Celsius avec une légère agitation, placez le tube d’échantillon dans l’aimant sur de la glace pendant environ une minute.

Lorsque les billes sont complètement magnétisées et que l’échantillon est clair, transférez le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 millilitre sans déranger les billes. Mettez de côté 10 % de l’échantillon pour l’analyse par transfert Western et ajoutez 20 microgrammes d’anticorps purifiés d’affinité au lysat pré-autorisé pour une incubation d’une heure à quatre degrés Celsius avec une légère agitation. À la fin de l’incubation, ajoutez les 75 microlitres restants de suspension de billes prélavées au mélange de lysat d’anticorps pour une incubation supplémentaire d’une heure à quatre degrés Celsius avec une agitation douce.

À la fin de l’incubation, replacez l’échantillon sur l’aimant pendant environ une minute. Lorsque les billes sont complètement magnétisées et que l’échantillon est clair, laver les billes contenant l’immunoprécipité trois fois dans 450 microlitres de tampon de lavage sur de la glace. Après le dernier lavage, remettez en suspension la pastille de bille dans 20 microlitres de tampon de chargement de gel de protéine bêta-mercaptoéthanol 2X SDS et faites bouillir l’échantillon à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Pour la détection des protéines immunoprécipitées par transfert Western, chargez l’échantillon de protéine dénaturée sur un gel SDS-PAGE sans transférer les billes et effectuez l’analyse par transfert Western selon les protocoles standard en utilisant les anticorps appropriés pour les protéines d’intérêt, puis détectez les bandes à l’aide de la chimiluminescence à base de peroxydase de raifort. Le protocole d’homogénéisation du broyeur à billes démontré est comparable en termes d’extraction de protéines totales aux méthodes basées sur le dounce pour l’extraction efficace des protéines nucléaires et cytoplasmiques. Dans cette analyse, il a été déterminé que les protéines Argonaute interagissent avec les membres de la famille des protéines GW182, formant les complexes de silençage induits par les microARN qui se lient aux ARN messagers cibles et répriment leur expression.

Les protocoles d’extraits et d’immunoprécipitation démontrés peuvent également être utilisés pour récupérer avec succès les co-immunoprécipités spécifiques d’ALG-1 et de HRPK-1. De plus, les tests de l’interaction ALG-1 :AIN-1 dans divers contextes génétiques ont révélé que HRPK-1 n’est pas nécessaire pour l’assemblage du complexe de silençage induit par le microARN ALG-1 :AIN-1. Il est important de s’assurer que l’extraction des protéines et l’immunoprécipitation sont effectuées à quatre degrés Celsius ou sur de la glace pour maintenir la stabilité des échantillons.

Cette préparation d’extrait protéique total est compatible avec les expériences d’immunoprécipitation des protéines et de réduction des microARN à l’aide d’un oligonucléotide complémentaire de microARN et facilite la collecte en aval des composants des protéines et de l’ARN.