Préparation de tissus cardiaques en forme de maille dérivés de cellules iPS humaines pour la réparation myocardique in vivo
9 juin 2020
Le protocole actuel génère des tissus cardiaques en forme de maille contenant des cellules cardiovasculaires dérivées de cellules souches pluripotentes induites par l’homme pour permettre l’étude de la thérapie d’implantation cellulaire pour les maladies cardiaques.
Ce protocole décrit une méthode noble et facile pour créer des tissus cardiaques conçus en forme de maille dérivés de parties du corps induites par l’homme et de cellules SOUCHES dérivées de cellules cardiaques. La flexibilité de la géométrie tissulaire et l’évolutivité de la fonction tissulaire préservée sont les principaux avantages de cette technique. Les ECTs implantés en forme de maille peuvent restaurer une structure cardiaque et fonctionner dans un modèle d’infarctus du myocarde du rat.
Confirmation de sa faisabilité pour une utilisation en thérapie régénérative cardiaque. Ces techniques nécessitent un traitement reproductible des cellules SOUCHES humaines et les compétences de culture tissulaire pour des résultats cohérents. Commencez par couper une feuille PDMS durcie à la taille appropriée pour permettre à la feuille d’être collée avec de l’adhésif en silicone pour fabriquer un plateau rectangulaire de 21 par 20,5 millimètres avec sept millimètres de long de 0,5 millimètre de large et 2,5 millimètres de haut poteaux rectangulaires à des positions décalées.
L’espacement horizontal entre deux lignes de poteaux doit être de 2,5 millimètres. Autoclave le plateau à 120 degrés Celsius pendant 20 minutes avant d’enduire le moule avec 1%Poloxamer 407 en PBS pendant une heure. Rincez ensuite soigneusement le moule avec PBS et placez le moule dans un puits d’une plaque de six puits.
Pour l’analyse de lignée, combinez les cellules du cardiomyocyte plus les protocoles endothelial et vasculaires de cellules murales. De sorte que la concentration finale de cellules murales est de 10 à 20% dans un nombre total de cellules de six fois 10 pour les six cellules par construction. Mélanger 133 microlitres de solution de collagène acid soluble rat tail type 1 et 17 microlitres d’Alkali Buffer à 17 microlitres de 10X Minimum Essential Medium sur glace.
Ajouter ensuite 67 microlitres de matrice membranaire de sous-sol à la solution de collagène. Ensuite, centrifugez les cellules et réutilisez la pastille dans 167 microlitres du milieu essentiel minimal de High Glucose Dulbecco complétés par du sérum bovin fœtal et des antibiotiques. Mélanger les cellules sur la solution matricielle sur la glace.
Versez ensuite soigneusement 400 microlitres de la suspension de matrice cellulaire sur le moule en tissu PDMS enduit de poloxamer 407. Incuber le mélange de matrice cellulaire dans un incubateur standard de culture cellulaire à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 60 minutes. Lorsque le tissu s’est formé, tremper soigneusement le moule avec quatre millilitres de milieu de culture ECT et retourner la plaque à l’incubateur de culture cellulaire pendant 14 jours.
Avant l’implantation ECT, vous avez stérilisé les forceps fins pour retirer soigneusement l’ECT des postes de chargement. Les moules de tissu peuvent être fabriqués avec divers modèles, longueurs de poteau et espacement de poteau pour générer différentes géométries finales d’ECT. Pour cette analyse, un moule avec des poteaux de sept millimètres de long avec des intervalles de 2,5 millimètres de large a été utilisé.
Poloxamer 407 empêche l’adhérence des cellules au moule et permet la formation d’une structure de maille caractéristique, après compactage rapide de gel en 14 jours. La structure est maintenue même après que l’ECT est libéré du moule. La construction en tissu fabriqué mesure environ 1,5 centimètre de large et 0,5 millimètre d’épaisseur.
Et la largeur de chaque faisceau dans le maillage est d’environ 0,5 millimètre en moyenne. Il est possible de générer un maillage de largeur finale de 3 centimètres ECT contenant 24 millions de cellules à partir d’un moule quatre fois plus grand avec la même conception de poteau décalé. Ce maillage plus grand ECT peut également être facilement retiré du moule et génère un acte de force local équivalent à la maille plus petite ECT.
Il est important de verser le mélange de matrice cellulaire uniformément dans le moule de tissu sans générer des bulles pour empêcher des défauts de sensation dans le gel final. Caractérisation fonctionnelle de l’entrepreneur. et les relations de quatrième fréquence peuvent être effectuées à l’aide de systèmes intégrés.
Notre but ultime est la traduction des paradigmes ECT en thérapies cliniques qui utilisent de grandes études précliniques animales.
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Aperçu
Ce protocole décrit une méthode nouvelle et simple pour créer des tissus cardiaques ingénierisés en forme de treillis à partir de cellules souches pluripotentes induites humaines. La technique permet d'étudier la thérapie par implantation cellulaire dans les maladies cardiaques, en particulier dans un modèle de rat d'infarctus du myocarde.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Génie tissulaire cardiaque
- Thérapie par cellules souches
- Médecine régénérative
Contexte
- Les tissus cardiaques ingénierisés peuvent restaurer la structure et la fonction cardiaques.
- Les cellules souches pluripotentes induites humaines constituent une ressource précieuse pour l'obtention de cellules cardiaques.
- La flexibilité de la géométrie du tissu est cruciale pour une implantation efficace.
- La reproductibilité dans le traitement des cellules souches est essentielle pour des résultats constants.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode pour créer des tissus cardiaques ingénierisés en forme de treillis.
- Évaluer la faisabilité de ces tissus dans le cadre d'une thérapie régénérative cardiaque.
- Étudier la restauration de la fonction cardiaque après implantation.
Méthodes utilisées
- Confection d'un plateau rectangulaire à l'aide de PDMS et d'un adhésif en silicone.
- Création de piliers destinés à supporter les tissus ingénierisés.
- Implantation de tissus cardiaques ingénierisés dans un modèle rat.
- Évaluation de la restauration de la structure et de la fonction cardiaques.
Résultats principaux
- Les tissus cardiaques ingénierisés en forme de treillis ont réussi à restaurer la fonction cardiaque.
- La méthode a démontré une évolutivité et une flexibilité dans la géométrie des tissus.
- Des résultats cohérents ont été obtenus grâce à un traitement reproductible des cellules souches.
- La technique est réalisable pour une utilisation en thérapie régénérative cardiaque.
Conclusions
- Ce protocole fournit une méthode fiable pour créer des tissus cardiaques ingénierisés.
- Des tissus en forme de treillis peuvent restaurer efficacement la fonction cardiaque dans un modèle d'infarctus du myocarde.
- L'approche présente un potentiel prometteur pour les futures thérapies régénératives cardiaques.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle dans l'industrie
Ce protocole permet une production à grande échelle de tissus cardiaques ingénierisés en forme de treillis à partir de cellules cardiovasculaires dérivées de cellules souches pluripotentes induites humaines, offrant une plateforme reproductible pour les stratégies de réparation myocardique. L'approche soutient l'évaluation préclinique de l'intégration tissulaire et du rétablissement fonctionnel dans des modèles de lésions ischémiques, comblant ainsi un manque critique en cardiologie régénérative. En fournissant un construct géométriquement ajustable et évolutif, elle facilite la dé-risquisation translationnelle des thérapies basées sur les cellules souches pour l'insuffisance cardiaque.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet d'évaluer des hypothèses thérapeutiques en analysant l'intégration structurale et fonctionnelle de cellules cardiaques dérivées de cellules souches pluripotentes induites humaines in vivo.
- Valeur opérationnelle : Fournit un format tissulaire standardisé et reproductible permettant des résultats précliniques cohérents d'une étude à l'autre.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Génère des métriques structurelles quantifiables (par exemple, alignement des faisceaux de myofibres, contraction synchrone) pour le développement de tests fonctionnels.
- Valeur opérationnelle : Permet une montée en échelle vers des constructions plus grandes (jusqu'à 3,0 cm), facilitant les tests de réponse-dose et de cohérence par lot.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Démontre la faisabilité de la restauration de la structure et de la fonction cardiaques dans un modèle de rat d'infarctus du myocarde, soutenant la dé-risquisation mécanistique.
- Valeur opérationnelle : Permet de passer de la découverte à la validation préclinique grâce à des protocoles standardisés d'implantation et d'évaluation fonctionnelle.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode positionne les ECT en forme de treillis comme une passerelle entre la découverte et le stade préclinique, permettant la vérification d'hypothèses en phase de découverte précoce et la validation fonctionnelle en stades précliniques grâce à une production de tissus scalable et reproductible.
- Biologie de la découverte : Facilite la clarification des voies biologiques et la détection des risques biologiques en permettant une évaluation contrôlée de l'intégration et de la fonction électromécanique des cellules cardiaques dérivées de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC).
- Triage : Fournit des tissus standardisés prêts à l'essai, avec des paramètres quantifiables (synchronie des battements, alignement) permettant la comparaison de composés ou de conditions expérimentales.
- Analyses : Offre des indicateurs structuraux et fonctionnels (dimensions du tissu, diamètre des myofibrilles, synchronie de la contraction) permettant des analyses comparatives entre différents groupes expérimentaux.
- Recherche translationnelle : Garantit une continuité entre la maturation in vitro et le rétablissement fonctionnel in vivo, appuyant ainsi les décisions d'avancement tenant compte des risques.
- Réutilisation institutionnelle : Met en place une technologie de plateforme adaptable à diverses géométries et échelles, favorisant la reproductibilité entre projets et l'efficacité des ressources.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Renforce la confiance prédictive en réduisant l'ambiguïté mécanistique concernant l'engraftement des cellules souches et leur contribution fonctionnelle à la réparation cardiaque.
- Valeur opérationnelle : Assure une standardisation et une reproductibilité grâce à des rapports cellulaires définis, une formulation de la matrice et une géométrie du moule normalisées.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'aller/arrêt en fournissant des données d'efficacité préclinique reproductibles, réduisant ainsi les risques biologiques en phase avancée.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des candidats à la régénération cardiaque selon la performance tissulaire validée et la reproductibilité.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en différenciation des iPSC humaines, en spécification de lignage cardiovasculaire et en techniques de culture tissulaire en 3D.
- Dépend de l'accès à un équipement de moulage en PDMS, à des capacités de stérilisation et à une manipulation précise des fluides pour le mélange matrice-cellules.
- Exige une standardisation inter-équipes des approvisionnements cellulaires, de la préparation de la matrice et des protocoles d'incubation afin d'assurer une reproductibilité entre les lots.
- Implique des ajustements à envisager lors du passage à des constructions plus grandes ou à des géométries alternatives, notamment en ce qui concerne la diffusion des nutriments et le couplage électrique.
- Est limité par la dépendance actuelle aux modèles rongeurs pour la validation fonctionnelle, nécessitant des systèmes précliniques plus vastes en vue d'une traduction clinique.
