Un modèle de Drosophila pour étudier la polyploïdisation induite par les plaies

Ce protocole peut être utilisé pour étudier la polyploïdisation induite par les plaies. Un processus de réparation des tissus de conservation, dans lequel les cellules se développent au lieu de se diviser dans la mouche des fruits adultes. Une simple plaie de perforation peut être faite pour induire la polyploïde dans l’épithélium de mouche en seulement deux jours.

La taille, le stratagème et l’organisation des cellules épithéliales peuvent ensuite être évalués facilement. Commencez par recueillir deux flacons contenant de 10 à 15 mouches de fruits femelles nouvellement fermées de la souche d’intérêt. Et le vieillissement des mouches dans les flacons d’aliments frais, avec environ cinq mouches mâles par flacon à 25 degrés Celsius, jusqu’à l’âge de trois à cinq jours.

Pour les plaies abdominales, à la fin de l’incubation, utilisez une seule goupille en acier inoxydable de 0,1 millimètre pour assembler plusieurs porte-goupilles, avec l’extrémité nette de chaque goupille arpentant. Anesthésier les fruits femelles vieillis vole sur un coussin de mouche de dioxyde de carbone sous un microscope stéréo. Et utilisez un pinceau pour organiser les mouches dans une rangée.

Le port de lunettes de sécurité, avec un porte-goupille dans une main et des forceps dans l’autre, utiliser les forceps pour positionner les mouches avec leur abdomen ventral face vers le haut. Ensuite, perforer la femelle adulte vole dans la région bleue épithéliale droite de la cible A4 de chaque côté de la ligne médiane ventrale remuer nuits et retourner les mouches blessées à la fiole de nourriture jusqu’à ce que le point de temps expérimental désiré après la blessure. Au point de terminaison expérimental, vérifiez la présence de la plaie et de la cicatrice dans chaque mouche anesthésiée sous le microscope stéréo et remplissez un puits d’un plat de dissection en verre de neuf puits avec la solution de Grace.

À l’aide d’une paire de forceps, saisir une mouche femelle blessée par le côté dorsal du thorax et submerger la mouche dans le puits de solution. D’autre part, utilisez une deuxième paire de forceps pour percer et enlever la cuticule dorsale en dessous de la cible A6, à l’arrière de la mouche des fruits. Si les organes internes ne sont pas extraits, appliquer une pression sur le côté dorsal de l’abdomen pour presser les organes restants.

Utilisez les forceps pour casser l’abdomen complet à la jonction du thorax au-dessus de la cible A2 et transférer l’abdomen vers un puits contenant environ 100 microlitres de la solution de Grace. Lorsque tous les abdomens ont été recueillis, réduire le volume de la solution de Grace dans la collection bien à 30 microlitres. Utilisez des forceps dans une main pour tenir le côté dorsal de l’abdomen vers le bas et utilisez l’autre main pour insérer la lame inférieure des ciseaux de printemps de Venise dans la cavité abdominale de chaque abdomen et couper le long de la ligne médiane dorsale jusqu’à ce que les abdomens soient complètement ouverts.

Ajouter 30 microlitres de la solution de Grace dans chaque zone de montage d’une plaque de dissectation sèche avec des broches de 4,1 millimètres par zone de montage abdominal et placer l’abdomen fileté dans la gouttelette de solution. Lorsque tous les abdomens ont été filetés et placés, épinglez les abdomens au plat sur les quatre coins dorsal. En prenant soin que les tissus sont couchés à plat sans déchirer ou trop tendu le tissu abdominal.

Remplacez ensuite la solution Grace par 30 microlitres, une solution fixative par zone de montage. Et placez une étiquette de ruban adhésif sur le fond de chaque plat pour marquer chaque groupe témoin et expérimental. Pour monter les échantillons de tissus volants.

Après coloration, utilisez des forceps pour dépiner les abdomens de la plaque de dissection sous le microscope stéréo. Et utilisez des forceps pour transférer chaque échantillon par son flanc dorsal en environ 30 microlitres de milieu de montage sur des glissements de couverture de verre individuels. Sous le microscope stéréo orienter le tissu abdominal de sorte que l’intérieur est orienté vers le bas vers le bas vers le glissement de couverture et utiliser des forceps pour tirer les abdomens orientés vers le bord de chaque gouttelette de médias.

Placez chaque feuillet de couvercle monté sur une glissière en verre étiquetée. Et utilisez un tissu de laboratoire pour enlever tout excès de support de montage. Ensuite, sceller les bords de la feuille de couverture avec du vernis à ongles clair et stocker les diapositives dans la boîte de diapositives à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que leur imagerie.

La protéine de jonction septate rapide trois qui étiquette les jonctions cellulaires, fournit un indicateur de si des perturbations de traitement se sont produites pendant la préparation. Les abdomens avec de grandes égratignures de zone non tachée qui perturbent la zone de la plaie, doivent être jetés et non inclus dans l’analyse. La réparation des plaies est complète lorsqu’une grande cellule multinucléée centrale recouvre la croûte de la plaie.

Les lacunes de plus de 10 micromètres sur la feuille épithéliale sont considérées comme des défauts dans la fermeture des plaies et la rééthélialisation. Dans cette analyse représentative utilisant des mouches avec l’activation inhibée de cellules mitotiques, 52% des blessures étaient incapables de former une feuille épithéliale continue au-dessus de la croûte de blessure. Cet essai de cicatrisation des plaies membranaires fournit plus d’informations dans la mesure du défaut de réparation de la plaie permettant de regrouper les défauts de rééthélialisation comme étant complètement ouverts, partiellement fermés ou complètement fermés.

Par exemple, dans cette expérience, l’inhibition de la polyploïdisation induite par les plaies par le blocage simultané de la réplication de l’enduit et de la fusion cellulaire, a causé à 92% des plaies épithéliales de rester complètement ouvertes. Tandis que l’activation du cycle de cellules mitotic a eu comme conséquence un défaut épithélial de fermeture de blessure. En outre, l’activité de cycle cellulaire a été détectée par incorporation de l’EDR analogique thymidine et le stratagème épithélial a été déterminé en mesurant directement la teneur en ADN nucléaire.

Lors de la dissécation de l’épithélium abdominal, prendre soin de ne pas toucher le tissu avec l’un des outils de disecting que cela va gratter l’échantillon. Après la dissection, la prolifération cellulaire, la mort cellulaire, la taille de l’incision de perte cellulaire ou les évaluations de la teneur en ADN nucléaire peuvent être effectuées pour mieux comprendre la polyploïdisation induite par les plaies. ou d’autres processus dans l’épithélium.