Name: Extraction rapide et rentable de l’ARN du tissu pancréatique rat (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Découvrez une méthode rapide et économique pour extraire l'ARN de tissu pancréatique de rat avec haute pureté. Cette technique optimise l'extraction à partir de petites quantités de tissu pour les analyses biologiques.

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La présente étude a été soutenue financièrement par l’Université des sciences médicales de Shiraz (subvention no 93-01-01-7178\03-07-2014). Nous remercions M. Zomorodian et M. Rostami du Département d’e-Learning en sciences médicales, de l’École virtuelle et du Centre d’excellence en e-Learning de l’Université des sciences médicales de Shiraz pour avoir modifié la vidéo.

L’approbation éthique de cette étude a été obtenue auprès de l’Université des sciences médicales de Shiraz (numéro d’approbation : 93-01-01-7178\03-07-2014).
REMARQUE : Utilisez des rats mâles Sprague-Dawley pesant 250 g. Placez le flacon contenant un morceau de tissu pancréatique immergé dans le réactif stabilisateur de l’ARN dans un réservoir d’azote liquide à -80 °C et utilisez une solution de réactif d’extraction d’ARN pour maintenir l’intégrité de l’ARN.
1. Ablation du tissu pancréatique du rat
<ol><li>Préparer la salle d’opération et placer tous les matériaux requis sous le capot.</li>
	<li>Stériliser tous les instruments chirurgicaux (pansements, forceps Brown-Adson, ciseaux Iris et ciseaux Littler) dans un four pendant au moins 4 h à 240 °C pour inactiver RNases15. Stériliser la surface de la place de chirurgie avec 70% d’alcool sous le capot.</li>
	<li>Injecter de la kétamine/xylazine à l’aide d’une seringue à insuline [80/8 mg/kg]. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie en pinçant les orteils du rat pour un manque de réponse.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de réactif de stabilisation de l’ARN dans le microtube approprié (2 mL) pour inhiber l’activation des endonuclées dans les tissus excisés.</li>
	<li>Placez immédiatement le rat sur le tableau chirurgical (éloignez-vous du chirurgien) pour une incision de milieu de ligne.</li>
	<li>Stériliser toute la surface abdominale avec 70% d’alcool et enlever les poils de rat à l’aide d’une tondeuse à cheveux avec des lames #40.</li>
	<li>Faites une incision en forme de V pour ouvrir l’abdomen de la zone pubienne aux pattes avant avec des forceps dressing, des forceps Brown-Adson, des ciseaux Iris et des ciseaux Littler.</li>
	<li>Retournez les organes abdominaux sur le côté gauche pour exposer le pancréas. Trouvez soigneusement le tissu pancréatique, qui se propage dans la cavité abdominale. Localiser la zone sous la rate pour trouver le pancréas sans être confondu avec le tissu adipeux.</li>
	<li>Retirez immédiatement 20-30 mg de pancréas de la cavité abdominale en moins de 2 min. Mettez le tissu enlevé dans le microtube de 2 mL rapidement et coupez-le avec un coupeur stérile pour pénétrer les tissus séparés avec le réactif de stabilisation d’ARN.</li>
	<li>Placez le microtube dans un réservoir d’azote pour geler immédiatement. Conservez le microtube dans un congélateur à -80 °C pendant 24 h16.</li>
	<li>Après 24 h, transférer les minuscules morceaux de tissus pancréatiques dans un récipient de glace.</li>
	<li>Injecter du chlorure de potassium (KCl) intracrardially pour l’euthanasie des rats après la chirurgie.</li>
</ol>2. Extraction de l’ARN
<ol><li>Stériliser la surface sous le capot avec 70% d’alcool.</li>
	<li>Mettez 1 mL du réactif d’extraction d’ARN, qui contient du guanidinium thiocyanate pour inhiber le RNase, dans le microtube stérile.</li>
	<li>Transférer le tissu pancréatique séparé sur le microtube. Transférer le microtube dans l’azote liquide pour le congeler immédiatement.</li>
	<li>Homogénéiser le tissu avec le sonicateur de sonde micro pointe à 4 °C réglé au niveau 20 pour 60 s sur et 5 s off.</li>
	<li>Incuber chaque échantillon homogénéisé pendant 5 min à 4 °C à l’aide de glace concassée pour permettre aux complexes de nucléoprotéines d’être complètement dissociés.</li>
	<li>Enrichir les échantillons avec 0,2 mL de chloroforme pour chaque 1 mL de réactif d’extraction d’ARN. Capez fermement le tube et secouez-le avec force pendant 15 s.</li>
	<li>Incuber le tube pendant 15 min sur la glace concassée (4 °C) pour séparer le réactif en trois phases.</li>
	<li>Faire fonctionner la centrifugeuse à 12 000 x g pendant 15 min à +2 à +8 °C. Transférez la phase aqueuse incolore sur un nouveau microtube.</li>
	<li>Ajouter 0,5 mL d’isopropanol à 100% à la phase aqueuse. Fermer le tube, puis l’inverser au moins 3 fois pour bien mélanger l’ARN.</li>
	<li>Incuber l’échantillon de 5 à 10 min sur une boîte froide (4 °C) pour permettre les précipitations d’ARN.</li>
	<li>Faire fonctionner la centrifugeuse à 12 000 x g pendant 15 min à +2 à +8 °C. Jetez le supernatant.</li>
	<li>Enrichissez chacun des tubes de centrifugeuse avec 1 mL d’éthanol à 75%.</li>
	<li>Laver la pastille d’ARN en inversant le tube au moins 3 fois.</li>
	<li>Faire fonctionner la centrifugeuse à 7 500 x g à +2 à +8 °C pendant 5 min. Jeter le supernatant pour retirer l’excès d’éthanol du granulé d’ARN par séchage à l’air.</li>
	<li>Re-suspendre le granulé d’ARN dans l’eau sans RNase traitée par diéthylpyrocarbonate (DEPC).</li>
	<li>Passer la solution à travers une pointe de pipette plusieurs fois pour dissoudre le granulé d’ARN. Ensuite, incuber la solution pendant 10-15 min à +65 °C.</li>
</ol>3. Évaluation de l’intégrité de l’ARN avec électrophorèse de dénaturation
<ol><li>Préparer le tampon de fonctionnement du gel : 50 mM NaAc (TRAITÉ DEPC) et 0,5 M EDTA (pH 8.0) en H2O traité par DEPC.</li>
	<li>Préparer un tampon de gel de formaldéhyde 5x (tampon de fonctionnement MOPS) : 0,1 M M. MOPS (pH 7,0), 40 mM NaAc, 5 mM EDTA (pH 8.0).<ol>
<li>Dissoudre 20,6 g de MOPS dans 800 mL de DEPC traité 50 mM d’acétate de sodium. Ajuster le pH à 7,0 avec 2 N NaOH. Ajouter 10 mL de DEPC traité 0,5 M EDTA (pH 8.0). Ajuster le volume de la solution à 1 L avec de l’eau traitée par DEPC.</li>
		<li>Filtrer la solution à travers un filtre de 0,2 μm et la garder à température ambiante à l’écart de la lumière pour la stérilisation. Le tampon devient jaune avec le temps s’il est exposé à la lumière ou s’il est autoclaved. Un tampon de couleur paille fonctionne bien, mais les plus foncés ne sont pas17.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer un gel agarose de 1,5 %18. Pour 50 mL, ajouter 0,75 g d’agarose et 31 mL de H2O. Micro-ondes la solution au micro-ondes pendant 1 min. Ajouter 9 mL de formaldéhyde et 10 mL de tampon en cours d’exécution MOPS 5x.</li>
	<li>Préparer les échantillons pour le gel. Mélanger ce qui suit dans un tube de microfuge stérile : ARN X μL (jusqu’à 30 μg) 2 μL de tampon de chargement de gel 5x 10 μL de formamide 4 μL de tampon en cours d’exécution MOPS 1 μL de 0,1 mg/mL EtBr 3 μL de formaldéhyde 5-x μL de DEPC-H2O</li>
	<li>Incuber les échantillons à 65 °C pendant 15 min et les refroidir sur la glace. Centrifugeuse pendant 5 s jusqu’à ce que tout le liquide soit déposé.</li>
	<li>Pré-exécuter le gel à 5 V/cm pendant 5 minutes.</li>
	<li>Chargez immédiatement les échantillons dans les voies du gel, puis submergez le gel dans un tampon de 1x gel-running de formaldéhyde. Courir à 3-4 V/cm19.</li>
</ol>

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</ol>

Aucun n’a été déclaré.

En biologie moléculaire, il est essentiel d’obtenir un ARN de haute qualité. La présence des enzymes ribonucléase dans les cellules et les tissus dégrade rapidement l’ARN et rend l’extraction complexe. RNases sont des enzymes stables fonctionnant sans aucun co-facteur. De petites quantités de RNase sont suffisantes pour détruire l’ARN. Lorsque le tissu pancréatique du rat est retiré de la cavité abdominale, il est nécessaire de désinfecter les instruments chirurgicaux par des détergents solides, les rincer soigneusement ...

Les données génétiques structurelles peuvent être transcrites à un produit fonctionnel par l’expression des gènes. L’analyse de l’ARN est utilisée pour découvrir des différences dans l’expression des gènes dans différentes conditions. Il existe un certain nombre de méthodes pour extraire les acides nucléiques comme suit : guanidinium thiocyanate, extraction par phénol-chloroforme, chromatographie à base de cellulose, extraction par matrices de silice, et anion-échange1,2.
Une détection adéquate de l’expression génique est influencée par l’intégrité de l’ARN isolé des tissus; par conséquent, il est essentiel d’évaluer l’intégrité de l’ARN isolé des tissus avant que d’autres tests ne soient effectués parce que des tests moléculaires complémentaires sur un ARN de mauvaise qualité peuvent compromettre les résultats des applications diagnostiques. Ainsi, l’ARN à haute intégrité est nécessaire pour les tests biologiques moléculaires avec différentes applications diagnostiques : RT-PCR quantitatif, micro-réseaux, test de protection ribonucléase, analyse de tache nordique, cartographie de l’ARN et construction de bibliothèque cDNA3,4.
L’ARN devient plutôt instable après avoir été longtemps conservé. Les longs fragments d’ARNm de plus de 10 ko sont particulièrement sensibles à la dégradation5,6. Ainsi, les chercheurs doivent tenir compte de divers facteurs qui influencent l’intégrité de l’ARN purifié. La pureté de l’ARN doit être protégée contre les RNases, les protéines, l’ADN génomique et la contamination par les inhibiteurs enzymatiques. En outre, le meilleur et acceptable rapport d’absorption de l’ARN aux UV (260/280) doit être dans la gamme de 1,8-2.0 avec une fragmentation minimale sur l’électrophorèse. Des techniques de laboratoire récemment développées ont permis aux scientifiques d’évaluer l’intégrité de l’échantillon d’analyse moléculaire plus pratiquement7,8.
Il est beaucoup plus difficile d’extraire l’ARN intact du tissu pancréatique que d’autres types de tissus en raison de la grande quantité de ribonucléases (RNases). Cependant, les méthodes d’extraction existantes, à savoir l’éjection rapide du tissu pancréatique de la cavité abdominale et l’homogénéisation à basse température pour entraver RNases, se sont avérées inefficaces7,8,9,10,11,12,13,14.
Le but de la présente étude expérimentale comparative est de modifier et de comparer les méthodes existantes pour déterminer les méthodes les plus efficaces. À cette fin, divers protocoles d’extraction de l’ARN ont été modifiés et comparés. Il visait spécifiquement à déterminer la méthode la moins coûteuse nécessitant une quantité minimale de tissu pancréatique.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Merck</td><td>116801</td><td>Allemagne</td></tr><tr><td>Atoclave</td><td>Teb Zaim</td><td></td><td>Iran</td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Sigma</td><td></td><td>Allemagne</td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Merck</td><td>107024</td><td>Allemagne</td></tr><tr><td>Eau traitée au diéthylpyrocarbonate (DEPC)</td><td>Sigma</td><td></td><td>Allemagne</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>sigma</td><td>60-00-4</td><td>Allemagne</td></tr><tr><td>Réservoir d’électrophorèse</td><td>Payapajoohesh</td><td></td><td>Iran</td></tr><tr><td>Eppendorf microTube</td><td>Extragene</td><td></td><td>Taiwan</td></tr><tr><td>EtBr</td><td>sigma</td><td>E 8751</td><td>Allemagne</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td>81870</td><td>Allemagne</td></tr><tr><td>Falcon Tube</td><td>Extragene</td><td></td><td>Taiwan</td></tr><tr><td>Formaldéhyde</td><td>Merck</td><td>344198</td><td>Allemagne</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Merck</td><td>344206</td><td>Allemagne</td></tr><tr><td>Homogénéisateur-sunicateur</td><td>Microson XL 2000</td><td></td><td>USA</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>sigma</td><td>19516</td><td>Allemagne</td></tr><tr><td>Chlorhydrate de kétamine</td><td>sigma</td><td>1867-66-9</td><td>Allemagne</td></tr><tr><td>Hotte à flux laminaire</td><td>Jal Tajhiz</td><td></td><td>Iran</td></tr><tr><td>Agitateur Mgnetic</td><td>Labrotechnik</td><td></td><td>USA</td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Allemagne</td></tr><tr><td>Embouts de micropipette</td><td>Extragene</td><td></td><td>Taiwan</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>sigma</td><td>85022106</td><td>Allemagne</td></tr><tr><td>Na AC</td><td>Merck</td><td>567422</td><td>Allemagne</td></tr><tr><td>NaOH</td><td></td><td>Merck 109137</td><td>Allemagne</td></tr><tr><td>Four</td><td>Teb Zaim</td><td></td><td>Iran</td></tr><tr><td>PH mètre</td><td>Knick</td><td></td><td>Germany</td></tr><tr><td>RNA Later/RNA stabilization réactif</td><td>Qiagen</td><td>76104</td><td>USA</td></tr><tr><td>Instrument chirurgical</td><td>Agn Thos</td> Seringues <td></td><td>de fabrication allemande</td></tr><tr><td></td><td>AvaPezeshk</td><td></td><td>Iran</td></tr><tr><td>TriPure réactif/réactif d’extraction d’ARN</td><td>Roche</td><td>11667157001</td><td>USA</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Labinco</td><td></td><td>Pays-Bas</td></tr><tr><td>Bain-marie</td><td>Memmert</td><td></td><td>Germany</td></tr><tr><td>zylazine</td><td>sigma</td><td>7361-61-7</td><td>Allemagne</td></tr></tbody></table>

extraction rapide et rentable de l’arn du tissu pancréatique rat

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

Indépendamment de la méthode d’extraction, l’extraction optimisée de l’ARN des tissus et des lignées cellulaires se fait en quatre étapes : 1) homogénéisation, 2) dénaturation efficace des protéines de l’ARN, 3) l’inactivation de la ribonucléase, et 4) l’élimination de la contamination de l’ADN, des protéines et des glucides. Cependant, il est très laborieux de maintenir l’intégrité de l’ARN quand il ya des niveaux élevés de RNase dans le tissu. L’autolyse spontanée rend très difficile d’extraire l’ARN du tissu pancréatique sans l’endommager. Ainsi, une méthode pratique d’extraction d’ARN est nécessaire pour maintenir l’intégrité des tissus pancréatiques pendant le processus d’extraction. Une étude expérimentale et comparative des protocoles existants a été réalisée en obtenant 20-30 mg de tissus pancréatiques de rat en moins de 2 minutes et en extrayant l’ARN. Les résultats ont été évalués par électrophorèse. Les expériences ont été réalisées trois fois pour la généralisation des résultats. L’immersion du tissu pancréatique dans le réactif de stabilisation de l’ARN à -80 °C pendant 24 h a donné un ARN à haute intégrité, lorsque le réactif d’extraction de l’ARN a été utilisé comme réactif. Les résultats obtenus étaient comparables aux résultats obtenus à partir de kits commerciaux avec fixations de colonne de spin.

Évaluation de l’intégrité de l’ARN dans le réactif d’extraction de l’ARN selon un protocole chirurgical courant et modifié sans réactif de stabilisation de l’ARN Des bandes inacceptables ont été observées après l’extraction de l’ARN avec le réactif d’extraction d’ARN d’un protocole chirurgical courant. La voie 1 montre l’ARN du foie comme un contrôle. La voie 2 montre l’état dégradé des bandes rRNA 28S/18S dans l’ARN total obtenu à partir d’un protocole chirurgical de routine. Lorsque la quantité de t...

La pureté et l’intégrité de l’ARN isolé est une étape essentielle dans les tests dépendants de l’ARN. Ici, nous présentons une méthode pratique, rapide et peu coûteuse pour extraire l’ARN d’une petite quantité de tissu pancréatique intact.

Extraction rapide et rentable de l’ARN du tissu pancréatique rat

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...

Salut tout le monde. Nous avons conçu, une méthode descriptive simple et rapide en classe pour l’extraction efficace d’ARN du tissu pancréatique. Le principal avantage de cette méthode est une procédure optimisée pour extraire l’ARN de la quantité minimale de tissu due à l’autolyse. Salut encore. Démonstration de la procédure sera faite par Sanaz Dastghaib, c’est mon étudiant au doctorat dans notre laboratoire au département de biochimie de l’Université shiraz des sciences médicales.First préparer le lieu de la chirurgie, mettre toutes les exigences sous le capot. Pour inactiver RNase stériliser tous les instruments de chirurgie dans un four. Injecter de la kétamine-xylazine intraperitoneally 80/8 milligramme par kilogramme. Ajouter 1 réaccélération de stabilisation cc.ARN dans le microtube approprié pour habiter l’activation de l’endonuclease dans les tissus existés. Placez immédiatement le rat sur le tableau chirurgical. Éloignez le chirurgien pour une incision de milieu de ligne. Ensuite, stériliser toute la surface abdominale avec 70% d’alcool pour enlever les poils de rat. Coupez la peau pour la chirurgie. L’incision de remodelage a été faite pour ouvrir l’abdomen de la zone p

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Biochemistry

Biochimie

Microdissection laser est une technique qui permet la récupération des cellules sélectionnées à partir des quantités infimes de parenchyme. Nous décrivons ici un protocole pour l'acquisition des îlots pancréatiques humains à partir de spécimens chirurgicaux être utilisés pour les études transcriptomiques. Notre protocole améliore l'autofluorescence intrinsèque des cellules bêta humaines, facilitant ainsi leur collection.

Protocole amélioré pour la microdissection laser d&#39;îlots pancréatiques humains à partir de spécimens chirurgicaux

Nous rapportons une procédure permettant d’isoler l’ARN avec une grande intégrité du pancréas de souris riche en ribonucléases.

Isolement de l&#39;ARN de souris Pancréas: un tissu de Ribonuclease riche

défis critiques pour le domaine de la recherche sur le diabète sont de comprendre les mécanismes moléculaires qui régulent la réplication β-cellules d'îlots et de développer des méthodes pour stimuler la régénération β-cellulaire. Ici une méthode de criblage à haut contenu pour identifier et évaluer l'activité de réplication favorisant β-cellulaire de petites molécules est présenté.

Un haut contenu<em&gt; In vitro</em&gt; Pancreatic Islet β-cellulaire Plateforme de découverte de la réplication

Nous présentons ici un protocole pour la détection de l'expression de microARN dans la membrane péritonéale de rat en utilisant une réaction quantitative en chaîne à la polymérase en transcription inverse quantitative en temps réel. Cette méthode est appropriée pour étudier le profil d'expression de microARN dans la membrane péritonéale de rat dans plusieurs états pathologiques.

Détection de l&#39;expression de microARN dans la membrane peritoneale des rats en utilisant une PCR quantitative en temps réel

Ce protocole d'isolement d'îlots a décrit une nouvelle voie d'injection de collagène pour digérer le tissu d'exocrine et une procédure simplifiée de gradient pour purifier les îlots des souris. Il s'agit de la digestion enzymatique, de la séparation/purification des gradients et de la cueillette manuelle des islets. L'isolement réussi peut donner 250-350 îlots de haute qualité et entièrement fonctionnels par souris.

Un protocole simple à haut rendement pour l'isolement des îlettes pancréatiques des souris

Nous présentons ici un protocole pour produire de l’insuline exprimant 3D pancreatoids murin de progéniteurs pancréatique flottant e10.5 dissocié et le mésenchyme associé.

Génération d’insuline exempte d’échafaudage, en trois dimensions exprimant Pancreatoids de souris progéniteurs pancréatique In Vitro

Nous décrivons une méthode pour isoler des cellules endocrines du pancréas embryonnaires, néonatals et postnatals suivies par séquençage de RNA unicellulaires. Cette méthode permet des analyses du développement de la lignée endocrine du pancréas, de la cellule hétérogénéité et transcriptomique dynamique.

Analyse transcriptomique unicellulaire de cellules endocrines pancréatiques de souris

Les cellules métaplasiques pancréatiques sont des précurseurs de cellules malignes à l’origine des tumeurs pancréatiques. Cependant, il est difficile d’isoler des cellules pancréatiques viables intactes. Nous présentons ici une méthode efficace de dissociation du tissu pancréatique. Les cellules peuvent ensuite être utilisées pour le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) ou pour la co-culture bidimensionnelle ou tridimensionnelle.

Dissection de tissu pancréatique pour isoler des cellules uniques viables

Cette étude a développé une méthode simplifiée pour extraire efficacement les îlots primaires fonctionnels et les cellules acinaires du pancréas de la souris, offrant un outil précieux pour étudier la communication intercellulaire dans la pathogenèse du diabète induit par la pancréatite aiguë.

Une méthode simple et rapide pour l’isolement simultané des îlots primaires et des cellules acinares pancréatiques primaires à partir de souris

Ce protocole décrit une méthode standardisée pour la prélèvement chirurgical, la digestion enzymatique et la purification par gradient de densité des îlots pancréatiques de rat Lewis, permettant des préparations à haut rendement et à haute pureté pour une utilisation directe dans des études de transplantation ou in vitro .

Isolement et purification des îlots pancréatiques à partir de rats de Lewis grâce à la digestion enzymatique et à la séparation par gradient de densité

Découvrez une méthode rapide et économique pour extraire l'ARN de tissu pancréatique de rat avec haute pureté. Cette technique optimise l'extraction à partir de petites quantités de tissu pour les analyses biologiques.

Extraction rapide et rentable de l’ARN du tissu pancréatique rat

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