Spécification du progéniteur hépatique à partir de cellules souches pluripotentes à l’aide d’un système de différenciation défini

Ce protocole fournit un système de différenciation hépatique dérivé de cellules souches qui offre un outil reproductible pour l’étude de la biologie du foie pour la recherche fondamentale et clinique. En combinant un protocole standardisé et facile à suivre avec des réactifs de culture prêts à l’emploi, ce système permet la production de progéniteurs hépatiques et de cellules hépatocytaires à grande échelle. Maintenez les cellules pluripotentes humaines à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone dans une boîte de 10 centimètres sur la laminine-531, en les nourrissant quotidiennement avec 10 millilitres de milieu de maintien des cellules souches par boîte.

Pour préparer des plaques de laminine 521, diluez la laminine 521 décongelée dans du DPBS glacé avec du calcium et du magnésium jusqu’à une concentration finale de huit microgrammes par millilitre. Ajoutez 250 microlitres de la solution de laminine dans chaque puits d’une plaque de 24 puits ou 50 microlitres dans chaque puits d’une plaque de 96 puits. Secouez doucement la plaque d’un côté à l’autre pour enrober uniformément les puits, puis scellez les plaques avec un film flexible semi-transparent et conservez-les à quatre degrés Celsius pendant la nuit.

Le jour de l’ensemencement cellulaire, réchauffez les plaques pré-enrobées dans un incubateur de culture cellulaire pendant 30 à 60 minutes. Aspirez la solution de laminine 521 et ajoutez un milieu d’entretien de cellules souches complété par 10 inhibiteurs micromolaires de ROCK dans chaque puits, puis remettez la plaque dans l’incubateur. Lorsque la fluidité de la numération cellulaire atteint 70 à 80 %, aspirez le milieu usagé de la boîte de culture et lavez chaque boîte de culture avec cinq millilitres de DPBS sans calcium ni magnésium à température ambiante.

Aspirez le lavage DPBS de la boîte de culture, puis ajoutez cinq millilitres de réactif de dissociation sans enzyme dans la boîte et incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant huit à 10 minutes jusqu’à ce que les cellules se détachent visiblement de la boîte. Détachez doucement les cellules de la boîte de culture à l’aide d’un grattoir cellulaire, puis pipetez le contenu de chaque puits de haut en bas avec une pipette sérologique de cinq millilitres pour obtenir une suspension de cellule unique. Pour chaque lignée cellulaire, regroupez les cellules de tous les puits d’entretien dans un tube stérile de 50 millilitres.

Lavez chaque boîte de culture vide avec cinq millilitres de ces milieux d’entretien des cellules souches et ajoutez les lavages dans le tube correspondant avec les cellules regroupées. Effectuez trois comptages de cellules viables sur chaque échantillon regroupé. Centrifugez les échantillons groupés à 250 x g pendant cinq minutes.

Ensuite, aspirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans un à trois millilitres à température ambiante comme milieu d’entretien des cellules souches complété par 10 inhibiteurs micromolaires de ROCK Y27632. Après avoir calculé le nombre de cellules nécessaires pour atteindre la densité d’ensemencement souhaitée, remettez les cellules en suspension à la concentration appropriée et distribuez-les dans les plaques pré-enduites. Le volume total par puits doit être d’un millilitre pour une plaque de 24 puits et de 0,1 millilitre pour une plaque de 96 puits.

Balancez doucement les plaques d’un côté à l’autre et d’avant en arrière pour assurer une dispersion uniforme des cellules et placez les plaques ensemencées dans l’incubateur, en les balançant d’avant en arrière et d’un côté à l’autre. Préparez les milieux pour l’induction définitive de l’endoderme et pour la différenciation ultérieure des spécifications des cellules progénitrices hépatiques, comme décrit dans le manuscrit du texte. Le premier jour de la différenciation, retirez le milieu usé des puits et remplacez-le par le milieu de la première étape.

Les deuxième, troisième et quatrième jours, retirez le milieu épuisé et nourrissez bien chaque puits avec le milieu de deuxième étape. Le cinquième jour, réparer les puits destinés à l’analyse définitive de la différenciation de l’endoderme. Pour les puits restants, retirez le milieu épuisé et alimentez chaque puits avec un milieu progéniteur hépatique de diff tige.

Le 10e jour, récoltez des cellules pour l’analyse de la différenciation des progéniteurs hépatiques ou procédez à une différenciation cellulaire supplémentaire de type hépatocyte. Pour caractériser les cultures de différenciation des progéniteurs hépatiques, utilisez l’immunocoloration pour détecter l’expression de marqueurs spécifiques définitifs de l’endoderme au cinquième jour et de marqueurs spécifiques des progéniteurs hépatiques au jour 10 et quantifier le pourcentage de cellules HNF4 alpha positives. Le 10e jour, mesurez également la sécrétion d’alpha-fœtoprotéine et d’albumine via ELISA.

Ce protocole a été utilisé pour différencier les cellules progénitrices hépatiques des cellules souches embryonnaires humaines et des cellules souches pluripotentes induites humaines. Au cinquième jour du protocole de différenciation, la spécification définitive de l’endoderme a été évaluée via l’expression de Sox 17. Dans les deux lignées cellulaires, Sox 17 était fortement exprimé avec 80 et 87,8 % de cellules positives pour H9 et P106, respectivement.

Au 10e jour, les progéniteurs hépatiques présentaient une morphologie semblable à celle d’un pavé. De plus, la spécification du progéniteur hépatique a été évaluée pour l’expression de HNF4 alpha, AFP, albumine et cytokératine 19. Les deux cultures progénitrices hépatiques exprimaient des marqueurs hépatiques fœtaux, tels que HNF4 alpha, AFP et CK 19.

La sécrétion d’alpha-fœtoprotéine a été détectée au jour 10 dans les deux lignées cellulaires, tandis que la sécrétion d’albumine n’a pas été détectée avec l’ELISA. La variabilité du nombre de cellules et l’efficacité de la différenciation des progéniteurs hépatiques ont été évaluées en quantifiant l’expression alpha de HNF4. Au jour 10, les progéniteurs hépatiques n’ont montré aucune variabilité significative entre les rangées avec plus de 95 et 97 % de cellules HNF4 alpha positives par puits pour H9 et P106, respectivement.

Une distribution cellulaire uniforme avant le début de la différenciation est essentielle pour assurer une population homogène de cellules progénitrices hépatiques. Pour ce faire, balancez doucement les plaques d’un côté à l’autre et d’avant en arrière pour assurer une dispersion uniforme des cellules. Les cellules progénitrices hépatiques produites par ce protocole peuvent être différenciées en cellules de type hépatocytes pour d’autres essais, offrant ainsi un outil reproductible et standardisé pour la modélisation de maladies ou le criblage de médicaments.