Échantillonnage et extraction sur place de tumeurs cérébrales pour l’analyse de la métabolomique et de la lipidomique

Ce protocole peut être utilisé pour effectuer une extraction à partir de tumeurs cérébrales dans ou à côté d’un serveur sur l’utilisation de fibres de microextraction de phase solide. Cette technique permet l’extraction de petites molécules directement à partir de tumeurs réséquées et offre l’occasion de diagnostics peropératoires rapides en coupant directement les dispositifs d’extraction à l’instrumentation analytique. Pour préparer le dispositif de microextraction de phase solide, coupez le codage de chaque sonde de dispositif de microextraction de phase solide avec le mode mélangé ou les revêtements C18 à une longueur appropriée selon la taille de la tumeur.

Et tremper les sondes et une solution d’eau de 50 50 méthanol pendant au moins une heure avant la collecte de l’échantillon. Ce protocole se concentre sur les tumeurs cérébrales, mais la stratégie peut être mise en œuvre pour le diagnostic de nombreux cancers différents. La technologie est entièrement portable, il n’y a donc pas besoin d’appareils supplémentaires.

Dès que possible après l’ablation de la tumeur immerger les fibres de la sonde avec de l’eau de qualité LCMS pendant cinq secondes avant d’insérer les fibres autant que possible dans l’échantillon de tissu tumoral du cerveau, pour s’assurer que toute la phase d’extraction est situé à l’intérieur de la tumeur. Laissez les sondes dans le tissu pendant exactement 30 minutes pour éliminer les sources d’erreur dues à la présence d’artefacts provenant de sources autres que la tumeur de l’échantillon, placez les fibres de sonde conditionnées sur la table pendant la même période de temps. Pendant l’extraction, étiquetez les flacons HPLC pour les utiliser pour le stockage des sondes après l’extraction.

À la fin de l’extraction, plonger les fibres dans de l’eau de qualité LCMS pendant trois secondes pour enlever tout débris sanguin ou cellulaire et insérer chaque sonde à travers le fond de la septa d’un seul bouchon de flacon HPLC pour immobiliser les fibres. Ensuite, capuchon les flacons avec les fibres immobilisées et placer les flacons dans un récipient de transport approprié. À l’arrivée du laboratoire, placez immédiatement les flacons dans un congélateur de moins 30 ou moins 80 degrés Celsius pendant au plus trois ou cinq ans respectivement.

Une fois que tous les échantillons d’une seule expérience ont été prélevés, placez les flacons contenant les fibres de mode mixte à température ambiante. et étiquetez deux flacons millilitres pour la désorption placez un insert en verre dans chaque flacon et ajoutez 300 microlitres de solution d’eau fraîchement préparée 80 20 acétyonitrile à chaque insert. Complètement immergé le codage de chaque sonde dans des flacons individuels du solvant de désorption et agiter les flacons pendant 120 minutes à 1200 révolutions par minute sur un vortex.

Une fois la désorption terminée, retirer les bouchons des flacons et réserver 10 aliquots microlitres de chaque fichier contenant de l’extrait de la tumeur pour préparer un échantillon de contrôle de la qualité. Fermez ensuite les flacons avec de nouveaux bouchons et placez les flacons dans l’échantillonneur automatique de quatre degrés Celsius d’un spectromètre de masse haute résolution de chromatographie liquide. Pour préparer les échantillons pour l’analyse lipidomique placer les flacons contenant les fibres C 18 à température ambiante et étiqueter deux flacons HPLC millilitres pour la perturbation place inserts en verre silanisé dans les flacons et ajouter 200 microlitres de 50 50 verres isopropanol fraîchement préparés solution de méthanol à chaque insert.

Immerger complètement chaque revêtement de sonde dans le solvant et agiter les échantillons pendant 50 minutes à 1200 révolutions par minute sur un vortex. À la fin du temps, arrêter la désorption en enlevant les bouchons, puis mettre de côté un aliquots de 10 microlitres de chaque fichier contenant de l’extrait de la tumeur pour préparer l’échantillon de contrôle de la qualité et fermer les flacons avec de nouvelles casquettes. Ensuite, placez les flacons dans l’échantillonneur automatique de quatre degrés Celsius du spectromètre de masse haute résolution de chromatographie liquide.

La reproductibilité de l’analyse instrumentale a été déterminée comme très bonne en fonction du regroupement serré des échantillons de contrôle de la qualité sur le tracé principal d’analyse des composants. Ces données lipidomiques pour des échantillons recueillis auprès de patients présentant des gliomes et des méningiomes mettent en évidence la capacité des échantillons de tumeur à être distingués en fonction de leur origine histologique et de la malignité. Comme l’illustrent ces données métabolomiques, les gliomes peuvent être divisés en fonction de leur degré de malignité et ou en fonction de la présence ou de l’absence de mutations d’intérêt.

L’analyse statistique permet également la sélection de composés spécifiques au sein des groupes étudiés. Il est essentiel de contrôler soigneusement le temps d’extraction et de maintenir des conditions reproductibles pour tous les échantillons. Alternativement, les échantillons peuvent être dissous de la fibre directement à Mme sans séparation chromatographique permettant l’analyse ciblée de marqueurs spécifiques et le raccourcissement de l’ensemble de la procédure à plusieurs minutes.