Un protocole amélioré pour purifier et directement mono-biotinylate recombinant BDNF dans un tube pour les études de trafic cellulaire dans les neurones

L’objectif global de cette procédure est de produire et de purifier l’oviducte BDNF dans un protocole optimisé impliquant la transfection des cellules HEK293 et la purification dans une colonne de chromatographie. L’oviducte BDNF est ensuite mono-biotinylated par une réaction in vitro pour l’étiquetage postérieur et la détection par microscopie de fluorescence. Le principal avantage de cette procédure est qu’elle permet la production, la purification et la mono-biotinylation de BDNF d’une manière optimisée.

Les paramètres de gestation ont été optimisés pour une production maximale de BDNF à l’aide d’un réaccente de transfection rentable et le processus de purification est effectué dans une configuration de chromatographie qui facilite la manipulation et permet d’escalader la procédure. Commencez par diluer 60 microgrammes de polyéthyllènenimine dans 500 microlitres de DMEM non upplémenté et 20 microgrammes de plasmide oviducte BDNF dans 500 microlitres de DMEM non dilué par plat de 15 centimètres à transfecter. Incuber pendant cinq minutes à température ambiante, puis pipette soigneusement la solution d’ADN dans un tube de polyéthyllènenimine, mélangeant une fois par mouvement de haut en bas.

Incuber pendant 25 minutes à température ambiante, puis égouttez un millilitre du mélange PEI/ADN dans chaque plat de 15 centimètres. Incuber les cellules avec le mélange PEI/ADN pendant trois heures, puis changer le milieu en tampon d’incubation. 48 heures après la transfection des cellules, recueillir le milieu de tous les plats.

Ajoutez ensuite les composants moyens BDNF au supernatant HEK293, y compris le chlorure de sodium, les composants tamponnés au phosphate, l’imidazole et les inhibiteurs de la protéase. Incuber dans la glace pendant 15 minutes. Puis aliquot le milieu dans des tubes de centrifugeuse.

Centrifugeuse pendant 45 minutes à 10 000 g dans une centrifugeuse d’or de 4 degrés Celsius. Cette étape permet l’élimination des débris cellulaires et des cellules mortes suspendues dans les médias. Ensuite, recueillir les supernatants.

Ajouter la BSA à une concentration finale de 0,1 % et conserver à moins 20 degrés Celsius jusqu’à deux mois. Pour purifier le BDNF, commencez par décongeler les médias dans un bain thermoréguléré de 37 degrés Celsius. Puis aliquot les médias dans des tubes de centrifugeuse.

Centrifugeuse pendant une heure à 3500 g dans une centrifugeuse d’or de 4 degrés Celsius. Cette étape permet d’éliminer les débris restants afin d’assurer un débit adéquat à travers la colonne de chromatographie. Ensuite, utilisez les concentrateurs de protéines pour réduire le média de 500 millilitres à 100 millilitres.

Suivez les paramètres de centrifugation recommandés par le fabricant pour une concentration optimale. Ajoutez ensuite 500 microlitres de perles d’agarose nickel-NTA aux médias concentrés et incubez pendant la nuit dans un rocker à quatre degrés Celsius. Le lendemain, assemblez l’appareil de chromatographie et versez-y les médias.

Laissez reposer pendant cinq minutes, puis ouvrez la bite d’arrêt dans les deux sens pour laisser passer le milieu. Laver avec cinq millilitres de tampon de lavage pendant cinq minutes en s’assurant de resuspendre les perles dans la colonne. Répétez trois fois.

Enfin, ajoutez un millilitre de tampon d’élitution à la colonne en vous assurant de resuspendre les perles. Incuber pendant 15 minutes, puis recueillir l’élitiste dans un tube de microcentrifugeuse. Répétez cette étape trois fois pour l’élitution complète de BDNF.

Pour biotinylate le BDNF, prendre un aliquot contenant 800 nanogrammes de la protéine et ajouter le réacgage tampon de biotinylation, puis certains BirA-GST dans une relation molaire en un à un à BDNF. Incuber dans un four d’hybridation à 30 degrés Celsius pendant 60 minutes, en mélangeant le contenu du tube toutes les 15 minutes par inversion. Ajoutez ensuite le même volume d’ATP et de BirA-GST que dans la première étape et incubez pendant 60 minutes, en mélangeant le contenu du tube toutes les 15 minutes.

Le BDNF biotinylated peut alors être laissé dans la glace pour la vérification immédiate de biotinylation ou stocké à moins 80 degrés Celsius pour l’analyse postérieure. Pour vérifier la biotinylation de l’oviducte BDNF, commencez par bloquer 30 microlitres de perles magnétiques streptavidin par échantillon BDNF dans un tampon bloquant. Incuber à température ambiante pendant une heure, puis précipiter les perles magnétiques dans un séparateur de rack magnétique, puis jeter le tampon de blocage.

Ajouter 50 microlitres de tampon de blocage frais et l’échantillon BDNF aux perles, en s’assurant de les résuser complètement. Homogénéiser le contenu du tube et incuber à quatre degrés Celsius pendant une heure dans un rotateur à tube de microcentrifugeuse. Préparer l’échantillon pour le ballonnement occidental tel que décrit dans le texte pour évaluer l’efficacité de la réaction de biotinylation.

Pour conjuguer l’oviducte BDNF aux points quantiques, commencez par ajouter le volume nécessaire de points quantiques pour atteindre une relation molaire en un à une avec bdnf, puis diluer à un volume final de 20 microlitres. Homogénéiser le contenu du tube, puis l’envelopper dans du papier d’aluminium pour le protéger de la lumière. Incuber à température ambiante pendant 30 minutes dans un rocker.

Diluer ensuite l’oviducte BDNF à la concentration finale désirée et l’ajouter au compartiment axonal d’une chambre microfluidique, en incubation pendant 210 minutes pour l’imagerie cellulaire postérieure en direct ou fixe. L’utilisation d’un protocole basé sur la colonne de chromatographie permet le traitement de volumes significatifs de supports conditionnés HEK293. Dans cette expérience, 500 millilitres de supports conditionnés ont été traités pour purifier l’oviducte BDNF.

Quatre elutions consécutives d’une durée de 15 minutes chacune ont donné des concentrations décroissantes d’oviducte BDNF allant de six à 28 nanogrammes par microlitre. Le rendement total s’est élevé à environ 60 microgrammes d’oviducte BDNF. Ce BDNF purifié a ensuite été biotinylated par une réaction in vitro médiée par BirA-GST.

L’échantillon a été homogénéement biotinylated comme démontré par l’absence de l’oviducte non biotinylated de BDNF dans le surnatant de la perle magnétique a dégagé le tampon. Ces résultats montrent que le protocole proposé permet la purification de quantités importantes d’oviducte BDNF et de mono-biotinylation in vitro homogène. Ensuite, l’activité biologique du BDNF mono-biotinylated a été évaluée à l’aide de deux approches expérimentales différentes.

Tout d’abord, les neurones corticals ensemencés dans des plaques de 60 millimètres ont été stimulés avec 50 nanogrammes par millilitre de BDNF mono-biotinylated pendant 30 minutes, puis des protéines ont été préparées pour l’analyse occidentale de tache. L’activité biologique du BDNF mono-biotinylated a été quantifiée en détectant le phospho-TrkB et le phospho-ERK. La liaison du BDNF au TrkB déclenche l’auto-phosphorylation du récepteur et l’activation de plusieurs kinases en aval, y compris eRK.

Une condition négative de contrôle qui n’a pas été stimulée avec BDNF et une condition positive de contrôle qui a été stimulée avec BDNF commercialement disponible ont été incluses pour l’analyse de l’activité biologique d’oviducte de BDNF. Les bandes étaient toutes deux protéines phosphorylatées, ont eu une intensité semblable dans les neurones traités avec BDNF commercial et BDNF mono-biotinylated, et les deux ont montré un signal plus fort que l’état de contrôle négatif. Ensuite, l’activité biologique du BDNF mono-biotinylated couplé aux points quantiques streptavidin a été évaluée pour démontrer qu’ils peuvent être utilisés dans des expériences d’imagerie vivante.

Les neurones corticals ont été ensemencés dans des couvertures de 10 millimètres et traités avec une concentration finale de 200 points quantiques BDNF picomolaires ou deux nanomolaires pendant 30 minutes avant de fixer et de tacher pour le phospho-CREB. CREB est un facteur de transcription qui est ciblé par activé ERK12 dans les neurones corticals. La stimulation des neurones avec des concentrations croissantes de points quantiques BDNF a entraîné une augmentation dépendante de la dose de phosphorylation du CREB et la présence de particules à points quantiques entourant le noyau indiquant que les particules de points quantiques BDNF ont été endocytosées et ont déclenché l’activation des voies de signalisation associées à l’activation du TrkB mentale.

Une double augmentation du signal phospho-CREB a été détectée lors de la stimulation des neurones avec 200 points quantiques BDNF picomolaires alors que la stimulation avec deux points quantiques BDNF nanomolaires a entraîné une augmentation de 3,5 fois le signal phospho-CREB. Par conséquent, l’oviducte BDNF biotinylated est biologiquement actif et il ne perd pas son activité lorsqu’il est couplé à des points quantiques streptavidin le rendant approprié pour l’immunofluorescence et l’imagerie cellulaire vivante. Enfin, le potentiel d’imagerie des points quantiques BDNF a été évalué dans des cultures compartimentées à l’aide de chambres microfluidiques.

Les neurones corticals ont été ensemencés dans des chambres microfluidiques pour séparer les compartiments axonal et somatodendritic et ont été stimulés avec deux points quantiques BDNF nanomolaires pendant 3,5 heures. La microscopie cellulaire vivante a été effectuée et les kymographes qui en ont résulté ont été utilisés pour quantifier la vitesse du point quantique BDNF contenant des organites. Une vitesse de déplacement moyenne de 0,91 micromètre par seconde a été détectée, ce qui est conforme à l’analyse précédente du transport cytoplasmique à base de thymine.

Les chambres microfluidiques traitées avec deux points quantiques de streptavidine nanomolaire n’ont pas montré de points quantiques mobiles dans les micro-groupes comme le montre le kymographe. Les cellules cultivées dans les mêmes conditions ont été stimulées par 500 points quantiques BDNF picomolaires ou deux nanomolaires pendant 210 minutes, puis fixées et étiquetées avec une tache nucléaire. Les neurones traités avec des points quantiques BDNF montrent une accumulation dépendante de la dose de la protéine étiquetée dans tous les sous-matériaux analysés, y compris les parties proximales et distales du micro groupe et du compartiment somatodendritique.

En revanche, les neurones de contrôle n’ont montré presque aucun signal quantique de point dans toute la chambre. Par conséquent, le point quantique BDNF peut être détecté dans les cellules vivantes et fixes dans les chambres microfluidiques. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de produire l’oviducte BDNF mono-biotinylated dans une procédure rentable basée sur la colonne de chromatographie.