Analyse pathologique des métastases pulmonaires après injection latérale de cellules tumorales dans la veine caudale

L’injection intraveineuse de cellules cancéreuses est souvent utilisée dans la recherche sur les métastases, mais la charge tumorale métastatique peut être difficile à analyser. Ici, nous démontrons un modèle d’injection de métastases dans la veine de la queue et incluons une nouvelle approche pour analyser la charge tumorale pulmonaire métastatique qui en résulte.

Il n’existe actuellement aucun étalon-or pour analyser les charges tumorales pulmonaires métastatiques induites par l’injection de la veine caudale. Nous avons utilisé l’analyse d’images numériques pour quantifier avec précision et reproductibilité les métastases pulmonaires de manière très efficace. Cette méthode est rapide et rentable.

Et, lorsqu’il est associé à l’analyse d’images numériques, permet une analyse très précise et complète de la charge tumorale métastatique pulmonaire résultante. Pour préparer les cellules cancéreuses du sein humain à l’injection, placez d’abord un nombre approprié de cellules dans un milieu de culture cellulaire approprié, en fonction du nombre de souris et de la concentration cellulaire à utiliser. Lorsque les cellules atteignent une confluence de 80 à 90 %, lavez les plaques avec du PBS et détachez les cellules dans un volume minimal de trypsine, selon les protocoles standard.

Lorsque les cellules se sont détachées, remettez-les en suspension dans un milieu de culture frais pour le comptage et collectez les cellules par centrifugation. Ensuite, remettez en suspension les cellules à la concentration appropriée dans 100 microlitres de PBS par souris, sur de la glace. Juste avant l’injection, remettez soigneusement les cellules en suspension sur de la glace pour éviter qu’elles ne s’agglutinent, et chargez 100 microlitres de cellules dans une seringue à insuline de calibre 28.

En gardant la seringue verticale, tapotez l’arbre tout en ajustant lentement le piston pour éliminer les bulles. Si cela est autorisé, refermez soigneusement l’aiguille et pliez la pointe de l’aiguille à un angle de 20 à 30 degrés. Retenez une souris femelle de plus de six semaines dans une contention en plastique et positionnez-la sur le côté de manière à ce que la veine latérale de sa queue soit facilement visible.

Localisez l’artère ventrale dans l’alignement des organes génitaux, une veine dorsale et deux veines caudales latérales, et utilisez une lingette aseptique pour nettoyer la surface de la queue. En saisissant la queue entre l’index et le pouce de la main non dominante, appliquez une légère tension et, en commençant par la partie distale de la queue, insérez l’aiguille, biseau vers le haut, parallèlement à la veine. Libérez lentement tout le volume des cellules dans la veine.

Un petit volume de sang sera probablement déplacé après l’injection. Appliquez une légère pression avec une gaze stérile sur le site d’injection. Ensuite, jetez la seringue dans un récipient pour objets tranchants approprié et placez la souris dans une cage propre et ventilée avec surveillance.

Dans l’heure qui suit l’injection dans la veine caudale, effectuer une imagerie in vivo d’animaux vivants pour confirmer une injection cellulaire réussie et obtenir des données de temps zéro. Pour maintenir le format structurel des poumons pour l’histopathologie, fixez la souris à une planche de dissection et mouillez la fourrure avec de l’éthanol à 70 %. Ouvrez le thorax avec une incision médiane, en prolongeant l’incision crânienne et caudale à travers le péritoine, et saisissez l’apophyse xiphoïde pour permettre l’ablation du diaphragme.

À l’aide d’une deuxième paire de ciseaux, coupez les côtes de chaque côté du sternum et retirez délicatement la cage thoracique pour laisser de la place aux poumons pour se dilater. Pour isoler la trachée, retirez les glandes salivaires sous-mandibulaires et la musculature infrahyoïde, et placez des broches de chaque côté de la trachée pour empêcher tout mouvement indésirable lors de l’insertion de l’aiguille. Chargez une seringue de trois millilitres, équipée d’une aiguille de calibre 26, avec deux à trois millilitres de Formélin tamponné à 10 % neutre, et insérez l’aiguille dans la trachée.

Injectez lentement le Formelin, tout en surveillant l’expansion des poumons. Une fois que le Formelin commence à s’écouler des poumons, utilisez une pince pour pincer la trachée et retirer l’aiguille. Ensuite, détachez tout l’appareil respiratoire et placez les organes directement dans un récipient de Formélin frais.

Pour l’analyse de la charge tumorale pulmonaire métastatique, numérisez des coupes de tissu pulmonaire colorées H&E sur un scanner de lames haute résolution à un grossissement de 40 fois et importez les images dans un logiciel d’analyse d’images approprié. Ajustez les paramètres définissant la forme et la parcimonie pour s’adapter au mieux aux images. Pour afficher les zones segmentées des métastases tumorales et du tissu pulmonaire normal, à l’aide d’étiquettes de couleurs différentes pour chaque type de tissu, ouvrez le programme Forêt de décision et suivez la série de questions par oui ou par non pour entraîner correctement chaque classe pour une image.

Pour ajuster les fonctionnalités de chaque classe, appliquez des filtres pour accentuer, flouter ou trier par forme afin d’améliorer la précision de l’algorithme. Dans cette analyse, les métastases tumorales apparaissent en bleu. Le tissu normal est vert et l’épithélium bronchiolaire est jaune.

Les globules rouges peuvent être observés en rouge et les espaces aériens apparaissent en rose. Lorsque toutes les caractéristiques ont été définies, enregistrez les paramètres modifiés et appliquez l’algorithme à l’ensemble ou à la série complète de tissus colorés H&E. Exportez ensuite toutes les variables de sortie pour permettre de quantifier l’aire en microns carrés pour chaque type de tissu et de calculer les pourcentages à partir de la surface nette nette totale de l’échantillon.

La présence d’un signal de bioluminescence dans l’espace thoracique moins de deux heures après l’injection dans la veine caudale de cellules cancéreuses épithéliales humaines du sein marquées à la luciférase peut être considérée comme la confirmation d’une injection précise. Dans cette expérience, le nombre de photons dans la région thoracique a augmenté au fil du temps et un fort signal de bioluminescence était toujours présent au 24e jour après l’injection. Au moment de la nécropsie, de nombreuses lésions pulmonaires macroscopiques ont été observées chez ces souris.

À l’aide d’un logiciel d’analyse d’images et d’un algorithme personnalisé, comme démontré, l’ensemble du tissu pulmonaire peut être segmenté selon différentes caractéristiques tissulaires. En segmentant le tissu pulmonaire de cette manière, le logiciel peut quantifier divers paramètres. Ici, les données brutes d’une analyse réalisée sur des tissus pulmonaires de souris injectées avec des cellules cancéreuses épithéliales du sein humaines suivies d’un traitement avec un médicament conçu pour bloquer la colonisation métastatique sont présentées.

Comme le démontrent ces images, une différence dans la charge tumorale métastatique entre ces groupes de traitement peut facilement avoir été négligée, car le nombre total de nodules pulmonaires n’est pas différent. Une analyse complète de tous les paramètres, cependant, a indiqué une différence significative dans le pourcentage de surface nette de métastases pulmonaires, soulignant la nécessité d’une approche approfondie de l’analyse de la charge tumorale pulmonaire métastatique. Une remise en suspension cellulaire appropriée sans bulles d’air est essentielle pour prévenir les embolies pulmonaires, et un gonflage pulmonaire réussi aide à maintenir l’intégrité de la structure tissulaire pour une analyse d’image précise. L’immunocoloration du tissu pulmonaire peut être réalisée pour déterminer la présence de cellules ou de protéines d’intérêt au sein des lésions pulmonaires ou du microenvironnement pulmonaire