Name: Analyse pathologique des métastases pulmonaires après injection latérale de cellules tumorales dans la veine caudale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-20T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Apprenez une méthode d'analyse d'images numériques pour quantifier avec précision les métastases pulmonaires chez la souris après injection de cellules tumorales dans la veine caudale.

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Les données représentatives ont été financées par l’Institut national du cancer (K22CA218549 à S.T.S). En plus de leur aide dans le développement de la méthode d’analyse complète décrite ici, nous remercions l’Ohio State University Comprehensive Cancer Center Comparative Pathology and Mouse Phenotyping Shared Resource (Directrice – Krista La Perle, DVM, PhD) pour les services d’histologie et d’immunohistochimie et le Pathology Imaging Core pour le développement et l’analyse d’algorithmes.

L’utilisation des animaux a suivi les règlements de l’Université sur les ressources des animaux de laboratoire (ULAR) en vertu du protocole approuvé par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’OSU 2007A0120-R4 (PI: Dr Gina Sizemore).
1. Injection de cellules cancéreuses du sein dans la veine de la queue
<ol><li>Préparation des cellules et seringue pour injection<ol>
<li>Plaquez un nombre approprié de cellules en fonction du nombre de souris et de la concentration cellulaire à utiliser. REMARQUE: Le nombre de cellules injectées et le temps nécessaire au développement des métastases dépendront de la lignée cellulaire utilisée et devront être optimisés. Dans cette démonstration, 1 x 106 cellules MDA-MB-231 sont injectées par voie intraveineuse dans des souris NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG), et des lésions pulmonaires macroscopiques sont observées au plus tard 24 jours après l’injection. Pour la lignée cellulaire tumorale mammaire murine MVT17, 3 x 106 cellules sont injectées à des souris FVB/N immunocompétentes avec de nombreuses métastases pulmonaires observées en 14 jours22,23.</li>
		<li>Aspirer les milieux et rincer les plaques cellulaires avec 1x PBS. Trypsiniser les cellules en volume minimal, ajouter un volume approprié de milieu et compter les cellules à l’aide d’un hématocytomètre ou d’une autre méthode préférée. Le bleu de trypan (0,4 %) ou d’autres colorants cellulaires vivants/morts peuvent être utilisés pour déterminer le nombre de cellules viables.</li>
		<li>Cellules à granulés en tournant à 180 x g pendant 5 min.</li>
		<li>Remettre en suspension un nombre approprié de cellules dans du PBS stérile 1x de telle sorte qu’un volume de 100 μL soit injecté par souris. Gardez la suspension cellulaire sur la glace pour maintenir la viabilité.</li>
		<li>Avant l’injection, remettez soigneusement en suspension les cellules avec une pipette de 200 μL ou 1 mL pour éviter l’agglutination. Prélever 100 μL dans une seringue à insuline de 28 G (voir tableau des matériaux).</li>
		<li>Éliminez les bulles d’air en maintenant la seringue verticale, en tapotant sur la seringue et en ajustant lentement le piston. L’injection de bulles d’air dans la veine est susceptible de provoquer une embolie air/gaz qui peut être fatale.</li>
	</ol></li>
	<li>Injection latérale de la veine caudale REMARQUE: Pour les tests expérimentaux de métastases du cancer du sein, les injections sont effectuées sur des souris femelles de > de 6 semaines.<ol>
<li>Manipulez la souris par la queue et faites glisser l’animal dans un tube/dispositif de retenue fendu d’une taille appropriée (voir le tableau des matériaux pour le dispositif de retenue utilisé).</li>
		<li>Insérez la partie plug du dispositif de retenue et positionnez la souris sur le côté de manière à ce que sa veine latérale de la queue soit facile à voir. La souris a une artère ventrale alignée avec les organes génitaux, une veine dorsale et deux veines caudales latérales.</li>
		<li>Nettoyez la surface de la queue de la souris avec une lingette aseptique. Saisissez la queue entre l’index et le pouce avec la main non dominante et appliquez une légère tension.</li>
		<li>En commençant par la partie distale de la queue, insérez l’aiguille parallèlement à la veine avec l’extrémité biseautée.</li>
		<li>Si cela est autorisé, récapitulez soigneusement l’aiguille et pliez-la à un angle de 20 à 30 °. Une approche à une seule main ou un dispositif de récapitulation à l’aiguille est fortement recommandé. REMARQUE: Il n’est pas nécessaire d’aspirer car cela peut provoquer l’effondrement de la veine. Cependant, un petit éclair de sang peut être vu lors de la première place. L’aiguille avancera en douceur dans la veine avec un placement approprié.</li>
		<li>Distribuer lentement le volume complet dans la veine. Il ne devrait pas y avoir de résistance lorsque le piston est poussé.</li>
		<li>Si une résistance se fait sentir, retirez rapidement l’aiguille de la seringue. Si nécessaire, réinsérez l’aiguille (idéalement pas plus de 3 tentatives) en vous déplaçant vers l’extrémité proximale de la queue ou la veine latérale opposée.</li>
		<li>Un petit volume de sang sera probablement déplacé après l’injection. Appliquez une légère pression avec de la gaze stérile et essuyez avec une lingette aseptique.</li>
		<li>Jetez rapidement la seringue dans un contenant approprié pour objets tranchants.</li>
		<li>Remettez la souris dans une cage propre et ventilée et surveillez les signes de détresse.</li>
		<li>Surveillez les souris 2-3x / semaine pour détecter les signes de formation de métastases (respiration laborieuse, posture voûtée, perte de poids) et de détresse générale. Le temps de développement des métastases dépendra de la lignée cellulaire et de la souche de souris.</li>
		<li>Si vous utilisez un dispositif d’imagerie d’animaux vivants in vivo, imagez des souris immédiatement après l’injection de veines caudales pour confirmer l’injection réussie de cellules et obtenir des données de temps « zéro » (des détails spécifiques sur l’imagerie par bioluminescence in vivo ne sont pas inclus ici, mais sont décrits par Yang et al.24).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Fixation du tissu pulmonaire et analyse de la charge tumorale pulmonaire métastatique
<ol><li>Gonflage du tissu pulmonaire pour maintenir le format structurel des poumons pour l’histopathologie<ol>
<li>Après avoir suivi les procédures d’euthanasie approuvées (p. ex. dioxyde de carbone à un déplacement de 30 à 70 % du volume de la chambre/min), fixer la carcasse de la souris à une planche de dissection avec des broches. Vaporisez ou appliquez de l’éthanol à 70% pour garder la fourrure de la souris à l’écart pendant la dissection. REMARQUE: L’asphyxie au dioxyde de carbone peut provoquer une hémorhage pulmonaire comme lésion de fond attendue, en particulier à des débits plus lents.</li>
		<li>Ouvrez le thorax avec une incision médiane, étendez l’incision crânienne / caudale à travers le péritoine et coupez le diaphragme en saisissant le processus xyphoïde.</li>
		<li>À l’aide d’un jeu de ciseaux séparé pour ne pas ternir les lames, coupez les côtes de chaque côté du sternum et retirez soigneusement la cage thoracique en laissant de la place aux poumons pour se dilater.</li>
		<li>Isolez la trachée en enlevant les glandes salivaires sous-maxillaires et la musculature infrahyoïde. Placer des broches de chaque côté de la trachée peut empêcher les mouvements indésirables lors de l’insertion de l’aiguille.</li>
		<li>Remplissez une seringue de 26 G avec 2-3 mL de formol tamponné neutre à 10% et insérez-la dans la trachée.</li>
		<li>Injectez lentement du formol et surveillez l’expansion des poumons (nécessite généralement environ 1,5 mL de formol).</li>
		<li>Une fois que le formol commence à s’échapper des poumons (évitez le gonflage excessif), pincez la trachée avec une pince, retirez l’aiguille de la seringue et détachez tout l’appareil respiratoire. Placez les poumons, le cœur, etc. directement dans le formol car une coupe supplémentaire des tissus peut être effectuée après la fixation.</li>
		<li>Traitement complet, incorporation, sectionnement des tissus et coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H & E) à l’aide de méthodes standard.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse de la charge tumorale pulmonaire métastatique<ol>
<li>Scannez des sections pulmonaires colorées H&E sur un scanner de diapositives haute résolution à un grossissement de 40x (Figure 3).</li>
		<li>Importez des images dans un logiciel d’analyse d’images (par exemple, Visiopharm Image Analysis) pour quantifier les métastases pulmonaires. REMARQUE: Nous recommandons aux nouveaux utilisateurs d’obtenir une formation sur site ou en ligne pour utiliser le logiciel d’analyse d’images. De nombreux webinaires sont également disponibles sur la page Web commerciale.</li>
		<li>Sélectionnez l’application Visiopharm 10118 H&E Lung Metastasis dans la bibliothèque d’applications du logiciel. REMARQUE: Le but de cette application est d’étiqueter et de quantifier les métastases pulmonaires sur les lames colorées H & E. Dans le cadre de l’application 10118 H&E Lung Metastasis, la première étape de traitement d’image segmente le tissu pulmonaire avec l’application Tissue Detection. La deuxième étape de traitement d’image utilise l’application Metastasis Detect qui identifie les métastases à l’intérieur du tissu pulmonaire. Les métastases sont identifiées par la forme avec des régions qui sont soit trop déformées, soit trop rouges ou trop clairsemées pour être identifiées comme des métastases.</li>
		<li>Ajustez les paramètres définissant la forme et la rareté pour qu’ils s’adaptent au mieux aux images représentatives. Les zones segmentées des métastases tumorales et du tissu pulmonaire normal peuvent être affichées à l’aide d’étiquettes de couleur différentes pour chaque type de tissu. REMARQUE : Dans le cas où l’application ne peut pas séparer avec précision les métastases du tissu pulmonaire normal, une application personnalisée utilisant le programme Visiopharm Decision Forest peut devoir être écrite comme cela a été fait pour les expériences (voir Figure 2 et Figure 3). Les détails pour l’écriture d’un algorithme personnalisé suivent ci-dessous. Sinon, passez à l’étape 2.2.9.</li>
		<li>Ouvrez le programme Decision Forest, qui fonctionne en formant plusieurs classes [c.-à-d. tissu pulmonaire (non néoplasique), métastases, globules rouges, épithélium et / ou espace blanc] sur une image souhaitée. Dans la figure 2, les métastases tumorales sont bleues, le tissu normal est vert et l’épithélium bronchiolaire est jaune. En outre, les globules rouges sont dans les espaces rouges et les espaces d’air en rose.</li>
		<li>Suivez la série de questions par oui ou par non pour former correctement chaque classe à une image. La précision de l’algorithme déterminera le nombre de questions oui/non. Pour l’analyse, l’algorithme/l’application personnalisé a été écrit avec une précision définie sur 50 (plage 0-100).</li>
		<li>Ajustez les fonctionnalités pour chaque classe en appliquant des filtres pour affiner, flouter, trier par forme, etc. afin d’améliorer la précision de l’algorithme/de l’application. Visiopharm affiche chaque classe à travers un ou plusieurs objectifs appelés fonctionnalités. Les fonctionnalités modifient la façon dont la classe voit l’image pour faire ressortir certaines couleurs ou intensités. REMARQUE: Pour l’algorithme personnalisé, les métastases mesurant 8500 μm2 et plus sont étiquetées et mesurées comme métastases. Cela tient compte de la variance de taille et des métastases trop petites pour être détectées. Les petites zones déformées et les petites zones métastatiques inférieures à 8500 μm2 ont été incluses dans la quantification tissulaire normale.</li>
		<li>Enregistrez les paramètres modifiés à partir de l’application ou de l’algorithme personnalisé, puis appliquez l’algorithme / l’application à un ensemble entier ou à une série de tissus colorés H & E.</li>
		<li>Enfin, exportez toutes les variables de sortie, y compris celles répertoriées dans le tableau 1. L’aire en microns carrés (μm2) peut être quantifiée pour chaque type de tissu et les pourcentages sont dérivés de la surface nette nette totale de l’échantillon (c.-à-d. le tissu total moins l’espace d’air).</li>
		<li>Lors de la création d’un algorithme personnalisé, examinez les annotations tissulaires en consultation avec un pathologiste vétérinaire certifié par l’American College of Veterinary Pathologists pour assurer des mesures précises et différencier les types de tissus.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Wright, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+models+of+breast+cancer+bone+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22BoneKEy+Reports%22%5BJournal%5D)">Murine models of breast cancer bone metastasis.</a> BoneKEy Reports. 5, 804(2016).</li>
<li>Simmons, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Models+of+Bone+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">Animal Models of Bone Metastasis.</a> Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+orthotopic+mouse+models+of+patient-derived+breast+cancer+brain+metastases+by+a+modified+intracarotid+injection+method%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Improving orthotopic mouse models of patient-derived breast cancer brain metastases by a modified intracarotid injection method.</a> Scientific Reports. 9 (1), 622(2019).</li>
<li>Kodack, D. P., Askoxylakis, V., Ferraro, G. B., Fukumura, D., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+strategies+for+treating+brain+metastases+from+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Emerging strategies for treating brain metastases from breast cancer.</a> Cancer Cell. 27 (2), 163-175 (2015).</li>
<li>Brown, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+Stereology+Applications+for+the+Pathologist%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">Practical Stereology Applications for the Pathologist.</a> Veterinary Pathology. 54 (3), 358-368 (2017).</li>
<li>Aeffner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+Microscopy%2C+Image+Analysis%2C+and+Virtual+Slide+Repository%5BTitle%5D)+AND+%22Institute+for+Laboratory+Animal+Research+Journal%22%5BJournal%5D)">Digital Microscopy, Image Analysis, and Virtual Slide Repository.</a> Institute for Laboratory Animal Research Journal. 59 (1), 66-79 (2018).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Alors que les chercheurs continuent d’utiliser l’injection intraveineuse de cellules tumorales comme modèle expérimental pour les métastases, les pratiques standard pour analyser la charge tumorale métastatique qui en résulte font défaut. Dans certains cas, des différences significatives dans la charge tumorale métastatique lors de la manipulation de lignées cellulaires particulières et / ou de l’utilisation de composés chimiques peuvent être observées macroscopiquement. Cependant, dans d’autres cas, des différences subt...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61270/pathological-analysis-lung-metastasis-following-lateral-tail-vein">Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells</a>. The author list was updated.
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Katie A. Thies1,&#160;Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1 
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center 
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University
to:
Katie A. Thies1, Sarah Steck1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1 
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center 
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61270/pathological-analysis-lung-metastasis-following-lateral-tail-vein">Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells</a>. The author list was updated.

Erratum: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Bien qu’il s’agisse d’un processus très complexe et inefficace1, les métastases contribuent de manière significative à la morbidité et à la mortalité des patients atteints de cancer2. En fait, la plupart des décès liés au cancer sont attribués à la propagation métastatique de la maladie3,4. Pour que les cellules tumorales réussissent à métastaser, elles doivent se détacher du site primaire, envahir par le stroma adjacent, s’intravaser dans la circulation sanguine ou lymphatique, se rendre au lit capillaire d’un site secondaire, extravaser dans le tissu secondaire et proliférer ou se développer pour former des lésions métastatiques5. L’utilisation de modèles murins a été essentielle pour approfondir la compréhension des mécanismes moléculaires responsables de l’ensemencement et de la croissance métastatiques6,7. Ici, nous nous concentrons sur les métastases du cancer du sein, pour lesquelles des modèles murins génétiquement modifiés ainsi que des méthodes de transplantation sont souvent utilisés – chacun avec son propre ensemble d’avantages et de limites.
Les modèles de tumeurs mammaires génétiquement modifiés utilisent des promoteurs spécifiques de la glande mammaire, y compris MMTV-LTR (mouse mammary tumor virus long terminal repeat) et WAP (Whey Acidic Protein), pour stimuler l’expression des transgènes dans l’épithélium mammaire8. Les oncogènes, y compris l’antigène T moyen polyoma (PyMT), ErbB2 / Neu, c-Myc, Wnt-1 et le virus simien 40 (SV40) ont été exprimés de cette manière9,10,11,12,13, et bien que ces modèles génétiques soient utiles pour étudier l’initiation et la progression de la tumeur primaire, peu se métastasent facilement vers des organes distants. De plus, ces modèles génétiques murins sont souvent plus longs et plus coûteux que les modèles de métastases spontanées ou expérimentales. Compte tenu de la limitation de la plupart des modèles de tumeurs mammaires génétiquement modifiés pour étudier les métastases, les techniques de transplantation sont devenues des méthodes attrayantes pour étudier ce processus complexe. Cela comprend l’injection orthotopique, veineuse de la queue, intracardiaque et intracrânienne de lignées cellulaires appropriées.
Bien que plusieurs lignées cellulaires de cancer du sein métastasent facilement après une injection orthotopique dans le coussinet adipeux mammaire14,15, la consistance et la reproductibilité de la charge tumorale métastatique peuvent être un défi, et la durée de telles études peut être de l’ordre de plusieurs mois. Pour évaluer les métastases pulmonaires, en particulier, l’injection intraveineuse dans la veine de la queue est souvent une méthode plus reproductible et plus rapide, la propagation métastatique se produisant généralement en l’espace de quelques semaines. Cependant, étant donné que le modèle d’injection intraveineuse contourne les étapes initiales de la cascade métastatique, il faut faire preuve de prudence dans l’interprétation des résultats de ces études. Dans cette démonstration, nous montrons l’injection de cellules tumorales mammaires dans la veine caudale ainsi qu’une méthode d’analyse précise et complète.
Même si le milieu de la recherche a fait des progrès importants dans la compréhension du processus complexe des métastases du cancer du sein, on estime que plus de 150 000 femmes sont actuellement atteintes d’un cancer du sein métastatique16. Parmi les personnes atteintes d’un cancer du sein de stade IV, >36 % des patientes ont des métastases pulmonaires17; toutefois, le profil et l’incidence des métastases propres au site peuvent varier en fonction du sous-type moléculaire18,19,20,21. Les patientes atteintes de métastases pulmonaires associées au cancer du sein ont une survie médiane de seulement 21 mois, ce qui souligne la nécessité d’identifier des traitements efficaces et de nouveaux biomarqueurs pour cette maladie17. L’utilisation de modèles expérimentaux de métastases, y compris l’injection intraveineuse de cellules tumorales, continuera de faire progresser nos connaissances sur cet important défi clinique. Lorsqu’elles sont combinées à la pathologie par imagerie numérique et à la méthode d’analyse de la charge tumorale pulmonaire métastatique décrite dans ce protocole, les injections de veines de la queue sont un outil précieux pour la recherche sur les métastases du cancer du sein.

<table><tbody><tr><td>tampons de préparation à l’alcool</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-750</td><td>pour nettoyer la queue avant l’injection</FORT></td></tr><tr><td>CISEAUX de dissection</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-951-5</td><td>pour la dissection de souris et le gonflage des tissus pulmonaires</td></tr><tr><td>DMEM avec L-glutamine, 4,5 g/L de glucose et pyruvate de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT10013CV</td><td>base de milieu de culture cellulaire pour lignées cellulaires MDA-MB-231 et MVT1</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco 1x</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT21030CV</td><td>utilisée pour remettre en suspension les cellules tumorales pour l’injection</td></tr><tr><td>d’éthanol (solution à 70 %)</td> <td>OSU</td><td></td><td>utilisée pour minimiser la fourrure de la souris pendant la dissection ; prudence -</td></tr><tr><td>colorant bleu d’Evan</td> inflammable <td>Millipore Sigma</td><td>E2129</td><td>utilisé à 1 % dans le PBS stérile pour la pratique avec la méthode d’injection de la veine caudale ; utiliser prudence - réactif dangereux</td></tr> Sérum de <tr><td>veau fœtal</td><td>Millipore Sigma</td><td>F4135</td><td>additif de milieu de culture cellulaire ; utilisé à 10 % dans les</td></tr><tr><td>pinces</td> DMEM <td>Fisher Scientific</td><td>10-270</td><td>pour la dissection et le gonflage des tissus pulmonaires</td></tr><tr><td>souris FVB/NJ</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>001800</td><td>souche de souris syngénique pour cellules MVT1</td></tr><tr><td>hémacytomètre (Bright-Line)</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z359629</td><td>pour utilisation en culture cellulaire pour obtenir le nombre</td></tr><tr><td>de cellules seringue à insuline (28 G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-1B</td><td>pour injections dans la veine caudale (BD 329424)</td></tr><tr><td>Cellules MDA-MB-231 Lignée</td><td>cellulaire de cancer du sein humain</td><td>ATCC</td><td></td></tr><tr><td>Cellules MVT1 Cellules</td><td></td><td></td><td>tumorales mammaires de souris</td></tr><tr><td>Aiguilles (26 G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-15</td><td>Utilisé pour gonfler la souris poumons</td></tr><tr><td>neutre tamponné formol (10 %)</td><td>Fisher Scientific</td><td>245685</td><td>utilisé comme fixateur tissulaire et pour gonfler le tissu pulmonaire ; faire attention - réactif dangereux</td></tr><tr><td>NOD. souris Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)</td><td>souris The Jackson Laboratory</td><td>005557</td><td>maintenu par l’OSUCCC Validation de la cible Ressource partagée</td></tr><tr><td>Pénicilline Streptomycine 100x</td><td>ThermoFisher</td><td>15140163</td><td>milieu de culture cellulaire additif</td></tr><tr><td>gaze stérile</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9379092</td><td>pour appliquer une pression sur la queue de la souris en cas de saignement</td></tr><tr><td>seringue (5 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-458</td><td>utilisé pour gonfler le tissu pulmonaire</td></tr><tr><td>de souris Braintree</td><td>Scientific, Inc.</td><td>TV-150 STD</td><td>utilisé pour retenir la souris pour les injections dans la veine caudale</td></tr><tr><td>Bleu de trypan (0,4 %)</td><td>ThermoFisher</td><td>15250061</td><td>utilisé en culture cellulaire pour évaluer la viabilité</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA 0,25 %</td><td>ThermoFisher</td><td>25200-114</td><td>utilisé en culture cellulaire pour détacher les cellules tumorales de la plaque</td></tr></tbody></table>

analyse pathologique des métastases pulmonaires après injection latérale de cellules tumorales dans la veine caudale

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Les métastases, principale cause de morbidité et de mortalité chez la plupart des patients atteints de cancer, peuvent être difficiles à modéliser précliniquement chez la souris. Peu de modèles de métastases spontanées sont disponibles. Ainsi, le modèle expérimental de métastases impliquant l’injection de lignées cellulaires appropriées dans la veine caudale est un pilier de la recherche sur les métastases. Lorsque des cellules cancéreuses sont injectées dans la veine latérale de la queue, le poumon est leur site préféré de colonisation. Une limitation potentielle de cette technique est la quantification précise de la charge tumorale pulmonaire métastatique. Alors que certains chercheurs comptent les macrométastases d’une taille prédéfinie et/ou incluent des micrométastases après la coupe des tissus, d’autres déterminent la zone des lésions métastatiques par rapport à la zone tissulaire normale. Ces deux méthodes de quantification peuvent être extrêmement difficiles lorsque la charge métastatique est élevée. Ici, nous démontrons un modèle d’injection intraveineuse de métastases pulmonaires suivi d’une méthode avancée pour quantifier la charge tumorale métastatique à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. Ce processus permet d’étudier plusieurs paramètres du point final, y compris la taille moyenne des métastases, le nombre total de métastases et la zone totale des métastases, afin de fournir une analyse complète. De plus, cette méthode a été examinée par un pathologiste vétérinaire certifié par l’American College of Veterinary Pathologists (SEK) pour en assurer l’exactitude.

Si vous utilisez des cellules non marquées pour l’injection de veines de la queue, il peut être difficile de confirmer la colonisation pulmonaire jusqu’à (1) le moment de la nécropsie si des macrométastases peuvent être observées ou (2) après une analyse histologique si des métastases microscopiques existent. Avec une charge de tumeur pulmonaire métastatique étendue, les souris auront une respiration laborieuse. Comme pour toute étude tumorale, les souris doivent être surveillées attentivement tout au long de la durée de...

L’injection intraveineuse de cellules cancéreuses est souvent utilisée dans la recherche sur les métastases, mais la charge tumorale métastatique peut être difficile à analyser. Ici, nous démontrons un modèle d’injection de métastases dans la veine de la queue et incluons une nouvelle approche pour analyser la charge tumorale pulmonaire métastatique qui en résulte.

Analyse pathologique des métastases pulmonaires après injection latérale de cellules tumorales dans la veine caudale

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Il n’existe actuellement aucun étalon-or pour analyser les charges tumorales pulmonaires métastatiques induites par l’injection de la veine caudale. Nous avons utilisé l’analyse d’images numériques pour quantifier avec précision et reproductibilité les métastases pulmonaires de manière très efficace. Cette méthode est rapide et rentable.Et, lorsqu’il est associé à l’analyse d’images numériques, permet une analyse très précise et complète de la charge tumorale métastatique pulmonaire résultante. Pour préparer les cellules cancéreuses du sein humain à l’injection, placez d’abord un nombre approprié de cellules dans un milieu de culture cellulaire approprié, en fonction du nombre de souris et de la concentration cellulaire à utiliser. Lorsque les cellules atteignent une confluence de 80 à 90 %, lavez les plaques avec du PBS et détachez les cellules dans un volume minimal de trypsine, selon les protocoles standard.Lorsque les cellules se sont détachées, remettez-les en suspension dans un milieu de culture frais pour le comptage et collectez les cellules par centrifugation. Ensuite, remettez en suspension les cellules à la concentration appropriée dans 100 microlitres de PBS par souris, sur de la glace. Juste avant l’injection, remettez soigneusement les cellules en suspension sur de la glace pour éviter qu’elles ne s’agglutinent, et chargez 100 microlitres de cellules dans une seringue à insuline de calibre 28.En gardant la seringue verticale, tapotez l’arbre tout en ajustant lentement le piston pour éliminer les bulles. Si cela est autorisé, refermez soigneusement l’aiguille et pliez la pointe de l’aiguille à un angle de 20 à 30 degrés. Retenez une souris femelle de plus de six semaines dans une contention en plastique et positionnez-la sur le côté de manière à ce que la veine latérale de sa queue soit facilement visible.Localisez l’artère ventrale dans l’alignement des organes génitaux, une veine dorsale et deux veines caudales latérales, et utilisez une lingette aseptique pour nettoyer la surface de la queue. En saisissant la queue entre l’index et le pouce de la main non dominante, appliquez une légère tension et, en commençant par la partie distale de la queue, insérez l’aiguille, biseau vers le haut, parallèlement à la veine. Libérez lentement tout le volume des cellules dans la veine.Un petit volume de sang sera probablement déplacé après l’injection. Appliquez une légère pression avec une gaze stérile sur le site d’injection. Ensuite, jetez la seringue dans un récipient pour objets tranchants approprié et placez la souris dans une cage propre et ventilée avec surveillance.Dans l’heure qui suit l’injection dans la veine caudale, effectuer une imagerie in vivo d’animaux vivants pour confirmer une injection cellulaire réussie et obtenir des données de temps zéro. Pour maintenir le format structurel des poumons pour l’histopathologie, fixez la souris à une planche de dissection et mouillez la fourrure avec de l’éthanol à 70 %. Ouvrez le thorax avec une incision médiane, en prolongeant l’incision crânienne et caudale à travers le péritoine, et saisissez l’apophyse xiphoïde pour permettre l’ablation du diaphragme.À l’aide d’une deuxième paire de ciseaux, coupez les côtes de chaque côté du sternum et retirez délicatement la cage thoracique pour laisser de la place aux poumons pour se dilater. Pour isoler la trachée, retirez les glandes salivaires sous-mandibulaires et la musculature infrahyoïde, et placez des broches de chaque côté de la trachée pour empêcher tout mouvement indésirable lors de l’insertion de l’aiguille. Chargez une seringue de trois millilitres, équipée d’une aiguille de calibre 26, avec deux à trois millilitres de Formélin tamponné à 10 % neutre, et insérez l’aiguille dans la trachée.Injectez lentement le Formelin, tout en surveillant l’expansion des poumons. Une fois que le Formelin commence à s’écouler des poumons, utilisez une pince pour pincer la trachée et retirer l’aiguille. Ensuite, détachez tout l’appareil respiratoire et placez les organes directement dans un récipient de Formélin frais.Pour l’analyse de la charge tumorale pulmonaire métastatique, numérisez des coupes de tissu pulmonaire colorées H&E sur un scanner de lames haute résolution à un grossissement de 40 fois et importez les images dans un logiciel d’analyse d’images approprié. Ajustez les paramètres définissant la forme et la parcimonie pour s’adapter au mieux aux images. Pour afficher les zones segmentées des métastases tumorales et du tissu pulmonaire normal, à l’aide d’étiquettes de couleurs différentes pour chaque type de tissu, ouvrez le programme Forêt de décision et suivez la série de questions par oui ou par non pour entraîner correctement chaque classe pour une image.Pour ajuster les fonctionnalités de chaque classe, appliquez des filtres pour accentuer, flouter ou trier par forme afin d’améliorer la précision de l’algorithme. Dans cette analyse, les métastases tumorales apparaissent en bleu. Le tissu normal est vert et l’épithélium bronchiolaire est jaune.Les globules rouges peuvent être observés en rouge et les espaces aériens apparaissent en rose. Lorsque toutes les caractéristiques ont été définies, enregistrez les paramètres modifiés et appliquez l’algorithme à l’ensemble ou à la série complète de tissus colorés H&E. Exportez ensuite toutes les variables de sortie pour permettre de quantifier l’aire en microns carrés pour chaque type de tissu et de calculer les pourcentages à partir de la surface nette nette totale de l’échantillon.La présence d’un signal de bioluminescence dans l’espace thoracique moins de deux heures après l’injection dans la veine caudale de cellules cancéreuses épithéliales humaines du sein marquées à la luciférase peut être considérée comme la confirmation d’une injection précise. Dans cette expérience, le nombre de photons dans la région thoracique a augmenté au fil du temps et un fort signal de bioluminescence était toujours présent au 24e jour après l’injection. Au moment de la nécropsie, de nombreuses lésions pulmonaires macroscopiques ont été observées chez ces souris.À l’aide d’un logiciel d’analyse d’images et d’un algorithme personnalisé, comme démontré, l’ensemble du tissu pulmonaire peut être segmenté selon différentes caractéristiques tissulaires. En segmentant le tissu pulmonaire de cette manière, le logiciel peut quantifier divers paramètres. Ici, les données brutes d’une analyse réalisée sur des tissus pulmonaires de souris injectées avec des cellules cancéreuses épithéliales du sein humaines suivies d’un traitement avec un médicament conçu pour bloquer la colonisation métastatique sont présentées.Comme le démontrent ces images, une différence dans la charge tumorale métastatique entre ces groupes de traitement peut facilement avoir été négligée, car le nombre total de nodules pulmonaires n’est pas différent. Une analyse complète de tous les paramètres, cependant, a indiqué une différence significative dans le pourcentage de surface nette de métastases pulmonaires, soulignant la nécessité d’une approche approfondie de l’analyse de la charge tumorale pulmonaire métastatique. Une remise en suspension cellulaire appropriée sans bulles d’air est essentielle pour prévenir les embolies pulmonaires, et un gonflage pulmonaire réussi aide à maintenir l’intégrité de la structure tissulaire pour une analyse d’image précise. L’immunocoloration du tissu pulmonaire peut être réalisée pour déterminer la présence de cellules ou de protéines d’intérêt au sein des lésions pulmonaires ou du microenvironnement pulmonaire.

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