Name: Dissection, immunohistochimie et montage de cerveaux de drosophiles larvaires et adultes pour la visualisation du lobe optique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Apprenez la dissection, l'immunohistochimie et le montage de cerveaux de Drosophila larvaires et adultes pour visualiser les lobes optiques. Ce protocole optimise l'imagerie des structures neuronales tridimensionnelles.

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Nous tenons à remercier Claude Desplan d’avoir partagé avec nous une aliquote de l’anticorps Bsh. Les anticorps monoclonaux DE-Cadherin, Dachshund, Eyes Absent, Seven-up et Bruchpilot ont été obtenus à partir de la Developmental Studies Hybridoma Bank, créée par le NICHD du NIH et maintenue à l’Université de l’Iowa, Département de biologie, Iowa City, IA 52242. Ces travaux ont été financés par une subvention à la découverte du CRSNG accordée à T.E. U.A. est soutenu par une bourse d’études supérieures canadiennes Alexander-Graham-Bell du CRSNG. P.V. est soutenu par une bourse d’études supérieures de l’Ontario.

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<li>Hara, Y., Sudo, T., Togane, Y., Akagawa, H., Tsujimura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+in+neural+precursor+cells+and+neurons+before+neurite+formation+prevents+the+emergence+of+abnormal+neural+structures+in+the+Drosophila+optic+lobe%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell death in neural precursor cells and neurons before neurite formation prevents the emergence of abnormal neural structures in the Drosophila optic lobe.</a> Developmental Biology. 436, 28-41 (2018).</li>
<li>Morante, J., Erclik, T., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+in+Drosophila+optic+lobe+neurons+is+controlled+by+eyeless%2FPax6%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cell migration in Drosophila optic lobe neurons is controlled by eyeless/Pax6.</a> Development. 138, 687-693 (2011).</li>
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<li>Takemura, S. Y., Lu, Z., Meinertzhagen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+circuits+of+the+Drosophila+optic+lobe%3A+The+input+terminals+to+the+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Synaptic circuits of the Drosophila optic lobe: The input terminals to the medulla.</a> Journal of Comparative Neurology. 509, 493-513 (2008).</li>
<li>Akin, O., Bajar, B. T., Keles, M. F., Frye, M. A., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-Specific+Patterned+Stimulus-Independent+Neuronal+Activity+in+the+Drosophila+Visual+System+during+Synapse+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cell-type-Specific Patterned Stimulus-Independent Neuronal Activity in the Drosophila Visual System during Synapse Formation.</a> Neuron. 101, 894-904 (2019).</li>
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<li>Dokucu, M. E., Zipursky, S. L., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atonal%2C+rough+and+the+resoluton+of+proneural+clusters+in+the+developing+Drosophila+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Atonal, rough and the resoluton of proneural clusters in the developing Drosophila retina.</a> Development. 122, Cambridge, England. 4139-4147 (1996).</li>
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<li>Bertet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+patterning+of+neuroblasts+controls+notch-mediated+cell+survival+through+regulation+of+hid+or+reaper%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Temporal patterning of neuroblasts controls notch-mediated cell survival through regulation of hid or reaper.</a> Cell. 158, 1173-1186 (2014).</li>
<li>Pinto-Teixeira, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Concurrent+Retinotopic+Maps+in+the+Fly+Motion+Detection+Circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Development of Concurrent Retinotopic Maps in the Fly Motion Detection Circuit.</a> Cell. 173, 485-498 (2018).</li>
<li>Plevock, D. A., Rusan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+Drosophila+Larval+Neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51756(2014).</li>
<li>Ting, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+dendritic+morphology+in+columns+and+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analyzing dendritic morphology in columns and layers.</a> Journal of Visualized Experiments. , e55410(2017).</li>
<li>Özel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filopodial+dynamics+and+growth+cone+stabilization+in+Drosophila+visual+circuit+development%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development.</a> eLife. 4, (2015).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Dans ce protocole, nous décrivons une méthode pour immunocolorer les cerveaux des larves et des adultes de drosophile et les monter dans plusieurs orientations. Bien que des méthodes de coloration des cerveaux larvaires et adultes aient déjà été décrites 22,23,24,27,28, les stratégies de montage pour la visualisation optimale de structures spécifiques du lobe optique ont reçu moins d’attention28....

Le système visuel de la drosophile, composé de l’œil composé et du lobe optique sous-jacent, a été un excellent modèle pour l’étude du développement et de la fonction des circuits neuronaux. Ces dernières années, le lobe optique en particulier est devenu un système puissant dans lequel étudier les processus neurodéveloppementaux tels que la neurogenèse et le câblage des circuits 1,2,3,4,5,6,7,8. Il est composé de quatre neuropilles : la lame, la moelle, le lobule et la plaque lobula (ces deux dernières comprennent le complexe lobula)1,2,3,4,5,6. Les photorécepteurs de l’œil ciblent les neurones de la lame et de la moelle, qui traitent les entrées visuelles et les relaient aux neuropils du complexe lobula 1,2,3,4,5,6. Les neurones de projection du complexe lobula envoient ensuite des informations visuelles aux centres de traitement d’ordre supérieur dans le cerveau central 1,5,9. L’organisation complexe du lobe optique, rendue nécessaire par la nécessité de maintenir la rétinotopie et de traiter différents types de stimuli visuels, en fait un système attrayant pour étudier l’assemblage de circuits neuronaux sophistiqués. Notamment, la moelle partage des similitudes frappantes dans son organisation et son développement avec la neurorétine, qui a longtemps été un modèle pour le développement des circuits neuronaux des vertébrés 3,8.
Le développement du lobe optique commence au cours de l’embryogenèse, avec la spécification de ~35 cellules ectodermiques qui forment la placode optique 2,4,5,6,7,8. Après l’éclosion des larves, la plaque optique est subdivisée en deux primordiums distincts : 1) le centre de prolifération externe (OPC), qui génère les neurones de la lame et de la moelle externe et 2) le centre de prolifération interne (IPC), qui génère les neurones du complexe interne de la moelle épinière et du lobula 4,5,6,10 . Chez la larve du deuxième stade tardif, les cellules neuroépithéliales de l’OPC et de l’IPC commencent à se transformer en neuroblastes qui génèrent ensuite des neurones via les cellules mères ganglionnaires intermédiaires 4,5,11,12. Les neuroblastes du lobe optique sont structurés par des facteurs de transcription limités dans l’espace et dans le temps, qui agissent ensemble pour générer une diversité neuronale dans leur descendance 11,12,13,14. Dans la nymphe, les circuits des neuropils du lobe optique sont assemblés via la coordination de plusieurs processus, notamment la mort cellulaire programmée11,15, la migration neuronale12,16, le ciblage axonal/dendritique10,17, la formation des synapses18,19 et les rotations neuropil10,17.
Ici, nous décrivons la méthodologie par laquelle les cerveaux larvaires et adultes sont disséqués, immunocolorés et montés pour l’imagerie du lobe optique. Compte tenu de son organisation tridimensionnelle complexe, l’analyse du lobe optique nécessite de comprendre comment ses neuropils adultes et ses progéniteurs larvaires sont positionnés les uns par rapport aux autres et par rapport au cerveau central. Ainsi, nous mettons un accent particulier sur la façon dont l’orientation du montage est liée à l’organisation spatiale des structures du lobe optique. Nous décrivons trois stratégies de montage pour les cerveaux larvaires (antérieur, postérieur et latéral) et trois pour les cerveaux adultes (antérieur, postérieur et horizontal), chacune fournissant un angle optimal pour l’imagerie d’une population spécifique de progéniteurs du lobe optique ou neuropil.

<table><tbody><tr><td>10x PBS</td><td>Bioshop</td><td>PBS405</td><td></td></tr><tr><td>37 % formaldéhyde</td><td>Bioshop</td><td>FOR201</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 (chèvre) secondaire</td><td>Invitrogen</td><td>A-11055</td><td>utilisation à 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 (souris) secondaire</td><td>Invitrogen</td><td>A-31570</td><td>utilisation à 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 (cobaye) secondaire</td><td>Invitrogen</td><td>A-21450</td><td>à 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 (rat) secondaire</td><td>Invitrogen</td><td>A-21247</td><td>utilisation à 1:500</td></tr><tr><td>Couvercles</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td></td></tr><tr><td>Pince à dissection - #5</td><td>Dumont</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Pince à dissection - #55</td><td>Dumont</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Plat de dissection</td><td>Corning</td><td>722085</td><td></td></tr><tr><td>Lingettes sèches</td><td>Kimbery Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps primaire anti-Bgal de chèvre</td><td>Biogenèse</td><td></td><td>utilisation au 1:1000</td></tr><tr><td>Anticorps primaire anti-Bsh de cobaye</td><td>Cadeau de Claude Desplan</td><td></td><td>utilisation à 1:500</td></tr><tr><td>Anticorps primaire anti-Vsx1 de cobaye</td><td>Erclik et al. 2008</td> utilisation <td>à 1:1000</td><td></td></tr><tr><td>Film de laboratoire</td><td>Parafilm</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation</td><td>Sarstedt</td><td>72.706.600</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope</td><td>VWR</td><td>CA4823-180</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps primaire anti-dac de souris</td><td>Etudes développementales Hybridoma Bank (DSHB)</td><td>mabdac2-3</td><td>utilisation à 1:20</td></tr><tr><td>Anticorps primaire anti-eya de souris</td><td>DSHB</td><td>eya10H6</td><td>utilisation à 1:20</td></tr><tr><td>Anticorps primaire anti-nc82 de souris</td><td>DSHB</td><td>nc82</td><td>utilisation à 1:50</td></tr><tr><td>Souris anticorps primaire anti-svp</td><td>DSHB</td><td>Seven-up 2D3</td><td>utilisation à 1:100</td></tr><tr><td>Pâte polymère</td><td>Tout type d’argile peut être utilisé</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lapin anti-GFP</td><td>Invitrogen</td><td>A-11122</td><td>utilisation à 1:1000</td></tr><tr><td>Rat anti-DE-Cadhérine anticorps primaire</td><td>DSHB</td><td>DCAD2</td><td>utilisation à 1:20</td></tr><tr><td>Milieu de montage à fondu lent</td><td>Invitrogen</td><td>S36967</td><td>Le support de montage Vectashield (cat# H-1000) peut également être utilisé</td></tr><tr><td>Triton-x-100</td><td>Bioshop</td><td>TRX506</td><td></td></tr></tbody></table>

dissection, immunohistochimie et montage de cerveaux de drosophiles larvaires et adultes pour la visualisation du lobe optique

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization

Le lobe optique de la drosophile , composé de quatre neuropilles : la lame, la moelle, le lobula et la plaque lobula, est un excellent système modèle pour explorer les mécanismes de développement qui génèrent la diversité neuronale et pilotent l’assemblage des circuits. Compte tenu de son organisation tridimensionnelle complexe, l’analyse du lobe optique nécessite de comprendre comment ses neuropils adultes et ses progéniteurs larvaires sont positionnés les uns par rapport aux autres et par rapport au cerveau central. Nous décrivons ici un protocole de dissection, d’immunomarquage et de montage de cerveaux larvaires et adultes pour l’imagerie du lobe optique. Un accent particulier est mis sur la relation entre l’orientation du montage et l’organisation spatiale du lobe optique. Nous décrivons trois stratégies de montage chez la larve (antérieure, postérieure et latérale) et trois chez l’adulte (antérieure, postérieure et horizontale), chacune offrant un angle d’imagerie idéal pour une structure de lobe optique distincte.

Des images confocales des lobes optiques larvaires et adultes montés dans les orientations décrites dans le protocole sont présentées à la figure 1 et à la figure 2.
La figure 1 montre des schémas et des coupes confocales représentatives de cerveaux larvaires positionnés dans les orientations antérieure, postérieure et latérale. Dans l’orientation antérieure montante, l’épithélium OPC (DE-Cadhérine), les ...

Ce protocole décrit trois étapes pour préparer les lobes optiques de la drosophile larvaire et adulte à l’imagerie : 1) dissections cérébrales, 2) immunohistochimie et 3) montage. L’accent est mis sur l’étape 3, car des orientations de montage distinctes sont nécessaires pour visualiser des structures spécifiques du lobe optique.

Dissection, immunohistochimie et montage de cerveaux de drosophiles larvaires et adultes pour la visualisation du lobe optique

The Drosophila optic lobe, comprised of four neuropils: the lamina, medulla, lobula and lobula plate, is an excellent model system for exploring the ...

Nous décrivons un protocole pour disséquer, immunocolorer et monter les cerveaux des larves et des drosophiles adultes, en mettant l’accent sur les lobes optiques. Compte tenu de l’organisation tridimensionnelle complexe du lobe optique, on s’attend à ce que le protocole décrit ici permette aux chercheurs de mieux comprendre la relation entre l’orientation du montage et les structures du lobe optique visualisées. Ce protocole décrit trois stratégies de montage pour les lobes optiques larvaires et adultes, chacune offrant un angle optimal pour visualiser une structure de lobe optique spécifique pendant l’imagerie.Avant de commencer la dissection, remplissez tous les puits d’une plaque à trois puits avec 400 microlitres de PBS par puits, et à l’aide d’une pince, sélectionnez délicatement 15 larves errantes du troisième stade qui rampent à l’intérieur d’une fiole ou d’une bouteille de drosophile. Placez toutes les larves dans le premier puits de la plaque à trois puits et transférez une larve dans le puits du milieu de la plaque. À l’aide de la main non dominante, retenez le corps de la larve à la base du puits et utilisez la main dominante pour saisir doucement le crochet de la bouch

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Developmental Biology

Biologie du développement

Nous décrivons ici un protocole visant à étudier la migration des cellules gliales dans le développement de l'œil de drosophile en utilisant l'analyse microscopique direct couplé à la GFP taggés cellules gliales.

Imagerie de la migration en direct des cellules gliales dans le disque Eye drosophile Imaginal

Dissection et immunohistochimique de larve, de nymphe et adulte<em&gt; Drosophila</em&gt; Rétines

Cette vidéo décrit une méthode de montage de cerveaux intacts à partir de mouches adultes sous une diapositive de pont et montre le protocole appliqué sur des cerveaux immunocolorés pour la microscopie fluorescente.

Montage de cerveaux de drosophile adulte : une méthode de préparation de lames pour l’imagerie confocale

L’immunomarquage est une technique efficace pour visualiser des types de cellules et des protéines spécifiques dans les tissus. En utilisant la sonication, le protocole décrit ici réduit la nécessité de disséquer les tissus de Drosophila melanogaster des embryons et des larves à un stade avancé avant l’immunomarquage. Nous fournissons une méthodologie efficace pour l’immunomarquage des larves de montures entières fixées au formaldéhyde.

Sonication facilitée immunofluorescence de phase tardive embryonnaire et larvaire<em&gt; Drosophila</em&gt; tissus<em&gt; In Situ</em

Ce protocole détaille une méthode simplifiée utilisée pour effectuer l'imagerie des cellules vivantes dans le cadre d'un cerveau intact larvaire. Approches d'imagerie des cellules vivantes sont très précieux pour l'étude des divisions de cellules souches neurales asymétriques ainsi que d'autres processus neurogène et de développement, les mécanismes qui ont été précédemment négligés découvrant constamment.

Imagerie en direct de<em&gt; Drosophila</em&gt; larves Neuroblastes

Les structures adultes de la drosophile sont dérivées de structures en forme de sac appelées disques imaginaux. L’analyse de ces disques donne un aperçu de nombreux processus de développement, notamment la détermination des tissus, l’établissement des limites des compartiments, la prolifération cellulaire, la spécification du destin cellulaire et la polarité cellulaire planaire. Ce protocole est utilisé pour préparer des disques imaginaux pour la microscopie optique/fluorescente.

Dissection et Immunocoloration Imaginal disques de Drosophila melanogaster

L'adulte drosophile cerveau est un système utile pour l' étude de circuits neuronaux, les fonctions supérieures du cerveau et des troubles complexes. Une méthode efficace pour disséquer tout le tissu du cerveau de la petite tête de mouche facilitera les études basées sur le cerveau. Nous décrivons ici une seule étape simple protocole, de la dissection des cerveaux adultes avec une morphologie bien préservée.

Une seule étape simple protocole Dissection pour Whole-mount Préparation des adultes<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

Ce protocole décrit la dissection et immunostaining des adultes Drosophila melanogaster tissus du cerveau. Plus précisément, ce protocole met en évidence l’utilisation de Drosophila champignon corps et photorécepteur neurones comme des sous-ensembles neuronale exemple qui peuvent être utilisés avec précision afin de découvrir les principes généraux de nombreux aspects du développement neuronal.

Dissection et immunofluorescence souillant de champignon corps et photorécepteur de neurones dans le cerveau adulte Drosophila melanogaster

Cet article présente une méthode chirurgicale dissection Drosophila pupes rétines ainsi que de protocoles pour le traitement du tissu pour l’immunohistochimie, l’Ouest analyse et extraction de l’ARN.

Dissection de la rétine de pupes de drosophile pour immunohistochimie, analyse occidentale et isolement d’ARN

Cette étude présente un protocole simplifié pour le traitement des tissus impliquant la décapitation, la fixation, la cryosection, la coloration par fluorescence, l’immunocoloration et l’imagerie, qui peut être étendu à l’imagerie confocale et multiphotonique. La méthode maintient une efficacité comparable à celle des dissections complexes, en contournant le besoin de motricité avancée. L’analyse quantitative d’images offre un vaste potentiel d’investigation.

Cryosectionnement direct des têtes de drosophile pour une coloration par fluorescence cérébrale et une immunocoloration améliorées

Apprenez la dissection, l'immunohistochimie et le montage de cerveaux de Drosophila larvaires et adultes pour visualiser les lobes optiques. Ce protocole optimise l'imagerie des structures neuronales tridimensionnelles.

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