Name: Application de thérapie de phage pour contrecarrer l’infection de Pseudomonas aeruginosa dans les embryons de poisson zèbre de fibrose kystique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-12T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Découvrez la préparation et l'administration d'un cocktail de phages contre Pseudomonas aeruginosa dans des embryons de poisson zèbre. Cette méthode permet d'évaluer l'efficacité de la thérapie phagique in vivo.

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Ces travaux ont été soutenus par la Fondation italienne de la fibrose kystique (FFC#22/2017; Associazione « Gli amici della Ritty » Casnigo et FFC#23/2019; Un respiro in più Onlus La Mano tesa Onlus).

Le poisson zèbre adulte (Danio rerio) de la souche AB (European Zebrafish Resource Center EZRC) est maintenu selon les directives internationales (directive européenne 2010/63/UE) et nationales (décret italien du4 mars 2014, n° 26) sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques. Les conditions normales sont fixées dans l’installation de pêche avec un cycle sombre de 14 h/10 h et une température de l’eau du réservoir à 28 °C.
1. Préparation de solutions et d’outils
<ol><li>Préparer une solution 50x stock et 1x solutions de travail pour le milieu embryonnaire E3 pour la culture d’embryons de poisson zèbre (voir tableau 1).</li>
	<li>Faire la solution de blocage de pigmentation, pour bloquer la pigmentation de l’embryon de 24 heures après la fécondation (24 hpf) (voir le tableau 1).</li>
	<li>Préparez 25x stock et 1x working Tricane solution anesthésique tel que décrit dans le tableau 1. REMARQUE : Pour éviter le gel et le dégel répétés de la solution qui pourraient endommager la solution de stock, faites des aliquots de 2 mL de tricaine 25x et stockez-les à -20 °C.</li>
	<li>Préparer les traces de microinjection embryonnaire en dissolvant 1 g d’agarose dans 100 mL de H2O distillé dans un flacon ou une bouteille micro-ondes. Cuire au micro-ondes de 1 à 3 minutes jusqu’à ce que l’agarose soit complètement dissoute.</li>
	<li>Placez les moules de microinjection de poisson zèbre (voir tableau des matériaux)retournés à l’envers dans une boîte de Pétri (90 mm x 15 mm) et couvrez toute la surface en versant le gel d’agarose liquide d’une largeur d’environ 10 mm.</li>
	<li>Enlever le moule une fois que l’agarose s’est solidifiée. Remplir la boîte de Pétri d’un milieu embryonnaire 1x E3. Celui-ci peut être stocké à 4 °C pendant environ une semaine. Avant utilisation, remplacer par le milieu E3 frais contenant de la Tricaine. REMARQUE : Les moisissures plus anciennes peuvent développer des champignons ou des contaminations bactériennes.</li>
	<li>Utilisez des capillaires borosilicate de 10 cm polis par le feu pour préparer les aiguilles à la microinjection et fixez-les au puller micropipette en serrant les poignées. Réglez le puller avec les réglages suivants : chaleur 500, vitesse 100, temps 150, tirez 150.</li>
</ol>2. P. aeruginosa (PAO1) préparation inoculum
<ol><li>Inoculer 1 colonie de GFP+P. aeruginosa souche PAO119 dans 5 mL de bouillon LB (voir tableau 1) et grandir pendant la nuit à 37 °C avec secousses (200 rpm).</li>
	<li>Diluer la culture de nuit ci-dessusà OD 600 = 0,1 dans 10 mL de bouillon LB et passer àOD 600 = 0,5 à 37 °C avec secousses (200 rpm).</li>
	<li>Centrifugeuse 2 mL de la culture pendant 2 min à 4 °C à 16 100 x g et resuspendre la pastille cellulaire àod 600 = 1, équivalent à environ 1 x 109 cfu/mL, dans 1 mL de la solution physiologique (voir le tableau 1).</li>
	<li>Diluer la suspension cellulaire à environ 5 x 107cfu/mL en solution physiologique et la conserver à 4 °C.</li>
</ol>3. Préparation des stocks de phages
<ol><li>Inoculer 1 colonie de souche P. aeruginosa PAO1 dans 5 mL de bouillon LB et incuber pendant la nuit à 37 °C avec secousses. Diluer la culture du jour au lendemain à600 OD = 0,01 dans 500 mL de bouillon LB et croître à 37 °C avec secouant àOD 600 = 0,05, équivalent à environ 2,5 x 107 cfu/mL.</li>
	<li>À la culture diluée de P. aeruginosa, ajouter environ 1,25 x 107 phages, pour obtenir la multiplicité de l’infection (M.O.I.) de 10-3. Incuber à 37 °C en secouant jusqu’à ce quel’OD 600 tombe à environ 0,1-0,3 (en environ 3 à 5 h, selon le phage utilisé). NOTE: Quatre phages ont été sélectionnés pour cette expérience qui infectent la souche PAO1: Deux Podoviridae, GenBank numéros d’adhésion vB_PaeP_PYO2, MF490236, et vB_PaeP_DEV, MF490238, et deux Myoviridae, vB_PaeM_E215, MF490241, et vB_PaeM_E217, MF490240. Effectuez les étapes ci-dessous pour chaque phage individuellement.</li>
	<li>Incuber le lysate avec 1 mg/mL de DNase et de RNase pendant 30 min à 37 °C. Centrifugeuse à 5000 x g pendant 30 min à 4 °C et récupérer soigneusement le supernatant (SN). Filtrer le SN avec un filtre ayant un diamètre de pore de 0,8 μm.</li>
	<li>Au SN, ajouter 58 g/L de NaCl et 105 g/L de PEG6000. Dissoudre en remuant à RT 20 min, puis le garder toute la nuit à 4 °C. Centrifugeuse à 20 000 x g pendant 30 min à 4 °C pour les précipitations de phage. Retirez le SN et dissolvez soigneusement la pastille de phage dans 15 mL de tampon TN (voir le tableau 1).</li>
	<li>Purifiez les phages avec le gradient de densité de CsCl tel que décrit dans les étapes ci-dessous.<ol>
<li>Dans un tube d’ultracentrifugeuse polyallomer pour rotor SW41, préparez un gradient de densité d’étape CsCl en stratifiant 2 mL des quatre solutions CsCl décrites dans le tableau 1.  Ajouter 3,5 mL de suspension phage dans chacun des 4 tubes. REMARQUE : Le CsCl est toxique, adoptez les procédures de sécurité appropriées pour le manipuler et le jeter.</li>
		<li>Introduisez les tubes dans le rotor et assurez-vous que les tubes sont équilibrés (la différence de poids entre les deux tubes orientés doit être ≤ 0,01 g).</li>
		<li>Centrifugeuse de 2 h à 4 °C et 100 000 x g (25 000 rpm pour le rotor SW41). Après centrifugation, retirez lentement les tubes et immobilisez-les soigneusement sur un support. À l’aide d’une seringue à aiguille de 19 G, tracez la bande blanche/opalescente qui se trouve habituellement entre la région d=1,5 et la région de densité d=1,4.</li>
		<li>Transférez les suspensions de la seringue dans de nouveaux tubes en polyallomer pour le rotor SW60 et utilisez la solution d=1.4 pour équilibrer avec précision les tubes.</li>
		<li>Centrifugeuse la suspension à 4 °C et 150 000 x g (38 000 rpm pour le rotor SW60) pendant au moins 16 h.</li>
		<li>Recueillir la bande visible comme ci-dessus (voir l’étape 3.3.3) et les transférer dans des tubes de dialyse avec 6.000 Da cut-off. Dialyz la bande visible obtenue 2x pendant 20 min contre 500 mL d’eau et pendant la nuit contre 500 mL de tampon TN. Filtrer à l’intérieur d’un filtre pore de 0,22 μm et le conserver à 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Préparation de cocktail de Phage
<ol><li>Faire un mélange de quatre phages qui infectent la souche PAO1, précédemment isolé et caractérisé8. Avant de mélanger, estimer le titer de chaque stock de phage par essai de plaque20.</li>
	<li>Assembler le cocktail phage, avec un titer global de 5 × 108 pfu/mL, en mélangeant également quatre préparations de phages au même pfu/mL immédiatement avant chaque expérience, afin d’assurer des titres de phage précis.</li>
</ol>5. Collecte et préparation d’embryons de poisson zèbre pour la microinjection de cftr morpholinos
REMARQUE : Recueillir 1 à 2 embryons cellulaires à partir de poissons zèbres de type sauvage pour la microinjection de cftr morpholinos(cftr-MOs).
<ol><li>Deux jours avant l’expérience de microinjection bactérienne, mettre en place des couples reproducteurs et recueillir des embryons comme décritprécédemment 21. Le poisson zèbre adulte (Danio rerio) de la souche AB a été acheté auprès de l’European Zebrafish Resource Center, EZRC.</li>
	<li>Le lendemain, recueillir les embryons immédiatement après la fécondation à l’aide d’une pipette en plastique ou à l’aide d’une passoire à mailles fines. Placez les embryons recueillis dans une boîte de Pétri contenant du milieu embryonnaire E3 et retirez soigneusement les débris avec une pipette en plastique pour éviter la contamination qui pourrait endommager le développement de l’embryon.</li>
	<li>Préparer 5 μL de solution d’injection de morpholino en diluant les deux solutions de stock de morpholino (1 mM) dans l’eau stérile à une concentration finale de 0,25 pmol/embryon ATG-MO + 0,25 pmol/épissage embryonnaire-MO. Pour retracer l’injection d’embryons, ajouter 0,5 μL de rouge phénol au mélange de solution d’injection de morpholino.</li>
	<li>Chargez une aiguille de microinjection avec environ 5 μL de la solution de mélange morpholino à l’aide d’une micropipette de 20 μL avec une pointe de chargement de gel fin. Fixez l’aiguille au micromanipulateur relié à un support et placez-la sous un stéréomicroscope. REMARQUE : Il n’est pas nécessaire que la solution atteigne le bout de l’aiguille car la pression de la pompe à microinjecteur la poussera.</li>
	<li>Couper le bout de l’aiguille en coupant la pointe de l’aiguille à l’aide d’une pince stérile fine. Mesurer le diamètre de la chute à l’aide d’une barre d’échelle dans l’oculaire du microscope. Sinon, créez une goutte d’huile minérale sur une glissière de micromètre et réglez le volume de microinjection en injectant la solution dans la goutte d’huile pour évaluer la taille de la gouttelette. Utilisez une goutte d’un diamètre de 156 μm pour injecter un volume de 2 nL.</li>
	<li>Réglez le microinjecteur en ajustant la pression de compensation à 15 hPa, le temps d’injection à 0,5 s, et la pression d’injection entre 300 et 600 hPa pour obtenir le volume d’injection correct selon l’aiguille utilisée.</li>
	<li>À l’aide d’une pipette en plastique, disposer les embryons de l’étape 5.2 sur un verre placé dans une boîte petri de 96 mm de diamètre. REMARQUE : Trop de milieu E3 empêchera la pénétration appropriée de l’aiguille de microinjection dans la chorion des embryons.</li>
	<li>Pénétrer dans la chorion, puis le jaune avec l’aiguille pour injecter 2 nL dans l’embryon comme décrit précédemment22.</li>
	<li>Placer les embryons injectés dans une boîte de Pétri avec le milieu E3 et les mettre dans un incubateur à 28 °C pour les laisser se développer jusqu’au lendemain.</li>
</ol>6. Microinjection d’embryons de poisson zèbre avec des bactéries et cocktail de phages
REMARQUE : Pour effectuer une infection systémique, l’embryon doit avoir une circulation sanguine qui commence habituellement après 26 hpf.
<ol><li>Après 26 hpf (pour les stades de développement du poisson zèbre se réfèrent à Kimmel21) embryons de déchorionate avec solution de pronase préparé en dissolvant la poudre de pronase dans le milieu E3 à une concentration de 2 mg/mL. Pipette doucement les embryons pour briser la chorion. Jeter le pronase/E3 moyen et rincer le plat plusieurs fois avec de l’E3 frais pour enlever toutes les pronases.</li>
	<li>Anesthésier les embryons de poisson zèbre dans le milieu E3 contenant de la tricaine environ 5 minutes avant les injections.</li>
	<li>Pipette les embryons anesthésiés dans la piste préparée à l’étape 1. Utilisez une pointe de chargement de gel fin pour tapisser les embryons en position latérale.</li>
	<li>Chargez une aiguille de microinjection avec approximativement 5 μL de la préparation de P. aeruginosa telle que décrite dans la partie 5.</li>
	<li>Insérez l’aiguille dorsalement au point de départ du conduit de Cuvier où elle commence à s’étendre sur le sac jaune. Injectez un volume de 1-3 nL et assurez-vous que le volume augmente directement dans le conduit et entre dans la circulation.</li>
	<li>Environ après chaque 50 embryon injecté, injecter une goutte de la bactérie dans un tube de centrifugeuse de 1,5 mL avec 100 μL de PBS stérile pour vérifier si le volume d’injection reste le même. Plaquez l’inoculum sur l’agar LB (voir le tableau 1)à 37 °C pendant la nuit pour évaluer l’AFU.</li>
	<li>Transférer les embryons microinjectés dans deux boîtes de Pétri propres avec un milieu E3 frais + PTU et les incuber à 28 °C.</li>
	<li>À deux moments choisis : 30 min ou 3 h après l’injection bactérienne, sortez l’une des boîtes de Pétri avec des embryons injectés par des bactéries de l’incubateur et alignez-les sur la piste décrite dans 6,3 pour l’injection de cocktail de phage.</li>
	<li>Chargez une aiguille de microinjection avec environ 5 μL du cocktail phage (préparé à l’étape 4) avec une pointe de chargement de gel fin et fixez-la au microinjecteur (voir l’étape 5).</li>
	<li>Injecter le cocktail de phages dans le conduit de Cuvier des embryons précédemment injectés avec des bactéries.</li>
	<li>Transférer les embryons microinjectés dans deux boîtes de Pétri propres avec un milieu E3 frais + PTU et les incuber à 28 °C.</li>
</ol>7. Évaluation de la charge bactérienne des embryons injectés avec pao1 et phages
<ol><li>À 8 hpi, pipette 15 embryons anesthésiés de la boîte de Petri à un tube de centrifugeuse de 1,5 mL.</li>
	<li>Remplacez la solution anesthésique par 300 μL de 1% Triton X-100 dans PBS (PBSTritonX) et homogénéisez les embryons en les passant au moins 15x par une seringue d’insuline avec une aiguille stérile de 27 G.</li>
	<li>Préparer des dilutions en série d’homogénéités dans le PBS stérile en transférant 100 μL de l’homogénéité diluée en 900 μL de PBS stérile.</li>
	<li>Pour sélectionner la souche PAO1 naturellement résistante aux amplis, plaquez 100 μL des dilutions sur l’agar LB ajoutées à l’ampicilline (100 μg/mL) et incubez à 37 °C la nuit.</li>
	<li>Le lendemain, compter le nombre de colonies, multiplier par le facteur de dilution pour déterminer le nombre total de CFU, et diviser par le nombre d’embryons homogénéisés pour obtenir le nombre moyen de CFU / embryon infecté.</li>
</ol>8. Évaluation de la létalité des embryons injectés avec pao1 et phages
<ol><li>Pour évaluer la létalité de l’infection à PAO1, évaluez les embryons injectés à 20 hpi sous un stéréomicroscope et comptez pour les embryons morts (blancs/non transparents).</li>
	<li>Calculer la dose demi-maximale de concentration létale 50 (LD50) de PAO1 qui détermine la mort de 50 % des embryons injectés à 20 hpf.</li>
</ol>9. Préparation embryonnaire pour l’imagerie en accéléré stéréomicroscope de l’infection à GFP+ PAO1
<ol><li>Preparate le moule pour l’imagerie d’embryon vivant en dissolvant 1.5% agarose de fusion basse dans 100 mL de solution d’E3.</li>
	<li>Ajouter 1 % de Tricaine (voir le tableau 1)pour anesthésier les embryons.</li>
	<li>À 4 hpi transférer un embryon avec une pipette en plastique dans un plat de fond de verre et ajouter la solution chaude à faible point de fusion agarose.</li>
	<li>Placez le plat de fond en verre sous un stéréomicroscope et avec une position de pointe de l’embryon dans l’orientation désirée. Utilisez une pipette en plastique pour ajouter soigneusement une goutte d’agarose sur l’embryon.</li>
	<li>Laisser refroidir l’agarose pendant 5-10 min et remplir délicatement le plat de fond en verre avec l’E3 contenant la solution anesthésique pour garder l’embryon humide.</li>
	<li>Placez le plat de fond en verre avec l’embryon sous le stéréomicroscope fluorescent avec un filtre fluorescent (canal 488 nm) pour GFP+ bactéries. N’enlevez pas la boîte de Pétri jusqu’à d’autres acquisitions avec les mêmes paramètres à 9, 14 et 18 hpi.</li>
</ol>10. Analyses d’expression des cytokines pro-inflammatoires
<ol><li>À 20 hpi anesthésier les embryons avec la solution tricaine 1x et les transférer de la boîte de Petri à un tube de centrifugeuse de 1,5 mL.</li>
	<li>Sous un capot de fumée enlever la solution anesthésique et remplacer par 200 μL de réagencé d’hydrochlorure de guanidium.</li>
	<li>Homogénéiser les embryons en les pipetant de façon répétitive à travers une pipette de 200 μL d’abord, puis au moins 15x avec une seringue à insuline avec une aiguille stérile de 27 G.</li>
	<li>Extraire l’ARN total des embryons homogénéisés de poisson zèbre à l’aide d’un hydrochlorure de guanidium disponible dans le commerce, selon les instructions du fabricant.</li>
	<li>Traiter 1 μg de chaque échantillon d’ARN avec 2 μL de 1U/μL de DNase I (sans RNase), selon les instructions du fabricant.</li>
	<li>Utilisez 1 μg d’ARN traité par DNase I pour la réaction de transcription inverse (RT) à l’aide du kit disponible dans le commerce (voir tableau des matériaux),dans un volume total de 20 μL selon les instructions du fabricant.</li>
	<li>Effectuez la réaction rt qPCR dans un volume total de 10 μL contenant 1x SYBR Green mastermix en utilisant 1,5 μL d’une dilution de 1:6 de la réaction RT. À des fins de normalisation, utilisez les amorces pour les gènes d’entretien ménager rpl8 et pour les cytokines pro-inflammatoires, utilisez des amorces pour le TNF-α et l’IL-1β (voir le tableau 2). le protocole qPCR était : cycle 1 étape 1 : 95 °C, 2 min, répétition une fois ; cycle 2 : étape 1 95 °C, 10 s, étape 2 55 °C, 30 s, répétition 40x; cycle 3: étape 1 72 °C, 15 min.</li>
</ol>

<ol><li>Cisek, A. A., Dąbrowska, I., Gregorczyk, K. P., Wyżewski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+Therapy+in+Bacterial+Infections+Treatment%3A+One+Hundred+Years+After+the+Discovery+of+Bacteriophages%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Phage Therapy in Bacterial Infections Treatment: One Hundred Years After the Discovery of Bacteriophages.</a> Current Microbiology. 74 (2), 277-283 (2017).</li>
<li>Trend, S., Fonceca, A. M., Ditcham, W. G., Kicic, A., Cf, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+phage+therapy+in+cystic+fibrosis%3A+Essential+human-bacterial-phage+interactions+and+delivery+considerations+for+use+in+Pseudomonas+aeruginosa-infected+airways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cystic+Fibrosis%22%5BJournal%5D)">The potential of phage therapy in cystic fibrosis: Essential human-bacterial-phage interactions and delivery considerations for use in Pseudomonas aeruginosa-infected airways.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 16 (6), 663-667 (2017).</li>
<li>Pacios, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+to+combat+multidrug-resistant+and+persistent+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Strategies to combat multidrug-resistant and persistent infectious diseases.</a> Antibiotics. 9 (2), 65(2020).</li>
<li>Dubos, R. J., Straus, J. H., Pierce, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multiplication+of+bacteriophage+in+vivo+and+its+protective+effect+against+an+experimental+infection+with+shigella+dysenteriae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">The multiplication of bacteriophage in vivo and its protective effect against an experimental infection with shigella dysenteriae.</a> Journal of Experimental Medicine. 78 (3), 161-168 (1943).</li>
<li>Marza, J. A. S., Soothill, J. S., Boydell, P., Collyns, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplication+of+therapeutically+administered+bacteriophages+in+Pseudomonas+aeruginosa+infected+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Burns%22%5BJournal%5D)">Multiplication of therapeutically administered bacteriophages in Pseudomonas aeruginosa infected patients.</a> Burns. 32 (5), 644-656 (2006).</li>
<li>Heo, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibacterial+efficacy+of+phages+against+Pseudomonas+aeruginosa+infections+in+mice+and+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Antibacterial efficacy of phages against Pseudomonas aeruginosa infections in mice and Drosophila melanogaster.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 01646(2009).</li>
<li>McVay, C. S., Velásquez, M., Fralick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+therapy+of+Pseudomonas+aeruginosa+infection+in+a+mouse+burn+wound+model%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Phage therapy of Pseudomonas aeruginosa infection in a mouse burn wound model.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 01028(2007).</li>
<li>Forti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+broad-range+bacteriophage+cocktail+that+reduces+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+and+treats+acute+infections+in+two+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Design of a broad-range bacteriophage cocktail that reduces Pseudomonas aeruginosa biofilms and treats acute infections in two animal models.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 02573(2018).</li>
<li>Jault, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+tolerability+of+a+cocktail+of+bacteriophages+to+treat+burn+wounds+infected+by+Pseudomonas+aeruginosa+%28PhagoBurn%29%3A+a+randomised%2C+controlled%2C+double-blind+phase+1%2F2+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Efficacy and tolerability of a cocktail of bacteriophages to treat burn wounds infected by Pseudomonas aeruginosa (PhagoBurn): a randomised, controlled, double-blind phase 1/2 trial.</a> Lancet Infectious Diseases. 19 (1), 35-45 (2019).</li>
<li>Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., Singer, J. T., Yoder, J. A., Kim, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+resistance+to+Pseudomonas+aeruginosa+infection+in+zebrafish+is+mediated+by+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Infections+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Specific resistance to Pseudomonas aeruginosa infection in zebrafish is mediated by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Infections and Immunity. 78, 4542-4550 (2010).</li>
<li>Clatworthy, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+infection+of+zebrafish+involves+both+host+and+pathogen+determinants%5BTitle%5D)+AND+%22Infections+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa infection of zebrafish involves both host and pathogen determinants.</a> Infections and Immunity. 77, 1293-1303 (2009).</li>
<li>Bernut, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+Protects+against+Mycobacterium+abscessus+Infection+by+Fine-Tuning+Host+Oxidative+Defenses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">CFTR Protects against Mycobacterium abscessus Infection by Fine-Tuning Host Oxidative Defenses.</a> Cell Reports. 26 (7), 1828-1840 (2019).</li>
<li>Semler, D. D., Goudie, A. D., Finlay, W. H., Dennis, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aerosol+phage+therapy+efficacy+in+Burkholderia+cepacia+complex+respiratory+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Aerosol phage therapy efficacy in Burkholderia cepacia complex respiratory infections.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 02388(2014).</li>
<li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), e3781(2012).</li>
<li>Doring, G., Gulbins, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis+and+innate+immunity%3A+how+chloride+channel+mutations+provoke+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis and innate immunity: how chloride channel mutations provoke lung disease.</a> Cellular Microbiology. 11, 208-216 (2009).</li>
<li>Navis, A., Bagnat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+cftr+function+leads+to+pancreatic+destruction+in+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Loss of cftr function leads to pancreatic destruction in larval zebrafish.</a> Developmental Biology. 399, 237-248 (2015).</li>
<li>Navis, A., Marjoram, L., Bagnat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cftr+controls+lumen+expansion+and+function+of+Kupffer%27s+vesicle+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cftr controls lumen expansion and function of Kupffer's vesicle in zebrafish.</a> Development. 140, 1703-1712 (2013).</li>
<li>Balloy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+and+cystic+fibrosis+human+bronchial+epithelial+cells+infected+with+Pseudomonas+aeruginosa+exhibit+distinct+gene+activation+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Normal and cystic fibrosis human bronchial epithelial cells infected with Pseudomonas aeruginosa exhibit distinct gene activation patterns.</a> PLoS One. 10, 0140979(2015).</li>
<li>Cafora, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+therapy+against+Pseudomonas+aeruginosa+infections+in+a+cystic+fibrosis+zebrafish+model%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Phage therapy against Pseudomonas aeruginosa infections in a cystic fibrosis zebrafish model.</a> Science Reports. 9, 1527(2019).</li>
<li>Hershey, A. D., Kalmanson, G. M., Bronfenbrenner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+methods+in+the+study+of+the+phage-antiphage+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Quantitative methods in the study of the phage-antiphage reaction.</a> Journal of Immunology. 46, 267-279 (1943).</li>
<li>Kimmel, C., Ballard, W., Kimmel, S., Ullmann, B., Schilling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), e1115(2009).</li>
<li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zebrafish+as+a+Model+Organism+to+Study+Development+of+the+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Zebrafish as a Model Organism to Study Development of the Immune System.</a> Advances in Immunology. 81, 253-330 (2003).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans ce manuscrit, nous avons décrit le protocole pour effectuer l’infection de P. aeruginosa (PAO1) dans les embryons de poisson zèbre et comment appliquer la thérapie de phage avec un cocktail de phages précédemment identifiés comme capables d’infecter PAO1 pour le résoudre. L’utilisation de bactériophages comme alternative aux traitements antibiotiques est de plus en plus intéressante depuis quelques années. Cela est principalement dû à la diffusion d’infections bactériennes multirésistantes (DMR), qui consti...

La thérapie par phages, l’utilisation des ennemis naturels des bactéries pour combattre les infections bactériennes, suscite un regain d’intérêt à mesure que la résistance bactérienne aux antibiotiques segénéralise 1,2. Cette thérapie, utilisée depuis des décennies en Europe de l’Est, pourrait être considérée comme un traitement complémentaire aux antibiotiques dans le traitement des infections pulmonaires chez les patients atteints de FK et une alternative thérapeutique possible pour les patients infectés par des bactéries qui sont résistantes à tous les antibiotiquesactuellement utilisés 2,3. Les avantages de la thérapie antibiotique sont que les bactériophages se multiplient au site de l’infection, tandis que les antibiotiques sont métabolisés etéliminés du corps 4,5. En effet, l’administration de cocktails de phages virulents isolés dans différents laboratoires s’est avérée efficace dans le traitement des infections pseudomonas aeruginosa chez des modèles animaux aussi différents que les insectes et lesmammifères 6,7,8. Il a également été démontré que la thérapie par phages était en mesure de réduire le fardeau bactérien des brûlures infectées par P. aeruginosa et Escherichia coli dans le cadre d’un essai cliniquerandomisé 9.
Zebrafish (Danio rerio) a récemment émergé comme un modèle précieux pour étudier les infections avec plusieurs agents pathogènes, y compris P. aeruginosa10,11, Mycobacterium abccessus et Burkolderia cepacia12,13. En microinjectant les bactéries directement dans la circulation sanguine de l’embryon14, il est facile d’établir une infection systémique qui est contrecarrée par le système immunitaire inné du poisson zèbre, qui est évolutif conservé avec des neutrophiles et la génération de macrophages similaires à la contrepartie humaine. En outre, au cours du premier mois de vie, les embryons de poisson zèbre n’ont pas la réponse immunitaire adaptative, ce qui en fait des modèles idéaux pour étudier l’immunité innée, qui est le mécanisme de défense critique dans les infections pulmonaireshumaines 15. Zebrafish a récemment émergé comme un système de modèle génétique puissant pour mieux comprendre l’apparition des FC et de développer de nouveaux traitements pharmacologiques10,16,17. Le modèle cf zebrafish de cftr knock-down généré par injection de morpholino chez le poisson zèbre présentait une réponse d’éclatement respiratoire amortie et une diminution de la migration des neutrophiles10, tandis que le knock-out cftr conduit à une altération de la position interne des organes et à la destruction du pancréas exocrine, un phénotype qui reflète la maladie humaine16,17. Le plus grand intérêt était la conclusion que la charge bactérienne de P. aeruginosa était sensiblement plus élevée dans cftr-perte-de-fonction embryons que dans les contrôles à 8 heures après infection (hpi), qui fait le parallèle avec les résultats obtenus avec des souris et des cellules épithéliales bronchiqueshumaines 2,18.
Dans ce travail, nous démontrons que la thérapie de phage est efficace contre des infections de P. aeruginosa dans les embryons de zebrafish.

<table><tbody><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10043-52-4</td><td></td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>289329</td><td></td></tr><tr><td>Phospate de Dulbecco solution saline tamponnée PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate méthanesulfonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>886-86-2</td><td>nom commun tricaïne</td></tr><tr><td>Micromanipulateur Femtojet</td><td>Eppendorf</td><td>5247</td><td></td></tr><tr><td>Fleming/brown P-97</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>LE-Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11685660001</td><td></td></tr><tr><td>Agarose à bas point de fusion</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS 9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7487-88-9</td><td></td></tr><tr><td>Bleu</td> <td>de méthyleSigma-Aldrich</td><td>28983-56-4</td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles de micro-injection</td> Appareil <td></td><td></td><td>de Harvard</td></tr><tr><td>N-Phénylthiourée >=98 %</td><td>Aldrich-P7629</td><td>103-85-5</td><td></td></tr><tr><td>Oligo Morpholino</td><td>Gene Outils</td><td></td><td>conçus par le chercheur</td></tr><tr><td>PEG6000</td><td>Calbiochem</td><td>528877</td><td></td></tr><tr><td>Phenol Red Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS 143-74-B</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure</td><td>de potassium Sigma-Aldrich</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9036-06-0</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium réactif ACS, &ge ; 99.0 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Leica</td><td>S9I</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Triton X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Oxoid</td><td>LP0042B</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Oxoid</td><td>LP0021B</td><td></td></tr><tr><td>Z-MOLDS Microinjection</td><td>Word Instruments de</td><td></td><td></td> précision</tr></tbody></table>

application de thérapie de phage pour contrecarrer l’infection de pseudomonas aeruginosa dans les embryons de poisson zèbre de fibrose kystique

Phage Therapy Application to Counteract Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis Zebrafish Embryos

La résistance aux antimicrobiens, une conséquence majeure de l’incertitude diagnostique et de la surprescription antimicrobienne, est une cause de plus en plus reconnue d’infections graves, de complications et de mortalité dans le monde entier, avec un impact énorme sur notre société et sur le système de santé. En particulier, les patients dont le système immunitaire est affaibli ou qui souffrent de pathologies préexistantes et chroniques, comme la fibrose kystique (FK), sont soumis à des traitements antibiotiques fréquents pour contrôler les infections par l’apparition et la diffusion d’isolats multirésistants. Par conséquent, il est urgent de s’attaquer aux thérapies alternatives pour contrer les infections bactériennes. L’utilisation de bactériophages, ennemis naturels des bactéries, peut être une solution possible. Le protocole détaillé dans ce travail décrit l’application de la thérapie de phage contre l’infection de Pseudomonas aeruginosa dans les embryons de zebrafish de CF. Les embryons de poisson zèbre ont été infectés par P. aeruginosa pour démontrer que la thérapie par phage est efficace contre les infections à P. aeruginosa, car elle réduit la létalité, la charge bactérienne et la réponse immunitaire pro-inflammatoire chez les embryons atteints de FK.

Les résultats et les chiffres présentés ici sont renvoyés aux embryons de FK générés par l’injection de cftr morpholinos tel que décritprécédemment 10 et à l’étape 5. Pour valider le phénotype de CF, la position altérée des organes internes tels que le coeur, le foie, et le pancréas commeprécédemment décrit 17 (figure 1) ont été considérées. Des résultats similaires ont été obtenus dans le cas des embryons wt tels que rapportés dans no...

Présenté ici est un protocole pour l’infection de Pseudomonas aeruginosa et l’application de thérapie de phage dans les embryons de poisson zèbre de fibrose kystique (CF).

Application de thérapie de phage pour contrecarrer l’infection de Pseudomonas aeruginosa dans les embryons de poisson zèbre de fibrose kystique

Antimicrobial resistance, a major consequence of diagnostic uncertainty and antimicrobial overprescription, is an increasingly recognized cause of severe ...

Ce protocole facilite la préparation et l’administration d’un cocktail viral et phage contre les pseudomonas aeruginosa chez les embryons de poisson zèbre. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une évaluation in vivo de l’efficacité du phage dans la lutte contre l’infection bactérienne. Le cocktail phage est efficace dans les modèles de poisson zèbre de type sauvage et de fibrose kystique.Ouvrir la possibilité d’appliquer la thérapie de phage aux infections bactériennes dans les patients de mucoviscidose. La thérapie par phage peut également être appliquée pour contrer des infections bactériennes spécifiques dans d’autres systèmes modèles. Préparer un stock de phages pour l’expérience.Ajouter 1,25 fois 10 aux septièmes phages à un OD 600 de 0,05 P.aeruginosa culture à une multiplicité d’infection d’une fois 10 aux trois négatifs et incuber la culture pendant trois à quatre heures avec secouant jusqu’à ce que l’OD 600 tombe à 0,1 à 0,3. À la fin de l’incubation, incuber le lysate avec un microgramme par millilitre de DNAse et RNAse pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Et pelleter les cellules par centrifugation.À la fin du filtre de centrifugation, le supernatant par un diamètre poreux de 0,8 micromètre et ajouter 58 grammes par litre de chlorure de sodium et 105 grammes par litre de PEG 6000. Incuber la solution à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, précipitez le phage par centrifugation.À la fin de la centrofugation enlever le supernatant et dissoudre soigneusement la pastille de phage en 15 millilitres de tampon de chlorure de sodium Tris. Pour purifier les phages par gradient de densité de chlorure de césium, stratifiez d’abord deux millilitres de quatre solutions différentes de chlorure de césium dans les tubes d’ultracentrifugeuse polyallomer pour un rotor SW 41 et ajoutez 3,5 millilitres de suspension de phage à chaque tube. Le chlorure de césium est toxique.Adoptez toujours des procédures de sécurité appropriées lors de la manipulation et de la mise au rebut de ce composé. Lorsque tous les tubes ont été chargés, placez les tubes dans le rotor en prenant soin que les tubes sont équilibrés. Et centrifuger les échantillons pendant deux heures à 100 000 fois g et quatre degrés Celsius.À la fin de la centrifugation, utilisez une seringue avec une aiguille de calibre 19 pour aspirer la couche blanche entre le D égale 1,5 et le D équivaut à 1,4 régions de densité. Et transférer les suspensions dans de nouveaux tubes en polyallomer de taille SW 60. Centrifuger les suspensions pendant au moins 16 heures à 150 000 fois g et quatre degrés Celsius.Et transférer les bandes visibles dans des tubes de dialyse avec une coupure de 6000 Dalton. Puis dialyser les échantillons prélevés deux fois contre 500 millilitres d’eau pendant 20 minutes par dialyse et toute la nuit contre 500 millilitres de tampon de chlorure de sodium Tris. Le lendemain matin, filtrez le stock de phages résultant avec un filtre pore de 0,22 micromètre et stockez le stock à quatre degrés Celsius.Le jour de la micro-injection diluer deux solutions micromolaires morpholinos stock dans l’eau stérile à une concentration finale de 0,25 picomolaire par embryon pour obtenir une solution d’injection de morpholino de cinq microlitres. Et ajouter 0,5 microlitres de rouge phénol à chaque solution. Ensuite, utilisez une micropipette de 20 microlitres avec une pointe de chargement de gel fin pour charger une aiguille d’injection micro avec tout le volume de solution mixte morpholino et fixer l’aiguille à un micro manipulateur relié à un support sous un microscope stéréo.Ensuite, avec une ou deux cellules, les embryons de poisson zèbre disposés sur une lame de verre placée dans une boîte petri de 96 millimètres de diamètre pénètrent dans la chorion et le jaune avec la pointe de l’aiguille de micro-injection et injectent deux nanolitres du mélange morphlino dans l’embryon. À 26 heures après la fécondation, chargez une aiguille de micro-injection avec environ cinq microlitres d’inoculum de P.aeruginosa et insérez l’aiguille dorsalement au point de départ du conduit de Cuvier au cours duquel le conduit commence à s’étendre sur le sac jaune. Injectez un à trois nanolitres de l’inoculum PAO1 dans l’embryon en vous assurant que le volume augmente directement dans le conduit et entre dans la circulation.Après le transfert d’injection, l’embryon dans l’une des deux nouvelles boîtes de Pétri contenant du moyen E3 frais complété par du phénylthiourea pendant une incubation de 30 minutes ou trois heures à 28 degrés Celsius. Ensuite, chargez une aiguille d’injection micro avec environ cinq microlitres du cocktail phage et fixez l’aiguille au micro-injecteur. Injectez ensuite un à trois nanolitres de cocktail de phage dans le conduit de Cuvier de chaque embryon précédemment injecté avec des bactéries et placez les embryons dans l’un des deux nouveaux plats de Petri contenant du milieu E3 frais complété par du phénylthiourea à 28 degrés Celsius.À quatre heures après l’infection, utilisez une pipette en plastique pour transférer un embryon anesthésié dans un plat de fond en verre. Et remplir le plat avec chaud faible point de fusion solution agarose. Lorsque l’agarose est froide, remplir délicatement le plat d’E3 moyen complété par une solution anesthésique.Placez le plat sous le microscope stéréo et utilisez une pointe de pipette pour positionner l’embryon dans l’orientation désirée. Placez ensuite le plat sous un microscope stéréo fluorescent avec un filtre fluorescent pour les bactéries positives GFP pendant jusqu’à 18 heures après l’infection et imagez l’embryon pour la progression de l’expression GFP à neuf, 14 et 18 heures après l’infection. Pour déterminer la charge bactérienne à huit heures après l’infection, transférez 15 embryons micro-injectés anesthésiés dans un tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre et remplacez la solution anesthésique par 300 microlitres de 1% Triton X-100 dans PBS.Passez les aiguilles à travers l’aiguille stérile de calibre 27 d’une seringue à insuline au moins 15 fois pour homogénéiser les embryons. Et préparer des dilutions en série de l’homogénéité en transférant 100 microlitres du mélange résultant en 900 microlitres de PBS stérile par dilution. Pour sélectionner pour la souche P.aeruginosa résistante à l’ampicilline naturelle, plaquez 10 microlitres des dilutions sur l’agar LB complétés par de l’ampicilline et incubez-les pendant la nuit à 37 degrés Celsius.Le lendemain, comptez le nombre de colonies. Permettre le calcul du nombre total d’unités de formation de colonies et le nombre moyen d’unités de formation de colonies par embryon infecté. Pour évaluer la létalité de l’infection à P.aeruginosa, marquer les embryons injectés à 20 heures après l’infection au microscope stéréo en comptant le nombre d’embryons blancs opaques morts.Calculez ensuite la demi-concentration létale maximale de 50 doses de P.aeruginosa qui a entraîné la mort de 50% des embryons injectés à 20 heures après l’infection. Pour valider le phénotype de la fibrose kystique, la position altérée des organes internes tels que le foie cardiaque et le pancréas peut être évaluée. La charge bactérienne est réduite par la thérapie par phage dans les embryons de fibrose kystique infectés par P.Aeruginosa.En 48 heures après la fécondation, les embryons de fibrose kystique infectés par la bactérie P.Aeroginosa positive de GFP, une colonie formant 30 unités par dose d’embryon démontre une létalité de 50 % à 20 heures après l’infection. La thérapie par phage est tout aussi efficace 20 heures après l’infection lorsqu’elle est administrée 30 minutes ou sept heures après l’injection bactérienne. Ici, une fibrose kystique et un embryon injecté positif de P.Aeruginosa de GFP à quatre, neuf, 14 et 18 heures après l’infection sont montrés.En revanche, la fibrose kystique plus P.Aeruginosa plus l’embryon injecté de phage démontre une fluorescence réduite due à l’action de phage contre les bactéries. La réponse inflammatoire générée par l’infection de P.aeruginosa dans les embryons de mucoviscidose est sensiblement augmentée comme indiqué par l’expression des cytokines pro-inflammatoires, de l’alpha de TNF et de la bêta d’interleukin 1 suivant l’injection de P.aeruginosa comparée au poisson zèbre injecté de contrôle. L’expression des deux cytokines inflammatoires est réduite dans les animaux co-injectés de cocktail de phage cependant.Les phages doivent être soigneusement purifiés pour éliminer toute endotoxine contaminante qui peut être conservée pendant la préparation. Les préparations des phages peuvent être analysées par microscopie électronique pour évaluer la morphologie virion. Il serait intéressant de vérifier si l’infection chez les patients humains par des bactéries autres que pseudomonas aeruginosa peut être guérie avec la thérapie de phage dans le modèle de poisson zèbre de fibrose kystique.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

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Application de thérapie de phage pour contrecarrer l’infection de Pseudomonas aeruginosa dans les embryons de poisson zèbre de fibrose kystique (Vidéo) | JoVE Journal

Application de thérapie de phage pour contrecarrer l’infection de Pseudomonas aeruginosa dans les embryons de poisson zèbre de fibrose kystique

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