Name: Application d’un système biréacticien uniaxial de stimulation mécanique tridimensionnelle pour induire la différenciation tenogène des cellules souches dérivées du tendon (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 4 s
Description: Découvrez l'application d'un bioréacteur uniaxial 3D pour induire la différenciation tenogène des cellules souches dérivées du tendon. Cette méthode reproduit les conditions physiologiques pour favoriser la formation de néo-tendons et traiter la tendinopathie.

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La recherche a été réalisée alors que l’auteur recevait « une bourse d’études internationales de l’Université d’Australie-Occidentale et un prix universitaire de troisième cycle à l’Université d’Australie-Occidentale ». Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (81802214).

Les méthodes décrites ont été approuvées et exécutées conformément aux lignes directrices et règlements du Comité d’éthique animale de l’Université d’Australie-Occidentale.
1. Isolement des souris TDSCs
<ol><li>Euthanasier les souris C57BL/6 de 6-8 semaines par dislocation cervicale.</li>
	<li>Moisson tendons rotuleux24 et tendons d’Achille25.</li>
	<li>Digest tendons de l’un avec 6 mL de collagènease de type I (3 mg/mL) pour 3 h. NOTE: Comme la taille du tendon de la souris est petite, tous les tendons récoltés à partir d’une souris doivent être utilisés dans cette étape.</li>
	<li>Recueillir les cellules et la culture dans le milieu essentiel complet (Alpha-MEM) contenant 10% du sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de la streptomycine et le mélange de pénicilline pendant 7 jours.</li>
	<li>Identifier les TDSC à l’aide du tri cellulaire activé par fluorescence par cytométrie de flux (expression des marqueurs de surface cellulaire, y compris CD44, CD90 et Sca-1; absence d’expression de CD34 et CD45).</li>
	<li>Cellules de passage et de congélation (les cellules de passage 4 seront utilisées pour d’autres étapes).</li>
</ol>2. Culture et expansion des souris TDSC
REMARQUE : Effectuez toutes les étapes dans un capot de biosécurité stérile.
<ol><li>Prenez les cellules réchauffées (souris TDSC, 1 million de cellules, passage 4, à 37 °C).</li>
	<li>Ajoutez lentement 4 à 5 mL supplémentaires de support minimal essentiel complet (Alpha-MEM).</li>
	<li>Transférer le mélange dans un tube de centrifugeuse de 15 mL à l’aide d’une pipette.</li>
	<li>Garnir d’un total moyen à 8 mL avec une pipette.<ol>
<li>Préwarm moyen dans un incubateur de four à 37 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placez le tube dans la centrifugeuse et l’équilibre.</li>
	<li>Cellules de centrifugeuse et de granulé à 347 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Sortir après la centrifugeuse et vérifier la pastille au fond.</li>
	<li>Décanter le milieu de congélation et resuspend les cellules doucement en 1-2 mL de milieu complet (éviter de faire trop de bulles).</li>
	<li>Transférer les cellules réesspendées dans une fiole T-75 par une pipette.</li>
	<li>Utilisez une pipette pour ajouter un alpha-MEM moyen complet à la fiole pour atteindre un volume total de 10 ml avec une concentration finale de 13 000 cellules/cm2.</li>
	<li>Placez la fiole dans l’incubateur et la culture à 37 °C avec 5% de CO2.</li>
	<li>Changer le milieu tous les 3 jours.</li>
	<li>Observez et surveillez les cellules au microscope lors du changement du milieu jusqu’à ce que les cellules soient cultivées à 100% confluent (environ 40 000 cellules/cm2).</li>
</ol>3. Préparation du milieu de culture de stimulation pour la formation de feuilles cellulaires
REMARQUE : Effectuez toutes les étapes dans un capot de biosécurité stérile.
<ol><li>Verser 15 ml de milieu Alpha-MEM complet dans un tube stérile de 15 ml.</li>
	<li>Ajouter 6 μL d’acide ascorbique (11 mg/mL) dans 15 mL de milieu pour une concentration finale de 4,4 μg/mL. REMARQUE : En plus d’ajouter 25 ng/mL facteur de croissance du tissu conjonctif dans le milieu de culture de stimulation peut accélérer l’ensemble du processus de croissance et de différenciation.</li>
	<li>Mélanger délicatement en inversant de haut en bas.</li>
</ol>4. Formation de feuille de cellule par la culture dans le milieu de stimulation
REMARQUE : Effectuez toutes les étapes dans un capot de biosécurité stérile.
<ol><li>Jetez soigneusement le milieu alpha-MEM complet normal et évitez de toucher les cellules fixées au fond de la fiole.</li>
	<li>Ajouter 10 mL de milieu de stimulation lentement et éviter de causer des perturbations aux cellules entièrement confluentes.</li>
	<li>Culture des cellules en milieu de stimulation pendant 9 jours (changer le milieu tous les 3 jours) pour générer suffisamment la feuille cellulaire à 37 °C avec 5% de CO2. REMARQUE : La matrice extracellulaire deviendra épaisse et présente pour être trouble lorsqu’elle est observée du fond de la fiole après avoir été stimulée par de l’acide ascorbique, ce qui signifie que la feuille cellulaire est suffisamment générée.</li>
</ol>5. Préparation de la construction de cellules souches du tendon 3D
REMARQUE : Effectuez toutes les étapes dans un capot de biosécurité stérile.
<ol><li>Sortez la fiole de l’incubateur.</li>
	<li>Jeter complètement le milieu de stimulation.</li>
	<li>Laver la feuille de cellule monocouche à l’une de la solution saline tampon de phosphate (PBS) en faisant tourbillonner la fiole.</li>
	<li>Jetez complètement le PBS.</li>
	<li>Utilisez une pipette pour ajouter 1 ml de trypsin de 0,25 % au coin de la fiole.</li>
	<li>Appuyez sur le coin de la fiole pour dé-attacher la feuille de cellule monocouche jusqu’à ce que le coin de la feuille de cellule soit hors du fond de la fiole.</li>
	<li>Ajoutez immédiatement 9 mL de support Alpha-MEM complet pour arrêter la trypsinisation.</li>
	<li>Continuer à tourbillonner la fiole pour décoller complètement la feuille de cellules monocouches.</li>
	<li>Verser la feuille de cellule totale dé-attachée dans une boîte de Pétri avec un milieu.</li>
	<li>Utilisez une pince à épiler stérile pour ramasser un coin de la feuille de cellule et tourner dans le sens des aiguilles d’une montre pendant 15 fois.</li>
	<li>Prenez une autre extrémité de la feuille cellulaire et tournez dans le sens inverse des aiguilles d’une montre pendant 10 fois pour générer fermement une construction in vitro semblable à un tendon (Figure 1A).</li>
</ol>6. Assemblage du complexe de stimulation mécanique uniaxial-stretching dans un bioréacteur unique conçu
REMARQUE : Effectuez toutes les étapes dans un capot de biosécurité stérile.
<ol><li>Connectez les crochets par le raccordeur et réglez-vous à la distance souhaitée (2 cm) entre deux crochets.</li>
	<li>Enroulez doucement la construction 3D TDSC sur le crochet assemblé 3 fois sur chaque crochet (Figure 1B).</li>
	<li>Fixer les crochets avec la construction de cellules sur la chambre du bioréacteur en serrant les vis sur deux extrémités. REMARQUE : Toute la chambre, y compris les vis et les crochets, est stérile (autoclave pendant 1,5 h à 134 °C et les rayons ultraviolets (UV) exposent pendant 24 heures avant l’utilisation). Pour le support métallique des chambres, la lumière UV s’expose pendant 48 heures avant l’utilisation.</li>
	<li>Remplissez la chambre avec un support Alpha-MEM complet.</li>
	<li>Connectez l’actionneur à la chambre de culture par câble.</li>
	<li>Couper le raccordeur de crochets par des ciseaux stériles.</li>
	<li>Allumez la puissance et le contrôleur de canal correspondant pour commencer la stimulation mécanique.</li>
	<li>Mettez le couvercle sur la chambre.</li>
	<li>Vérifiez les feux indicateurs et assurez-vous que le bioréacteur peut fonctionner correctement.</li>
	<li>Placez le bioréacteur dans l’incubateur et soumettez la construction de cellules 3D à des étirements mécaniques pendant 6 jours (6% d’étirement, 0,25 Hz, 8 h, suivi de 16 h de repos).</li>
</ol>7. Évaluation du tissu mécanique stimulé in vitro semblable à un tendon
<ol><li>Desserrez les vis par un tournevis et retirez soigneusement l’assemblage.</li>
	<li>Placez le tissu tendinaire dans 4% de paraformaldéhyde pour la fixation pendant 15 min.</li>
	<li>Placez le tissu fixé en forme de tendon dans une cassette de biopsie avec des coussinets en mousse de biopsie.</li>
	<li>Procédé pour déshydrater l’échantillon et finalement évaluer par H&E coloration histologique.</li>
	<li>Répétez l’ensemble du protocole et extrayez l’ARN du tissu tendinaire pour évaluer l’expression des marqueurs tenogènes par PCR quantitatif (qPCR). Les amorces pour les gènes sélectionnés sont répertoriées dans le tableau 1. REMARQUE : Le protocole histologie et le protocole qPCR sont standard et après une étude précédente21.</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le tendon est un tissu conjonctif fibreux mécanosensible. Selon des recherches antérieures, l’excès de charge mécanique pourrait conduire à la différenciation ostéogénique des cellules souches du tendon, alors qu’une charge insuffisante conduirait à une structure désordonnée de fibres de collagène au cours de la différenciation destendons 21.
Un point de vue commun est que la clé d’un bioréacteur idéal est la capacité de simuler le microenvironnement cellulaire in vitro...

La tendinopathie est l’une des blessures sportives courantes. Il se manifeste principalement par la douleur, l’enflure locale, la tension musculaire diminuée dans la zone affectée, et le dysfonctionnement. L’incidence de la tendinopathie est élevée. La présence de tendinopathie d’Achille est plus fréquente chez les coureurs de moyenne et longue distance (jusqu’à 29 %), tandis que la présence de tendinopathie patellaire est également élevée chez les athlètes de volley-ball (45 %), de basket-ball (32 %), d’athlétisme (23 %), de handball (15 %) et de soccer(13%) 1,2,3,,4,,5. Cependant, en raison de la capacité d’auto-guérison limitée du tendon, et l’absence de traitements efficaces, tendinopathie influence encore la vie des patients négativement6,7. En outre, la pathogénie de la tendinopathie reste peu claire. Il ya eu de nombreuses enquêtes sur sa pathogénie, principalement y compris la « théorie de l’inflammation », « théorie de la dégénérescence », « théorie de la surutilisation », et ainsi de suite8. À l’heure actuelle, de nombreux chercheurs croyaient que la tendinopathie était due à l’auto-réparation ratée aux micro-blessures causées par une charge mécanique excessive le tendon éprouve9,10.
Les cellules souches dérivées du tendon (TDSC), en tant que cellules précurseurs primaires des cellules du tendon, jouent un rôle essentiel dans le développement de la tendinopathie et dans la restauration fonctionnelle et structurelle après tendinopathie11,12,13. Il a été rapporté que la stimulation mécanique de contrainte pourrait causer la prolifération et la différenciation des ostéocytes, des ostéoblastes, des cellules musculaires lisses, des fibroblastes, des cellules souches mésenchymales et d’autres cellules sensibles à la force14,15,16,17,18. Par conséquent, les TDSC, en tant que l’une des cellules mécanosensibles et multipotentes, peuvent également être stimulées à différencier par chargement mécanique19,20.
Toutefois, différents paramètres de chargement mécanique (résistance au chargement, fréquence de chargement, type de chargement et période de chargement) peuvent inciter les TDSC à se différencier en différentes cellules21. Ainsi, un régime de chargement mécanique efficace et valide est très important pour la tenogenèse. En outre, il existe différents types de bioréacteurs que les systèmes de stimulation actuellement utilisés pour fournir le chargement mécanique aux TDSC. Les principes de chaque type de bioréacteur sont différents, de sorte que les paramètres de chargement mécanique correspondant à différents bioréacteurs sont également différents. Par conséquent, un protocole de stimulation simple, économique et reproductible est en demande, y compris le type de bioréacteur, le milieu de stimulation correspondant et le régime de chargement mécanique.
Le présent article décrit une méthode basée sur un système d’étirement uniaxial tridimensionnel (3D) pour stimuler les TDSC à se différencier en tissu tendinaire. Il y a sept étapes du protocole : isolement des souris TDSCs, culture et expansion des souris TDSCs, préparation du milieu de culture de stimulation pour la formation de feuille de cellules, formation de feuille de cellules par culture dans le milieu de stimulation, préparation de la construction de cellules souches de tendon 3D, assemblage du complexe de stimulation mécanique uniaxial-étirement, et évaluation du tissu mécanique stimulé in vitro de tendon-comme. L’ensemble de la procédure prend moins de 3 semaines pour obtenir la construction de cellules 3D, ce qui est beaucoup moins que certaines méthodes existantes22,23. Le protocole actuel s’est avéré être capable d’inciter les TDSC à se différencier en tissu de tendon, et il est plus fiable que le système d’étirement bidimensionnel (2D) couramment utilisé (2D)courant 21. L’efficacité a été démontrée par l’histologie. En bref, le protocole actuel est simple, économique, reproductible et valide.

<table><tbody><tr><td>Acide ascorbique</td><td>Sigma-aldrich</td><td>PHR1008-2G</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Gibco&auml ; de Life Technologies</td><td>1908361 Processeur d’histologie</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>TP 1020</td><td></td></tr><tr><td>Minimal Essential Medium (Alpha-MEM)</td><td>Gibco&auml ; de Life Technologies</td><td>2003802</td><td></td></tr><tr><td>Cellules</td><td></td><td></td> <td>souches dérivées de tendons de sourisIsolé des tendons d’Achille de souris C57BL/6 âgées de 6 à 8 semaines. Puis digéré avec de la collagénase de type I (3 mg/ml ; MilliporeSigma, Burlington, MA, États-Unis) pendant 3 h et passés à travers une crépine de 70 mmcell pour produire des suspensions unicellulaires.</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma-aldrich</td><td>441244</td><td></td></tr><tr><td>Mélange de streptomycine et de pénicilline</td><td>Gibco&auml ; par Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Système de bioréacteur de stimulation mécanique uniaxiale tridimensionnelle</td><td>Centre de recherche translationnelle orthopédique, Faculté de médecine, Université d’Australie-Occidentale</td><td></td><td>Disponible auprès de l’auteur correspondant sur demande. Ou le faire selon notre conception* *Wang T, Lin Z, Day RE, et al. La stimulation mécanique programmable influence l’homéostasie tendineuse dans un système de bioréacteur. Biotechnol Bioeng. 2013; 110(5) :1495&ndash ;1507. doi :10.1002/bit.24809</td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Gibco&auml ; par Life Technologies</td><td>1858331</td><td></td></tr></tbody></table>

application d’un système biréacticien uniaxial de stimulation mécanique tridimensionnelle pour induire la différenciation tenogène des cellules souches dérivées du tendon

Applying a Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System to Induce Tenogenic Differentiation of Tendon-Derived Stem Cells

La tendinopathie est une maladie chronique commune de tendon relative à l’inflammation et à la dégénérescence dans une zone orthopédique. Avec une morbidité élevée, une capacité d’auto-réparation limitée et, surtout, aucun traitement définitif, la tendinopathie influence encore négativement la qualité de vie des patients. Les cellules souches dérivées du tendon (TDSC), en tant que cellules précurseurs primaires des cellules du tendon, jouent un rôle essentiel dans le développement de la tendinopathie, et la restauration fonctionnelle et structurelle après tendinopathie. Ainsi, une méthode qui peut in vitro imiter la différenciation in vivo des TDSCs en cellules de tendon serait utile. Ici, le présent protocole décrit une méthode basée sur un système d’étirement uniaxial tridimensionnel (3D) pour stimuler les TDSC à se différencier en tissus semblables à des tendons. Il y a sept étapes du protocole actuel : isolement des souris TDSCs, culture et expansion des souris TDSCs, préparation du milieu de culture de stimulation pour la formation de feuille de cellules, formation de feuille cellulaire par culture dans le milieu de stimulation, préparation de la construction de cellules souches de tendon 3D, assemblage du complexe de stimulation mécanique uniaxial-étirement, et évaluation du tissu mécanique stimulé in vitro de tendon-comme. L’efficacité a été démontrée par l’histologie. L’ensemble de la procédure prend moins de 3 semaines. Pour favoriser le dépôt extracellulaire de matrice, l’acide ascorbique de 4.4 mg/mL a été employé dans le milieu de culture de stimulation. Une chambre séparée avec un moteur linéaire fournit une charge mécanique précise et est portable et facilement ajusté, qui est appliqué pour le bioréacteur. Le régime de chargement dans le protocole actuel était de 6% souche, 0,25 Hz, 8 h, suivie de 16 h de repos pendant 6 jours. Ce protocole pourrait imiter la différenciation cellulaire dans le tendon, ce qui est utile pour l’étude du processus pathologique de tendinopathie. En outre, le tissu tendon-like est potentiellement utilisé pour favoriser la guérison du tendon dans les blessures du tendon comme une greffe autologue ingénieur. En résumé, le protocole actuel est simple, économique, reproductible et valide.

Avant la stimulation mécanique, les TDSC étaient cultivés à 100% confluent dans un milieu complet et affichaient une morphologie ultrastructurale désorganisée (figure 2A). Après 6 jours de chargement mécanique uniaxial d’étirement, la matrice extracellulaire (ECM) et les alignements cellulaires étaient bien orientés (figure 2B). Les cellules étaient bien peuplées et bien enveloppées dans ecm après chargement mécanique. La morphologie cellulaire a été présentée pour être allongée et était...

Un système biréacteur de stimulation mécanique uniaxial en trois dimensions est un bioréacteur idéal pour la différenciation ténogénique spécifique des cellules souches dérivées du tendon et de la formation de néo-tendons.

Application d’un système biréacticien uniaxial de stimulation mécanique tridimensionnelle pour induire la différenciation tenogène des cellules souches dérivées du tendon

Tendinopathy is a common chronic tendon disease relating to inflammation and degeneration in an orthopaedic area. With high morbidity, limited ...

Différents paramètres de chargement mécanique pourraient induire des cellules SOUCHES dérivées du tendon différenciées en différentes cellules. Nous introduisons le processus détaillé d’application de ce système uniaxial tridimensionnel de bioréacteur de stimulation mécanique pour induire la différenciation tenogenic des cellules STEM tendon-dérivées. Tendinopathy est l’une des blessures sportives communes dans le département orthopédique.La présence de tendinopathie d’Achille est plus fréquente avec jusqu’à 29% pour les coureurs de moyenne et longue distance, tandis que la présence de tendinopathy patella est également élevé chez les athlètes de volley-ball, basket-ball, athlétisme, handball, et le football. Cependant, en raison de la capacité limitée d’auto-guérison du tendon et le manque de traitement efficace, tendinopathy a toujours l’effet défavorable significatif sur la qualité de vie des patients. Les cellules SOUCHES dérivées du tendon, connues sous le nom de TDSC comme les cellules précurseurs importantes des cellules tendons, jouent un rôle important dans le développement de la tendinopathie, ainsi que dans leur restauration fonctionnelle et structurale après tendinopathie.Toutefois, différents des paramètres de chargement mécaniques, tels que le stress de chargement, la fréquence de chargement, le type de chargement et la période de chargement peuvent inciter les TDSC à se différencier en différentes cellules. Ainsi, un régime de chargement mécanique efficace et valide est très important pour la genèse du tendon. Il y a sept étapes du protocole actuel, y compris l’isolement des souris TDSCs, la culture et l’expansion des souris TDSCs, la préparation du milieu de culture de stimulation pour la formation de feuille de cellule, la formation de feuille de cellule par la culture dans le milieu de stimulation, la préparation de la construction de cellules souches de tendon 3D, l’assemblage des cellules uniaxiales étirant le complexe mécanique de stimulation, et l’évaluation du tissu tendinien in vitro stimulé mécanique.Isolement des souris TDSCs. Utilisé chez les souris qui sont des souris âgées de six à huit semaines par dislocation cervicale. Récolter les tendons de rotule et les tendons d’Achille.Digérer le tendon avec la collagène de type 1 de six millilitres pendant trois heures. Recueillir les cellules et la culture dans l’alpha MEM complet contenant 10% de FBS et 1%de streptomycine et le mélange de pénicilline pendant sept jours. identifier les TDSC à l’aide du tri cellulaire activé par fluorescence par cytométrie d’écoulement, l’expression de marqueurs de surface cellulaire, y compris le CD44, le CD90 et le Sca-1.Absence de l’expression de CD34 et CD45. Passer et congeler les cellules. Les cellules de passage seront utilisées pour d’autres étapes.Culture et expansion des souris TDSC. Prenez les cellules souches du tendon des souris réchauffées. Ajouter lentement quatre à cinq millilitres supplémentaires d’alpha MEM complet.Transférer le mélange dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres par une pipette. Garnir de moyen à un total de huit millilitres par une pipette. Placez le tube dans la centrifugeuse un équilibre de puits.Cellules centrifugeuses à 347 g pendant cinq minutes. Sortez un tube de la centrifugeuse. Vérifiez la pastille en bas.Décanter le milieu libre. Suspendre doucement les cellules dans un à deux millilitres de milieu complet. Évitez de faire trop de bulles.Transférer les cellules re-suspendues dans un flacon T75 par une pipette. Utilisez une pipette pour ajouter un milieu alpha MEM complet au flacon pour atteindre un volume total de 10 millilitres avec une concentration finale de 13 000 cellules par centimètre carré. Placez le flacon dans l’incubateur et culturez-le à 37 degrés avec 5% de dioxyde de carbone.Changez le milieu tous les trois jours. Observez et surveillez les cellules au microscope lorsque vous changez le milieu jusqu’à ce que les cellules soient cultivés à 100 % de confluence. Préparation du milieu de culture de stimulation pour la formation de feuilles cellulaires.Verser 15 millilitres de milieu alpha MEM complet dans un tube stérile de 15 millilitres. Ajouter six microlitres d’acide ascorbique dans un milieu de 15 millilitres à la concentration finale de 4,4 microgrammes par millilitre. Mélanger délicatement en inversant de haut en bas.Formation de feuilles cellulaires en culturant dans le milieu de stimulation. Jetez soigneusement le milieu alpha MEM complet non normal. Évitez de toucher les cellules fixées au fond du flacon.Ajouter 10 millilitres de stimulation moyenne lentement. Évitez de causer des perturbations aux cellules entièrement confluentes. Culture des cellules dans le milieu de stimulation pendant neuf jours et changer le milieu tous les trois jours pour générer suffisamment de feuilles cellulaires à 37 degrés avec 5% de dioxyde de carbone.Préparation de la construction de cellules SOUCHES de tendon 3D. Sortez le flacon de l’incubateur. Jeter complètement le milieu de stimulation.Lavez la feuille de cellule monocouche avec PBS en faisant tourbillonnant le flacon. Jetez complètement le PBS. Utilisez une pipette pour ajouter un millilitre, 0,25% trypsine au coin de la fiole.Appuyez sur le coin du flacon pour détacher la feuille de cellule monocouche jusqu’à ce que le coin de la feuille de cellule se lave du fond du flacon. Ajouter immédiatement neuf millilitres complète alpha MEM moyen pour arrêter la réaction de trypsinization. Continuer à tourbillonnant le flacon pour décoller complètement la feuille de cellule monocouche.Verser le total pour fixer la feuille de cellule dans la boîte de Pétri avec moyen. Utilisez une pince stérile pour ramasser un coin de la feuille de cellule et tourner dans le sens des aiguilles d’une montre pendant 15 fois. Prenez une autre extrémité de la feuille cellulaire et tournez dans le sens inverse des aiguilles d’une montre pendant 10 fois pour formuler une construction in vitro en forme de tendon.Assemblage du complexe de stimulation mécanique uniaxial-étirement dans le bioréacteur conçu unique. Connectez les crochets par le connecteur, puis ajustez-les à deux centimètres entre deux crochets. Enroulez doucement les TDSC 3D construire sur le crochet de démonstration pour trois fois sur chaque crochet.Fixez les crochets avec la construction cellulaire sur la chambre du bioréacteur en serrant les vis sur deux extrémités. Remplissez la chambre avec le support alpha MEM complet. Connectez l’accélérateur à la chambre culturelle par câble.Couper le connecteur des crochets par des pinces stériles. Allumez la puissance et le contrôleur de canal pour démarrer une stimulation mécanique. Placez le couvercle sur la chambre, suivez les voyants indicateurs et assurez-vous que le bioréacteur peut fonctionner correctement.Mettez le bioréacteur dans l’incubateur et soumettez la construction de cellules 3D à des étirements mécaniques. Le régime de chargement est de 6%, 0,25 fréquence Hertz, huit heures suivies de 16 heures de repos pendant six jours. Évaluation du tissu tendons-like in vitro stimulé mécaniquement.desserrer les vis par un tournevis et enlever soigneusement l’assemblage. Mettez le tissu tendon-comme dans 4%PFA pour la fixation pendant 15 minutes, placez le tissu fixe tendon-comme dans une cassette de biopsie avec la biopsie des animaux familiers. Processus de déshydratation d’un échantillon.Et enfin, évaluer par hd position histologique. Répétez l’ensemble du protocole et extrayez l’ARN du tissu tendin-like pour évaluer l’expression des marqueurs tenogenic par qPCR. Avant la stimulation mécanique, les CDD se développeront à 100 % de confluence dans le milieu complet et afficheront une morphologie structurale extérieure désorganisée.Après six jours, vous avez ensuite vu l’étirement, la charge mécanique, la matrice extra cellulaire, et les alignements cellulaires étaient bien orientés. Les cellules étaient bien peuplées et bien enveloppées dans l’ECM après chargement mécanique. La morphologie cellulaire a été présentée pour être localisée et était plus semblable aux cellules normales de tendon comparées à celle avec sans étirement.La densité cellulaire dans la construction cellulaire avec chargement était plus élevée que celle sans chargement. Les résultats de qPCR ont prouvé que les questions actuelles ont augmenté l’expression des marqueurs tenogenic, y compris le scleraxis, le Mohawk, la tenomoduline, et le collagène de type 1 comparés à ceux traités par la culture indiquée. En termes de système bioréacteur de stimulation mécanique, la chambre séparée avec le moteur linéaire a été employée dans notre protocole actuel.Parce qu’il peut fournir une charge mécanique précise et il est portable et facile à ajuster par rapport à la façon dont la feuille de cellules 2D traditionnelles et l’étirement biaxial, la construction de cellules 3D est plus similaire à la forme réelle du tendon. Et l’étirement uniaxial est plus semblable aux caractéristiques des forces des cellules tendineuses. Cela fournit une base théorique de l’utilisation du système 3D uniaxial étiré pour stimuler la différenciation des TDSC.Ainsi, la feuille de cellule 2D ont finalement été acheminées dans une construction de cellule 3D et ont subi uniaxial dans le protocole actuel. Selon notre système de bioréacteur, notre régime de chargement est de 6%, 0,25 fréquence Hertz, huit heures suivies de 16 heures de repos pendant six jours. Enfin, l’efficacité du protocole a été démontrée par la morphologie et le niveau d’expression des marqueurs tenogéniques.L’ensemble du processus d’exploitation est simple, mais l’opérateur doit être attentif pour garder l’environnement de TDSC stérilisé en tout temps. Il existe de nombreuses applications de notre protocole. Le processus de stimulation des TDSC pour imiter la différenciation in vivo est utile pour l’étude du processus pathologique de tendinopathie.En outre, ce protocole fournit une méthode reproductible pour la différenciation dirigée des TDSC en tissu tendinage-like. Ainsi, il peut être utilisé simplement et efficacement pour la culture potentielle du tendon d’ingénierie. En résumé, l’application d’un système de bioréacteur de stimulation mécanique uniaxiale 3D est simple, économique, reproductible, et une méthode valide pour induire la différenciation tenogenic des TDSCs.Notre protocole fournit l’ensemble du processus en détail.

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Démonstration de la culture de feuilles cellulaires auto-assemblées et de la génération manuelle d’un organoïde 3D de type tendon/ligament à l’aide de fibroblastes dermiques humains

La stimulation magnétique transcrânienne (TMS) est un outil non-invasif d'avoir un aperçu sur la physiologie et le fonctionnement du système nerveux humain. Ici, nous présentons nos techniques TMS pour étudier l'excitabilité corticale du membre supérieur et de la musculature lombaire.

Utilisant la stimulation magnétique transcrânienne à l&#39;étude du système neuromusculaire de l&#39;homme

La méthode décrite isolement et la caractérisation de l'homme dentaires cellules souches de pulpe (hDPSCs) en utilisant...

Différenciation isolement, caractérisation et comparative de l&#39;homme dentaires cellules souches de pulpe Dérivé de dents permanentes à l&#39;aide de deux méthodes différentes

Nous explorons l'utilisation de la stimulation magnétique transcrânienne répétitive (rTMS) pour améliorer les compétences linguistiques chez les patients ayant subi un AVC chronique et non couramment l'aphasie. Après avoir identifié un site dans la bonne gyrus frontal pour chaque patient qui répond de façon optimale à la stimulation, nous ciblons ce site pendant les dix jours de traitement par SMTr.

Utilisant Stimulation magnétique transcrânienne répétitive pour améliorer la fonction de la langue chez les patients avec un AVC chronique aphasie non fluente

Dans les procédés de culture standards cellules sont retirées de leur environnement physiologique et cultivées sur la surface en plastique d'un plat. Pour étudier le comportement de cellules primaires de moelle osseuse humaine, nous avons créé un système de culture en 3-D, où les cellules sont cultivées dans des conditions récapitulant le microenvironnement du tissu natif.

A Tissue Culture Modèle tridimensionnel pour étudier primaire moelle osseuse humaine et de ses affections malignes

Découvrez l'application d'un bioréacteur uniaxial 3D pour induire la différenciation tenogène des cellules souches dérivées du tendon. Cette méthode reproduit les conditions physiologiques pour favoriser la formation de néo-tendons et traiter la tendinopathie.

Application d’un système biréacticien uniaxial de stimulation mécanique tridimensionnelle pour induire la différenciation tenogène des cellules souches dérivées du tendon (Vidéo) | JoVE Journal

Application d’un système biréacticien uniaxial de stimulation mécanique tridimensionnelle pour induire la différenciation tenogène des cellules souches dérivées du tendon

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