2D-HELS MS Seq : une méthode générale basée sur LC-MS pour le séquençage direct et de novo de mélanges d’ARN avec différentes modifications nucléotidiques
10 juillet 2020
Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour une méthode de séquençage basée sur la LC-MS qui peut être utilisée comme méthode directe pour séquencer l’ARN court (<35 nt par exécution) sans intermédiaire d’ADNc, et comme méthode générale pour séquencer différentes modifications nucléotidiques dans une seule étude avec une précision de base unique.
Ce protocole couvre toutes les étapes essentielles nécessaires à l’utilisation de la nouvelle méthode développée pour séquencer directement l’ARN, que l’échantillon d’ARN soit monobrin, mixte ou modifié. La méthode n’est pas affectée par l’erreur enzymatique ou la complémentarité de base. Il fournit un flux de travail direct et une solution générale qui permet de séquencer simultanément différentes modifications de l’ARN plutôt qu’une modification spécifique à la fois.
Cette technologie peut être développée comme un outil de diagnostic pour déterminer les segments d’ARN caractéristiques afin de les relier à la maladie humaine et un outil précis pour étudier les modifications de l’ARN au niveau épitranscriptomique. La méthode ne repose sur aucune méthode de séquençage précédente. Au lieu de cela, il s’agit d’une approche complètement nouvelle, et nous visons à en faire la méthode de référence pour le séquençage de tout ARN modifié.
Certaines parties de ce protocole contiennent des aspects critiques qui peuvent être transmis plus précisément par démonstration visuelle, tels que l’étiquetage de l’extrémité 3' de l’acquisition de données LC-MS RNA et l’analyse des données par le logiciel MassHunter. Je vais faire une démonstration de cette procédure, configurer le LC-MS et mesurer nos échantillons d’ARN. Pour effectuer une réaction de marquage en une étape, combinez 2 microlitres de biotine AppCp 150 micromolaires, 3 microlitres de tampon de réaction 10x ligase, 1,5 microlitre d’échantillon d’ARN micromolaire, 3 microlitres de DMSO anhydre, 10 unités d’ARN ligase T4 et 19,5 microlitres d’eau traitée au DEPC pour un volume total de 30 microlitres.
Incuber la réaction pendant la nuit à 16 degrés Celsius, puis effectuer la purification de la colonne selon les instructions du manuscrit. Après avoir divisé l’ARN en trois aliquotes et ajouté un volume égal d’acide formique, incubez les réactions à 40 degrés Celsius. Une fois chaque réaction terminée, congelez immédiatement l’échantillon sur de la glace carbonique pour éteindre la dégradation acide.
À l’aide d’un concentrateur centrifuge sous vide, séchez l’échantillon pendant environ 30 minutes. Remettre en suspension les échantillons séchés dans 20 microlitres d’eau traitée au DEPC et les combiner. Conservez les échantillons à 20 degrés Celsius jusqu’à la mesure LC-MS.
Transférez l’échantillon d’ARN dans le flacon d’échantillon LC-MS après avoir préparé les phases mobiles. Chaque injection doit contenir 100 à 400 picomols d’ARN et 20 microlitres. Après avoir acquis les données, utilisez le flux de travail d’extraction de caractéristiques moléculaires pour extraire des informations sur les composés, notamment la masse, le temps de rétention, le volume et le niveau de qualité.
Utilisez le format de données du centroïde dans les paramètres de petites molécules. Définissez la hauteur de crête sur au moins 100, mais inférieure à 1 000, et le score de qualité sur au moins 50. Enfin, exportez les données sous forme de fichier Excel.
La séparation de l’échelle 3' de l’échelle 5' et d’autres fragments indésirables est illustrée ici sur un graphique de temps de rétention de masse 2D. Il est également possible de séquencer des échantillons mixtes contenant deux brins d’ARN de longueurs différentes avec un marquage à la biotine 5' à chaque ARN. Pour différencier l’uridine d’une pseudouridine, l’ARN a été traité avec de la CMC, qui convertit une pseudouridine en un adduit CMC-pseudouridine.
L’adduit a une masse différente dans une uridine et peut être différencié dans le 2D-HELS MS Seq. Le profil HPLC du produit brut de la réaction convertissant la pseudouridine en son adduit CMC a été utilisé pour calculer le pourcentage de conversion, qui était de 42 %Un mélange de cinq brins d’ARN différents a été séquencé par l’approche 2D-HELS MS Seq avec marquage 3'end et normalisé pour une meilleure visualisation de plusieurs séquences d’ARN. Sans la normalisation, les codes alphabétiques des séquences des cinq ARN seraient entassés.
Tout en essayant cette procédure, configurez soigneusement la réaction de marquage pour obtenir un rendement élevé d’échantillons d’ARN marqués. Surveillez également attentivement le temps de dégradation pour créer des échelles de masse fiables et prélevez le maximum d’échantillons séchés avec 20 microlitres d’eau. Une question qui peut être posée après avoir exécuté ce protocole est de savoir comment augmenter la largeur, la longueur et le débit de la méthode de séquençage.
Un meilleur algorithme et un instrument plus avancé avec une résolution et une sensibilité plus élevées peuvent aider. Après le développement de ce protocole, il est devenu possible de séquencer directement une gamme plus large d’échantillons d’ARN contenant à la fois des nucléotides canoniques et modifiés sans aucune erreur liée au séquençage de l’ARN basé sur l’ADC.
Consultez la transcription complète et accédez à des milliers de vidéos scientifiques
Aperçu
Cet article présente une nouvelle méthode de séquençage basée sur la CL-SM pour l'ARN court, qui élimine le besoin d'un intermédiaire d'ADN complémentaire. Le protocole permet le séquençage simultané de diverses modifications de l'ARN avec une précision au niveau d'une seule base.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Séquençage de l'ARN
- Épitranscriptomique
- Biotechnologie
Contexte
- Les méthodes actuelles de séquençage de l'ARN reposent souvent sur des intermédiaires d'ADN complémentaire.
- Les erreurs enzymatiques peuvent affecter la précision du séquençage.
- Le séquençage simultané des modifications de l'ARN est difficile.
- Comprendre les modifications de l'ARN est essentiel pour l'étude des maladies humaines.
Objectif de l'étude
- Présenter une méthode de séquençage direct de l'ARN.
- Permettre l'étude de multiples modifications de l'ARN dans une même analyse.
- Fournir un outil fiable pour la recherche en épitranscriptomique.
Méthodes utilisées
- Technique de séquençage basée sur la LC-MS.
- Séquençage direct d'ARN simples brins, mélangés ou modifiés.
- Élimination de l'étape de synthèse d'ADN complémentaire.
- Procédure conçue pour une haute précision et exactitude.
Résultats principaux
- La méthode séquence avec succès des ARN courts (<35 nt) sans ADNc.
- Une détection simultanée de diverses modifications de l'ARN a été réalisée.
- La technique a démontré une résilience face aux erreurs enzymatiques.
- Des applications potentielles en diagnostic des maladies humaines ont été identifiées.
Conclusions
- Cette nouvelle méthode de séquençage pourrait devenir une norme pour l'analyse des ARN modifiés.
- Elle offre une approche complète pour l'étude des modifications de l'ARN.
- Le protocole a des implications pour les recherches futures en biologie de l'ARN.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Cette méthode de séquençage ARN basée sur la LC-MS permet le séquençage direct et de novo de mélanges d'ARN modifiés sans synthèse d'ADNc, résolvant ainsi un goulot d'étranglement majeur dans la validation des cibles épitranscriptomiques. En fournissant des données de séquençage quantitatives et résolues au niveau des modifications, elle favorise la découverte précoce de biomarqueurs fondés sur l'ARN et la réduction des risques mécanistiques associés aux oligonucléotides thérapeutiques. L'approche renforce la fiabilité prédictive dans l'identification des candidats prometteurs en produisant des résultats spécifiques aux modifications et confirmés en séquence, directement applicables aux flux de travail de criblage et de développement de tests.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en séquençant directement les modifications de l'ARN, telles que la pseudouridine et la 5-méthylcytosine, dans des contextes natifs.
- Valeur opérationnelle : Offre une solution générale pour la détection simultanée des nucléotides canoniques et modifiés, réduisant ainsi le besoin d'analyses spécifiques aux modifications réalisées en série.
- Valeur prédictive : Renforce la confiance dans les cibles grâce à la corrélation directe entre masse et temps de rétention des bases nucléiques modifiées, facilitant une cartographie précise des modifications site-spécifiques.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Génère des données quantitatives de masse et de temps de rétention permettant une discrimination fiable des séquences d'ARN dans des mélanges contenant jusqu'à 12 oligonucléotides distincts.
- Valeur opérationnelle : Fournit des données reproductibles et prêtes à être normalisées, compatibles avec les systèmes standards de LC-MS à haute résolution, facilitant ainsi la standardisation des tests pour des panels d'ARN courts.
- Extensibilité : Permet la préparation de systèmes biologiques validés pour des criblages en aval en produisant des étalons d'ARN vérifiés en séquence et présentant des motifs de modifications définis.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Permet la vérification de séquence d'oligonucléotides d'ARN thérapeutiques modifiés, reliant les modifications identifiées en phase de découverte à l'évaluation des candidats précliniques.
- Dérisquage mécanistique : Permet la détection de décalages de masse induits par les modifications (par exemple, adduit de pseudouridine CMC) afin de distinguer le signal réel des artefacts de dégradation dans des échantillons complexes.
- Avancement ajusté au risque : Fournit une confirmation de séquence sans biais enzymatique, réduisant les faux négatifs lors du criblage des modifications et améliorant la fiabilité des décisions d'aller/arrêt.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre aux flux de travail de découverte précoce en tant qu'outil de séquençage en amont pour l'analyse d'ARN orientée par une hypothèse, contribuant à l'identification de candidats en confirmant la séquence et l'état de modification des cibles d'ARN synthétiques ou endogènes avant le criblage fonctionnel.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses et la clarification des voies en fournissant des preuves directes de la co-occurrence des séquences d'ARN et de leurs modifications dans des mélanges natifs ou synthétiques.
- Écrans de composés : Permet la préparation d'essais grâce à la génération d'échelles masse-temps de rétention servant de références quantitatives pour le profilage des modifications ou de la dégradation de l'ARN induites par des composés.
- Analyse : Génère des données de caractéristiques moléculaires basées sur les centroïdes (masse, temps de rétention, volume, score de qualité) exportables vers Excel, permettant la comparaison entre différentes conditions et l'évaluation statistique de la stabilité des modifications.
- Recherche translationnelle : S'inscrit dans une continuité préclinique en fournissant des étalons d'ARN modifiés dont la séquence est vérifiée, adaptés à l'alignement des biomarqueurs et à la validation fonctionnelle dans des systèmes pertinents pour la maladie.
- Réutilisation en milieu professionnel : Fonctionne comme une capacité réutilisable basée sur la CL-SM permettant le séquençage rapide de variants d'ARN courts (<35 nt), réduisant ainsi la dépendance vis-à-vis du séquençage externalisé et accélérant les cycles internes d'analyse des modifications.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Fournit une confiance prédictive dans la validation des cibles en éliminant les erreurs liées à l'ADNc et en permettant l'observation directe des signatures de masse spécifiques aux modifications.
- Valeur opérationnelle : Garantit la reproductibilité grâce à des étapes standardisées d'étiquetage, de blocage acide et de normalisation, qui minimisent la variabilité entre les analyses pour des mélanges d'ARN complexes.
- Valeur stratégique : Améliore l'efficacité du capital en permettant le séquençage interne des ARN modifiés, réduisant ainsi la dépendance vis-à-vis des prestataires externes et accélérant les cycles d'itération lors de l'optimisation des candidats.
- Impact sur le portefeuille : Soutient une priorisation ajustée au risque en fournissant des données claires sur la séquence et les modifications, réduisant ainsi l'abandon en phase avancée dû à une hétérogénéité ou une mauvaise annotation non détectée de l'ARN.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la manipulation des ARN, l'utilisation de la LC-MS et l'extraction des caractéristiques moléculaires basée sur MassHunter pour une interprétation précise des données.
- Dépend de l'accès à des systèmes LC-MS à haute résolution capables d'acquérir des données sous forme de centroïdes avec des seuils définis de hauteur de pic (100–1000) et de score de qualité (≥50).
- Exige une standardisation inter-équipes des protocoles d'efficacité de marquage, de durée de dégradation et de normalisation afin d'assurer une génération cohérente des échelles de masse entre utilisateurs et plateformes.
- Implique des adaptations à envisager lors d'une extension au-delà des ARN courts (<35 nt) ou à des échantillons biologiques complexes, en attendant des améliorations futures des algorithmes et des instruments.
- Comporte des limites pratiques, notamment les contraintes actuelles de débit et la dépendance à l'optimisation manuelle des réactions de marquage (par exemple, AppCp-biotine, ligase T4, DMSO) afin de maximiser le rendement et la résolution de l'échelle de masse.
