2D-HELS MS Seq : une méthode générale basée sur LC-MS pour le séquençage direct et de novo de mélanges d’ARN avec différentes modifications nucléotidiques
10 juillet 2020
Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour une méthode de séquençage basée sur la LC-MS qui peut être utilisée comme méthode directe pour séquencer l’ARN court (<35 nt par exécution) sans intermédiaire d’ADNc, et comme méthode générale pour séquencer différentes modifications nucléotidiques dans une seule étude avec une précision de base unique.
Ce protocole couvre toutes les étapes essentielles nécessaires à l’utilisation de la nouvelle méthode développée pour séquencer directement l’ARN, que l’échantillon d’ARN soit monobrin, mixte ou modifié. La méthode n’est pas affectée par l’erreur enzymatique ou la complémentarité de base. Il fournit un flux de travail direct et une solution générale qui permet de séquencer simultanément différentes modifications de l’ARN plutôt qu’une modification spécifique à la fois.
Cette technologie peut être développée comme un outil de diagnostic pour déterminer les segments d’ARN caractéristiques afin de les relier à la maladie humaine et un outil précis pour étudier les modifications de l’ARN au niveau épitranscriptomique. La méthode ne repose sur aucune méthode de séquençage précédente. Au lieu de cela, il s’agit d’une approche complètement nouvelle, et nous visons à en faire la méthode de référence pour le séquençage de tout ARN modifié.
Certaines parties de ce protocole contiennent des aspects critiques qui peuvent être transmis plus précisément par démonstration visuelle, tels que l’étiquetage de l’extrémité 3' de l’acquisition de données LC-MS RNA et l’analyse des données par le logiciel MassHunter. Je vais faire une démonstration de cette procédure, configurer le LC-MS et mesurer nos échantillons d’ARN. Pour effectuer une réaction de marquage en une étape, combinez 2 microlitres de biotine AppCp 150 micromolaires, 3 microlitres de tampon de réaction 10x ligase, 1,5 microlitre d’échantillon d’ARN micromolaire, 3 microlitres de DMSO anhydre, 10 unités d’ARN ligase T4 et 19,5 microlitres d’eau traitée au DEPC pour un volume total de 30 microlitres.
Incuber la réaction pendant la nuit à 16 degrés Celsius, puis effectuer la purification de la colonne selon les instructions du manuscrit. Après avoir divisé l’ARN en trois aliquotes et ajouté un volume égal d’acide formique, incubez les réactions à 40 degrés Celsius. Une fois chaque réaction terminée, congelez immédiatement l’échantillon sur de la glace carbonique pour éteindre la dégradation acide.
À l’aide d’un concentrateur centrifuge sous vide, séchez l’échantillon pendant environ 30 minutes. Remettre en suspension les échantillons séchés dans 20 microlitres d’eau traitée au DEPC et les combiner. Conservez les échantillons à 20 degrés Celsius jusqu’à la mesure LC-MS.
Transférez l’échantillon d’ARN dans le flacon d’échantillon LC-MS après avoir préparé les phases mobiles. Chaque injection doit contenir 100 à 400 picomols d’ARN et 20 microlitres. Après avoir acquis les données, utilisez le flux de travail d’extraction de caractéristiques moléculaires pour extraire des informations sur les composés, notamment la masse, le temps de rétention, le volume et le niveau de qualité.
Utilisez le format de données du centroïde dans les paramètres de petites molécules. Définissez la hauteur de crête sur au moins 100, mais inférieure à 1 000, et le score de qualité sur au moins 50. Enfin, exportez les données sous forme de fichier Excel.
La séparation de l’échelle 3' de l’échelle 5' et d’autres fragments indésirables est illustrée ici sur un graphique de temps de rétention de masse 2D. Il est également possible de séquencer des échantillons mixtes contenant deux brins d’ARN de longueurs différentes avec un marquage à la biotine 5' à chaque ARN. Pour différencier l’uridine d’une pseudouridine, l’ARN a été traité avec de la CMC, qui convertit une pseudouridine en un adduit CMC-pseudouridine.
L’adduit a une masse différente dans une uridine et peut être différencié dans le 2D-HELS MS Seq. Le profil HPLC du produit brut de la réaction convertissant la pseudouridine en son adduit CMC a été utilisé pour calculer le pourcentage de conversion, qui était de 42 %Un mélange de cinq brins d’ARN différents a été séquencé par l’approche 2D-HELS MS Seq avec marquage 3'end et normalisé pour une meilleure visualisation de plusieurs séquences d’ARN. Sans la normalisation, les codes alphabétiques des séquences des cinq ARN seraient entassés.
Tout en essayant cette procédure, configurez soigneusement la réaction de marquage pour obtenir un rendement élevé d’échantillons d’ARN marqués. Surveillez également attentivement le temps de dégradation pour créer des échelles de masse fiables et prélevez le maximum d’échantillons séchés avec 20 microlitres d’eau. Une question qui peut être posée après avoir exécuté ce protocole est de savoir comment augmenter la largeur, la longueur et le débit de la méthode de séquençage.
Un meilleur algorithme et un instrument plus avancé avec une résolution et une sensibilité plus élevées peuvent aider. Après le développement de ce protocole, il est devenu possible de séquencer directement une gamme plus large d’échantillons d’ARN contenant à la fois des nucléotides canoniques et modifiés sans aucune erreur liée au séquençage de l’ARN basé sur l’ADC.
Consultez la transcription complète et accédez à des milliers de vidéos scientifiques
Aperçu
Cet article présente une nouvelle méthode de séquençage basée sur la CL-SM pour les petits ARN qui élimine le besoin d'un intermédiaire ADNc. Le protocole permet le séquençage simultané de diverses modifications d'ARN avec une précision à la base unique.
Composants clés de l'étude
Domaine scientifique
- Séquençage d'ARN
- Épitranscriptomique
- Biotechnologie
Contexte
- Les méthodes actuelles de séquençage d'ARN reposent souvent sur des intermédiaires ADNc.
- Les erreurs enzymatiques peuvent affecter la précision du séquençage.
- Le séquençage simultané des modifications d'ARN est difficile.
- Comprendre les modifications d'ARN est crucial pour étudier les maladies humaines.
Objectif de l'étude
- Présenter une méthode de séquençage direct pour l'ARN.
- Permettre l'étude de multiples modifications d'ARN dans une seule analyse.
- Fournir un outil fiable pour la recherche en épitranscriptomique.
Méthodes utilisées
- Technique de séquençage basée sur la CL-SM.
- Séquençage direct d'ARN simple brin, mixte ou modifié.
- Élimination de l'étape de synthèse d'ADNc.
- Flux de travail conçu pour une haute précision et exactitude.
Résultats principaux
- La méthode séquence avec succès les petits ARN (<35 nt) sans ADNc.
- La détection simultanée de diverses modifications d'ARN a été réalisée.
- La technique a démontré une résilience contre les erreurs enzymatiques.
- Des applications potentielles dans le diagnostic des maladies humaines ont été identifiées.
Conclusions
- Cette nouvelle méthode de séquençage pourrait devenir une norme pour l'analyse des ARN modifiés.
- Elle offre une approche complète pour l'étude des modifications d'ARN.
- Le protocole a des implications pour la recherche future en biologie de l'ARN.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
This LC-MS-based RNA sequencing method enables direct, de novo sequencing of modified RNA mixtures without cDNA synthesis, addressing a key bottleneck in epitranscriptomic target validation. By providing quantitative, modification-resolved sequencing data, it supports early discovery of RNA-based biomarkers and mechanistic de-risking of therapeutic oligonucleotides. The approach enhances predictive confidence in lead identification by delivering sequence-confirmed, modification-specific outputs directly applicable to screening and assay development workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by directly sequencing RNA modifications such as pseudouridine and 5-methylcytosine in native contexts.
- Operational Value: Provides a general solution for simultaneous detection of canonical and modified nucleotides, reducing need for sequential modification-specific assays.
- Predictive Value: Supports target confidence through direct mass-retention time correlation of modified nucleobases, facilitating accurate site-specific modification mapping.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative mass and retention time outputs that enable reliable discrimination of RNA sequences in mixtures of up to 12 distinct oligonucleotides.
- Operational Value: Delivers reproducible, normalization-ready data compatible with standard high-resolution LC-MS systems, supporting assay standardization across short RNA panels.
- Scalability: Facilitates preparation of validated biological systems for downstream screening by yielding sequence-verified RNA standards with defined modification patterns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports sequence verification of modified therapeutic RNA oligonucleotides, linking discovery-phase modifications to preclinical candidate evaluation.
- Mechanistic De-risking: Enables detection of modification-induced mass shifts (e.g., CMC-pseudouridine adduct) to distinguish true signal from degradation artifacts in complex samples.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides sequence confirmation without enzymatic bias, reducing false negatives in modification screening and improving go/no-go decision reliability.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows as a front-end sequencing tool for hypothesis-driven RNA analysis, feeding into lead identification by confirming sequence and modification status of synthetic or endogenous RNA targets prior to functional screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by delivering direct evidence of RNA sequence and modification co-occurrence in native or synthetic mixtures.
- Screening: Enables assay readiness through generation of mass-retention time ladders that serve as quantitative references for compound-induced RNA modifications or degradation profiling.
- Analytics: Produces centroid-based molecular feature data (mass, retention time, volume, quality score) exportable to Excel, enabling cross-condition comparison and statistical evaluation of modification stability.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing sequence-verified modified RNA standards suitable for biomarker alignment and functional validation in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable LC-MS-based capability for rapid sequencing of short RNA variants (<35 nt), reducing dependency on outsourced sequencing and accelerating internal modification screening cycles.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Delivers predictive confidence in target validation by eliminating cDNA-mediated errors and enabling direct observation of modification-specific mass signatures.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized labeling, acid quenching, and normalization steps that minimize inter-run variability in complex RNA mixtures.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling internal sequencing of modified RNA, reducing reliance on external vendors and accelerating iteration cycles in lead optimization.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by delivering unambiguous sequence and modification data, decreasing late-stage attrition due to undetected RNA heterogeneity or misannotation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA handling, LC-MS operation, and MassHunter-based molecular feature extraction for accurate data interpretation.
- Depends on access to high-resolution LC-MS systems capable of centroid data acquisition with defined peak height (100–1000) and quality score (≥50) thresholds.
- Necessitates cross-team standardization of labeling efficiency, degradation timing, and normalization protocols to ensure consistent mass ladder generation across users and platforms.
- Involves adaptation considerations when extending beyond short RNA (<35 nt) or to complex biological samples, pending future algorithm and instrument improvements.
- Involves practical limitations including current throughput constraints and dependency on manual optimization of labeling reactions (e.g., AppCp-biotin, T4 ligase, DMSO) to maximize yield and ladder resolution.
