Name: 2D-HELS MS Seq : une méthode générale basée sur LC-MS pour le séquençage direct et de novo de mélanges d’ARN avec différentes modifications nucléotidiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 41 s
Description: Découvrez le séquençage direct de l'ARN par LC-MS sans intermédiaire ADNc, permettant l'analyse simultanée de multiples modifications nucléotidiques avec précision. Cette méthode innovante offre une solution fiable pour la recherche épitranscriptomique et le diagnostic.

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<ol><li>Addepalli, B., Venus, S., Thakur, P., Limbach, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+ribonuclease+activity+of+cusativin+from+Cucumis+sativus+for+mapping+nucleoside+modifications+in+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Novel ribonuclease activity of cusativin from Cucumis sativus for mapping nucleoside modifications in RNA.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (24), 5645-5654 (2017).</li>
<li>Gao, H., Liu, Y., Rumley, M., Yuan, H., Mao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+confirmation+of+chemically+modified+RNAs+using+exonuclease+digestion+and+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Sequence confirmation of chemically modified RNAs using exonuclease digestion and matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 23 (21), 3423-3430 (2009).</li>
<li>McLuckey, S. A., Van Berkel, G. J., Glish, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+mass+spectrometry+of+small%2C+multiply+charged+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+The+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Tandem mass spectrometry of small, multiply charged oligonucleotides.</a> Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 3 (1), 60-70 (1992).</li>
<li>Fountain, K. J., Gilar, M., Gebler, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+native+and+chemically+modified+oligonucleotides+by+tandem+ion-pair+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography%2Felectrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Analysis of native and chemically modified oligonucleotides by tandem ion-pair reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (7), 646-653 (2003).</li>
<li>Taucher, M., Breuker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+modified+RNA+by+top-down+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition+in+English%22%5BJournal%5D)">Characterization of modified RNA by top-down mass spectrometry.</a> Angewandte Chemie International Edition in English. 51 (45), 11289-11292 (2012).</li>
<li>Kellner, S., Burhenne, J., Helm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+RNA+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Detection of RNA modifications.</a> RNA Biology. 7 (2), 237-247 (2010).</li>
<li>Thomas, B., Akoulitchev, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry of RNA.</a> Trends in Biochemical Sciences. 31 (3), 173-181 (2006).</li>
<li>Bjorkbom, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+direct+sequencing+of+noncanonical+RNA+by+two-dimensional+analysis+of+mass+chromatograms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Bidirectional direct sequencing of noncanonical RNA by two-dimensional analysis of mass chromatograms.</a> Journal of the American Chemical Society. 137 (45), 14430-14438 (2015).</li>
<li>Zhang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+LC-MS-based+RNA+sequencing+method+for+direct+analysis+of+multiple-base+modifications+in+RNA+mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A general LC-MS-based RNA sequencing method for direct analysis of multiple-base modifications in RNA mixtures.</a> Nucleic Acids Research. 47 (20), 125(2019).</li>
<li>Zhang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+sequencing+of+tRNA+by+2D-HELS-AA+MS+Seq+reveals+its+different+isoforms+and+dynamic+base+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Direct sequencing of tRNA by 2D-HELS-AA MS Seq reveals its different isoforms and dynamic base modifications.</a> ACS Chemical Biology. 15 (6), 1464-1472 (2020).</li>
<li>Bakin, A., Ofengand, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+newly+located+pseudouridylate+residues+in+Escherichia+coli+23S+ribosomal+RNA+are+all+at+the+peptidyltransferase+center%3A+analysis+by+the+application+of+a+new+sequencing+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Four newly located pseudouridylate residues in Escherichia coli 23S ribosomal RNA are all at the peptidyltransferase center: analysis by the application of a new sequencing technique.</a> Biochemistry. 32 (37), 9754-9762 (1993).</li>
<li>Cantara, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+Modification+Database%2C+RNAMDB%3A+2011+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The RNA Modification Database, RNAMDB: 2011 update.</a> Nucleic Acids Research. 39 (Database issue), D195-D201 (2011).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Kit d’adénylation d’ADN 5'</td><td>New England Biolabs</td><td>E2610S</td><td>Concentration 50uM Spectromètre</td></tr> de <tr><td>masse 6550 Q-TOF</td><td>Agilent Technologies</td><td>5991-2116EN</td><td>Couplé à un système LC 1290 Infinity</td></tr><tr><td>A(5&acute ;)pp(5&aigu ;)Cp-TEG-biotine-3&aigu ;</td><td>ChemGenes</td><td>91718</td><td>HPLC purifié</td></tr><tr><td>ATP & gamma ; S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11162306001</td><td>Sel de lithium</td></tr><tr><td>Bicine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8660</td><td>BioXtra, &ge ; 99 % (titrage)</td></tr><tr><td>Bémimide de biotine</td><td>Vector Laboratories</td><td>SP-1501</td><td>Bras long</td></tr><tr><td>Colonne C18</td><td>Eaux</td><td>186003532</td><td>50 mm & times ; 2,1 mm Xbridge C18 colonne avec une taille de particule de 1,7 &mu ; m</td></tr><tr><td>Concentrateur centrifuge sous vide</td><td>Labconco</td><td>Refrig 115v/60hz 7310022</td><td>Labconco CentriVap</td></tr><tr><td>ChemBioDraw</td><td>PerkinElmer</td><td>ChemDraw Prime</td><td>Générer une structure chimique et des données de propriétés de structures & fragments</td></tr><tr><td>CMC (N-cyclohexyl-N ?-(2-morpholinoéthyl)-carbodiimide métho-p-toluènesulfonate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2491-17-0</td><td>95 % Purifiy</td></tr><tr><td>Cyanine3 maleimide (Cy3)</td><td>Lumiprobe</td><td>11080</td> Eau <td>insoluble dans l’eau</td></tr><tr><td>traitée au DEPC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9906</td> Diisopropylamine (DIPA) <td>autoclavée et certifiée sans nucléaseThermo</td></tr> <tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>108-18-9</td><td>99 % Alfa Aesar</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td>Diméthylsulfoxyde anhydre, 99,9 %</td></tr> <tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td>Anhydre, cristallin, BioReagent, adapté à la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Acide formique</td><td>Merck</td><td>64-18-6</td><td>98-100 %, ACS reag, Ph Eur</td></tr><tr><td>Hexafluoro-2-propanol (HFIP)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>920-66-1</td><td>99 % Acros Organics</td></tr><tr><td>Flacons d’échantillons LC-MS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C4000-11</td><td>Flacons à filetage vissé en plastique</td></tr><tr><td>Bouchons de flacons LC-MS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C5000-54A</td><td>Échantillonneur automatique bouchons filetés de flacons</td></tr><tr><td>Na2CO3 tampon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>88975</td><td>BioUltra, >0,1 M Na2CO3, >0,2 M NaHCO3</td></tr><tr><td>Oligo Clean & Concentrateur</td><td>Zymo Research</td><td>D4060</td><td>Colonne de centrifugation</td></tr><tr><td>OriginLab</td><td>OriginLab</td><td>OriginPro</td><td>Logiciel d’analyse de données et de représentation graphique</td></tr><tr><td>pCp-biotine</td><td>TriLink BioTechnologies</td><td>NU-1706-BIO</td><td>20 ul (1 mM)</td></tr><tr><td>ARN #1--#6</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Oligos d’ARN personnalisés</td><td>19nt-21nt ARN simple brin, utilisés sans autre purification</td></tr><tr><td>Basculement agitateur de plate-forme</td><td>VWR</td><td>Orbital Shaker Standard 1000</td><td>Plage de vitesse 40 à 300 tr/min</td></tr><tr><td>Perles magnétiques de streptavidine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88816</td><td>Liaison env. 55ug biotinylé lapin lgG par mg de billes</td></tr><tr><td>Sulfonated Cyanine3 maleimide</td><td>Lumiprobe</td><td>11380</td> T4 <td>soluble dans l’eau</td></tr><tr><td>ADN ligase 1</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td>400 unités/uL</td></tr><tr><td>T4 polynucléotide kinase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4PNK-RO</td><td>Du phage T4 am N81 pse T1 infecté par Escherichia coli BB</td></tr><tr><td>Tampon Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6455</td><td>Tampon Tris-HCl, pH 10, 10&times ;, Antigen Retriever</td></tr><tr><td>Urée</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81871</td><td>Urée pour la synthèse. N° CAS 57-13-6, numéro CE 200-315-5.</td></tr></tbody></table>

2d-hels ms seq : une méthode générale basée sur lc-ms pour le séquençage direct et de novo de mélanges d’arn avec différentes modifications nucléotidiques

2D-HELS MS Seq: A General LC-MS-Based Method for Direct and de novo Sequencing of RNA Mixtures with Different Nucleotide Modifications

Introduire une étiquette de biotine à l’extrémité 3' de l’ARN pour produire des échelles de masse-tR facilement identifiables. Le flux de travail de l’approche 2D-HELS MS Seq est illustré à la figure 1a. Le marquage hydrophobe à la biotine introduit à l’extrémité 3' de l’ARN (voir section 2) augmente les masses et les tRs des composants de l’échelle marqués 3' par rapport à ceux de leurs homologues non marqués. Ainsi, la courbe de l’échelle 3' est décal...

2D-HELS MS Seq : une méthode générale basée sur LC-MS pour le séquençage direct et de novo de mélanges d’ARN avec différentes modifications nucléotidiques

Mass spectrometry (MS)-based sequencing approaches have been shown to be useful in&#160;direct&#160;sequencing&#160;RNA without the need for a ...

Ce protocole couvre toutes les étapes essentielles nécessaires à l’utilisation de la nouvelle méthode développée pour séquencer directement l’ARN, que l’échantillon d’ARN soit monobrin, mixte ou modifié. La méthode n’est pas affectée par l’erreur enzymatique ou la complémentarité de base. Il fournit un flux de travail direct et une solution générale qui permet de séquencer simultanément différentes modifications de l’ARN plutôt qu’une modification spécifique à la fois.Cette technologie peut être développée comme un outil de diagnostic pour déterminer les segments d’ARN caractéristiques afin de les relier à la maladie humaine et un outil précis pour étudier les modifications de l’ARN au niveau épitranscriptomique. La méthode ne repose sur aucune méthode de séquençage précédente. Au lieu de cela, il s’agit d’une approche complètement nouvelle, et nous visons à en faire la méthode de référence pour le séquençage de tout ARN modifié.Certaines parties de ce protocole contiennent des aspects critiques qui peuvent être transmis plus précisément par démonstration visuelle, tels que l’étiquetage de l’extrémité 3' de l’acquisition de données LC-MS RNA et l’analyse des données par le logiciel MassHunter. Je vais faire une démonstration de cette procédure, configurer le LC-MS et mesurer nos échantillons d’ARN. Pour effectuer une réaction de marquage en une étape, combinez 2 microlitres de biotine AppCp 150 micromolaires, 3 microlitres de tampon de réaction 10x ligase, 1,5 microlitre d’échantillon d’ARN micromolaire, 3 microlitres de DMSO anhydre, 10 unités d’ARN ligase T4 et 19,5 microlitres d’eau traitée au DEPC pour un volume total de 30 microlitres.Incuber la réaction pendant la nuit à 16 degrés Celsius, puis effectuer la purification de la colonne selon les instructions du manuscrit. Après avoir divisé l’ARN en trois aliquotes et ajouté un volume égal d’acide formique, incubez les réactions à 40 degrés Celsius. Une fois chaque réaction terminée, congelez immédiatement l’échantillon sur de la glace carbonique pour éteindre la dégradation acide.À l’aide d’un concentrateur centrifuge sous vide, séchez l’échantillon pendant environ 30 minutes. Remettre en suspension les échantillons séchés dans 20 microlitres d’eau traitée au DEPC et les combiner. Conservez les échantillons à 20 degrés Celsius jusqu’à la mesure LC-MS.Transférez l’échantillon d’ARN dans le flacon d’échantillon LC-MS après avoir préparé les phases mobiles. Chaque injection doit contenir 100 à 400 picomols d’ARN et 20 microlitres. Après avoir acquis les données, utilisez le flux de travail d’extraction de caractéristiques moléculaires pour extraire des informations sur les composés, notamment la masse, le temps de rétention, le volume et le niveau de qualité.Utilisez le format de données du centroïde dans les paramètres de petites molécules. Définissez la hauteur de crête sur au moins 100, mais inférieure à 1 000, et le score de qualité sur au moins 50. Enfin, exportez les données sous forme de fichier Excel.La séparation de l’échelle 3' de l’échelle 5' et d’autres fragments indésirables est illustrée ici sur un graphique de temps de rétention de masse 2D. Il est également possible de séquencer des échantillons mixtes contenant deux brins d’ARN de longueurs différentes avec un marquage à la biotine 5' à chaque ARN. Pour différencier l’uridine d’une pseudouridine, l’ARN a été traité avec de la CMC, qui convertit une pseudouridine en un adduit CMC-pseudouridine.L’adduit a une masse différente dans une uridine et peut être différencié dans le 2D-HELS MS Seq. Le profil HPLC du produit brut de la réaction convertissant la pseudouridine en son adduit CMC a été utilisé pour calculer le pourcentage de conversion, qui était de 42 %Un mélange de cinq brins d’ARN différents a été séquencé par l’approche 2D-HELS MS Seq avec marquage 3'end et normalisé pour une meilleure visualisation de plusieurs séquences d’ARN. Sans la normalisation, les codes alphabétiques des séquences des cinq ARN seraient entassés.Tout en essayant cette procédure, configurez soigneusement la réaction de marquage pour obtenir un rendement élevé d’échantillons d’ARN marqués. Surveillez également attentivement le temps de dégradation pour créer des échelles de masse fiables et prélevez le maximum d’échantillons séchés avec 20 microlitres d’eau. Une question qui peut être posée après avoir exécuté ce protocole est de savoir comment augmenter la largeur, la longueur et le débit de la méthode de séquençage.Un meilleur algorithme et un instrument plus avancé avec une résolution et une sensibilité plus élevées peuvent aider. Après le développement de ce protocole, il est devenu possible de séquencer directement une gamme plus large d’échantillons d’ARN contenant à la fois des nucléotides canoniques et modifiés sans aucune erreur liée au séquençage de l’ARN basé sur l’ADC.

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La ligature très efficace de petites molécules d&#39;ARN pour microARN quantification par séquençage à haut débit

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Extrémité 3' séquençage bibliothèque préparation avec A-seq2

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Criblage de la structure de l’ARN avec le profilage mutationnel du sulfate de diméthyle avec séquençage in vitro et dans les cellules

Le séquençage de l’ARN par quantification absolue (AQRNA-seq) est une technologie développée pour quantifier le paysage de tous les petits ARN dans les mélanges biologiques. Ici, les étapes de préparation de la bibliothèque et de traitement des données d’AQRNA-seq sont démontrées, quantifiant les changements dans le pool d’ARN de transfert (ARNt) chez Mycobacterium bovis BCG pendant la dormance induite par la famine.

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Tirer parti des ressources CyVerse pour<em&gt; De Novo</em&gt; Transcriptomie comparative des organismes sous-gardés (non-modèles)

Découvrez le séquençage direct de l'ARN par LC-MS sans intermédiaire ADNc, permettant l'analyse simultanée de multiples modifications nucléotidiques avec précision. Cette méthode innovante offre une solution fiable pour la recherche épitranscriptomique et le diagnostic.

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