Traçage anatomique et fonctionnel in vivo combiné des terminaux de glutamate de la zone tegmentale ventrale dans l’hippocampe

Le protocole actuel analyse une méthode abordable et simple pour le traçage neuroanatomique et électrophysiologique combiné des circuits neuronaux in vivo. La technique permet de cartographier les terminaisons adjuvantes d’une population de neurones spécifique à un site cible. De même, la carte anatomique de ces terminaux peut être vérifiée par stimulation optogénétique lors de l’enregistrement extracellulaire sur le site cible.

Ce protocole peut être appliqué à l’étude de plusieurs circuits neuronaux associés aux fonctions sensorielles, motrices et cognitives. La réalisation de cette procédure nécessite une certaine connaissance de la chirurgie stéréotaxique des rongeurs et de la manipulation d’électrodes neurales délicates. La connexion du système d’enregistrement pour éviter le bruit dans les enregistrements.

La démonstration visuelle met en évidence les étapes de base de la mise en place d’un système LED abordable pour l’optogénétique in vivo. En outre, il montre comment connecter l’amplificateur avec le pilote LED pour l’enregistrement synchronisé et la stimulation dans une souris anesthésiée. Placez un coussin chauffant sur le cadre stéréotaxique de sorte que le corps de la souris repose dessus, ce qui aidera à maintenir sa température corporelle tout au long de la procédure, puis fixez doucement la tête sur l’appareil stéréotaxique.

Préparez la zone chirurgicale en la nettoyant d’abord avec une solution d’iode, puis avec de l’alcool pour éliminer l’iode. Ensuite, appliquez de la lidocaïne topique pour bloquer la sensation sur le cuir chevelu. Ensuite, à l’aide d’un scalpel, faites une incision médiane s’étendant de la région frontale à la région occipitale.

Pour une injection dans l’aire tegmentale ventrale ou ATV, positionnez une seringue à aiguille à pointe émoussée ultra-fine à moins 3,08 millimètres de coordonnées antérieures postérieures et 0,5 millimètres de coordonnées latérales médiales par rapport au bregma. À l’aide d’un outil de perçage, percez un trou d’un millimètre dans le crâne à la coordonnée marquée. Suivez les instructions du fabricant pour fixer le porte-seringue sur un micromanipulateur et remplissez la seringue avec de l’eau distillée double pour nettoyer et tester le débit de liquide.

Ensuite, versez l’eau pour tester le débit de la seringue. Décongeler des aliquotes de virus adéno-associés ou un cocktail AAV sur de la glace. Remplissez la seringue montée avec 1 000 nanolitres de solution AAV et distribuez 10 nanolitres de la solution pour confirmer l’écoulement du liquide.

Utilisez le micromanipulateur pour abaisser l’aiguille jusqu’au site d’injection et injectez 600 à 800 nanolitres d’AAV dans le VTA, délivrant la solution à 60 nanolitres par minute. Trois semaines après l’injection d’AAV, fixer la tête de l’animal sur un cadre stéréotaxique comme décrit précédemment et effectuer une craniotomie pour exposer la dure-mère. Utilisez un outil de forage pour enlever une partie de l’os pariétal.

Sous un microscope de dissection, utilisez une pointe d’aiguille de calibre 27 pliée pour exciser la dure-mère exposée, en prenant soin de ne pas séparer le revêtement délicat de la peau et les tissus corticaux dans cette zone. Appliquez des gouttes de liquide céphalo-rachidien artificiel sur la zone de craniotomie pour prévenir la sécheresse. Percez un trou dans l’os occipital pour maintenir la vis de terre et connectez un fil de terre en acier inoxydable.

Avant d’abaisser la canule, connectez le câble à fibre optique à une source LED couplée à la fibre. Abaissez la fibre optique de 400 micromètres de diamètre dans le VTA aux coordonnées AP moins 3,08 millimètres et ML 0,5 millimètres. À l’aide d’un micromanipulateur, positionnez les points de contact de l’électrode dans la couche cellulaire pyramidale du CA1.

Pour synchroniser l’impulsion lumineuse avec l’enregistrement neuronal, connectez le pilote de LED et l’importation numérique du contrôleur d’enregistrement à un émetteur logique transistor-transistor avec un répartiteur BNC. Ajustez le bouton pour déterminer l’intensité effective qui peut générer une réponse sans produire d’artefacts photoélectriques et connectez le sol sur le crâne à le sol sur l’adaptateur. Connectez l’étage de tête du préamplificateur au contrôleur d’enregistrement via un câble d’interface périphérique série et vérifiez les voyants LED sur les ports du contrôleur d’enregistrement.

Les LED vertes et jaunes indiquent la tension appropriée sur la carte d’amplification connectée et la LED rouge indique un contrôle logiciel de l’étage supérieur. Après avoir lancé le logiciel, sélectionnez le format de fichier de données et modifiez le nom du fichier. Basculez sur le port de l’étage de tête connecté et cliquez sur désactiver tout sur le port si l’électrode a moins de canaux que l’étage de tête.

Sélectionnez le nombre approprié de chaînes à afficher à l’écran. Pour capturer l’horodatage TTL pour l’enregistrement neuronal synchronisé et l’horodatage déclenché par impulsion lumineuse, cliquez sur les importations numériques et activez le numérique dans zéro. Celle-ci doit correspondre à la connexion BNC sur les importations numériques de l’amplificateur.

Ajustez l’échelle de temps et l’échelle de tension pour un affichage approprié de la forme d’onde et sélectionnez le taux d’échantillonnage, en gardant à l’esprit qu’un taux d’échantillonnage et un nombre de canaux plus élevés augmenteront la taille du fichier. Ensuite, réglez la bande passante de l’amplificateur pour l’enregistrement d’une seule unité. Une fréquence de coupure de 300 à 5 000 Hertz a été utilisée ici.

Pour le son de pointe, cliquez sur la sortie audio analogique et activez le port analogique. Ajustez ensuite le gain et le silencieux pour un son optimal. Pour synchroniser l’enregistrement de l’amplificateur et le train d’impulsions lumineuses, cliquez sur l’onglet d’affichage et activez le marqueur d’affichage.

Basculez sur le canal approprié qui correspond à la connexion BNC et inspectez à nouveau les ports pour vous assurer que les canaux d’enregistrement et le canal d’entrée numérique sont activés pour capturer les pics neuronaux et les horodatages d’impulsions lumineuses. Cliquez sur l’étendue des pointes pour afficher les formes d’onde qui constituent le train de pointes enregistré en continu. Utilisez la souris pour définir le seuil d’affichage des formes d’onde.

Inspectez ensuite le RMS pour déterminer le niveau de bruit dans votre enregistrement. L’expression du virus adéno-associé a été vérifiée par imagerie par immunofluorescence de l’EYFP dans l’aire tegmentale ventrale de souris 21 jours après l’injection. L’imagerie par fluorescence a également été utilisée pour détecter les projections pré-synaptiques de glutamate VTA dans les couches DG, CA3 et CA1 de l’hippocampe.

Une fois l’activité de la tension extracellulaire détectée, l’activité de base a été enregistrée pendant environ 10 minutes avant de déclencher l’impulsion lumineuse à la fréquence souhaitée. Cela a permis de comparer les taux de décharge ou de rafale des neurones putatifs CA1 avant et après la photostimulation du glutamate VTA. Pour étayer ce résultat, la comparaison statistique des taux de décharge du réseau CA1 avant et après la photostimulation a révélé une augmentation significative pour la période post-stimulation.

L’analyse ultérieure du train raster pour détecter les sursauts a également montré une augmentation du taux de rafale pour les neurones pyramidaux présumés CA1 après photostimulation. La réponse à la photosimulation a été identifiée par la fluorescence des expressions du rapporteur AAV aux sites de stimulus. De plus, la description de doit être corrélée avec le site d’enregistrement pour les unités putatives réactives.

Cette méthode peut également être réalisée chez des souris éveillées entreprenant des tâches comportementales. Dans ce cas, des sondes implantables chroniques et une canule à fibre optique doivent être utilisées. Cette technique permettra un traçage robuste des circuits neuronaux grâce à une combinaison de distribution terminale présynaptique dans le site cible et de modulation des terminaisons présynaptiques pour détecter la réponse du site cible in vivo.