Évaluation de la mort cellulaire à l’aide d’un surnageant sans cellules de probiotiques dans des cultures sphéroïdes tridimensionnelles de cellules cancéreuses colorectales
13 juin 2020
Ici, des méthodes sont présentées pour comprendre les effets anticancéreux du surnageant sans cellules de Lactobacillus (LCFS). Les lignées cellulaires du cancer colorectal montrent des décès cellulaires lorsqu’elles sont traitées avec LCFS dans des cultures 3D. Le processus de génération de sphéroïdes peut être optimisé en fonction de l’échafaudage et les méthodes d’analyse présentées sont utiles pour évaluer les voies de signalisation impliquées.
Ce protocole a été optimisé pour faciliter l’étude de l’effet anticancéreux du surnageant acellulaire de Lactobacillus dans plusieurs types de sphéroïdes de cellules cancéreuses du côlon. Cette technique est la première approche qui étudie les effets anticancéreux du LCFS sur les sphéroïdes du cancer du côlon dans des conditions de mimétisme in vivo. Commencez par placer une plaque de gélose MRS stérilisée en autoclave dans une chambre anaérobie à hydrogène à 37 degrés Celsius avec 20 parties par million d’oxygène et inoculez la plaque avec du stock bactérien Lactobacillus fraîchement décongelé.
Ajoutez deux à trois millilitres de bouillon MRS, complété par de la l-cystéine dans le tube et scellez le tube avec le bouchon en caoutchouc butyle et le capuchon du tube. Ensuite, utilisez une boucle pour prélever une seule colonie et placez la colonie dans un tube de culture de 1,5 millilitre contenant 500 microlitres de PBS. Remettez la colonie en suspension de manière homogène dans la solution saline et chargez toute la suspension bactérienne dans une seringue d’un millilitre.
Insérez l’aiguille au centre du couvercle du tube de culture et versez la colonie dans le milieu. Placez la culture dans un incubateur à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone et 200 tours par minute. Après deux jours, mesurez l’OD620 de la culture sur un spectrophotomètre.
Lorsque l’OD620 est égal à deux, sédimentez les bactéries par centrifugation et lavez les bactéries en granulés avec du PBS. Après la deuxième centrifugation, remettre les bactéries en suspension dans quatre millilitres de RPMI 1640, complété par 10 % de sérum de veau fœtal sans antibiotiques et placer les bactéries dans l’incubateur pendant quatre heures à 100 tours par minute. À la fin de l’incubation, granulez les bactéries par centrifugation et filtrez stérilement le surnageant récupéré à travers une passoire de 0,22 micron pour un stockage à moins 80 degrés Celsius.
Pour préparer les lignées cellulaires du cancer colorectal à la formation de sphéroïdes, cultivez les cellules d’intérêt sous forme de monocouches dans des boîtes de Pétri de 100 millimètres dans l’incubateur de culture cellulaire. Lorsque les cellules atteignent une confluence de 70 à 80 %, lavez les cultures deux fois avec quatre millilitres de PBS par lavage avant de détacher les cellules avec un millilitre de 0,25 % de trypsine-EDTA par plat. Après deux minutes, vérifiez la dissociation au microscope optique.
Si les cellules se sont détachées, neutralisez la réaction enzymatique avec cinq millilitres de milieu de croissance. Recueillir les cellules par centrifugation dans un tube conique de 15 millilitres par culture cellulaire et remettre doucement les granulés en suspension avec trois millilitres de milieu de croissance par tube. Ensuite, comptez le nombre de cellules viables en excluant le bleu de trypan.
Après le comptage, diluez les cellules à une à deux fois 10 à la cinquième concentration de cellules par millilitre dans un milieu frais et ajoutez de la méthylcellulose aux cellules jusqu’à une concentration finale de 0,6 %. Transférez les cellules dans un réservoir stérile et utilisez une pipette multicanaux pour distribuer 200 microlitres de cellules dans chaque puits d’une microplaque à fond rond de 96 puits à fixation ultra basse. Ensuite, placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 24 à 36 heures avant de vérifier la formation de sphéroïdes par microscopie optique.
Pour le traitement LCFS, diluez en série la solution mère LCFS préparée et décongelée dans un milieu de croissance frais à des concentrations de 25, 12,5 et 6 % et utilisez une pipette de 200 microlitres pour prélever soigneusement autant de surnageant que possible de chaque puits des cultures de lignées cellulaires de cancer colorectal en plaques. Ensuite, ajoutez doucement 200 microlitres de milieu de croissance complété par LCFS en trois exemplaires à chaque ensemble de cellules cancéreuses et remettez la plaque dans l’incubateur pendant 24 à 48 heures supplémentaires. Une concentration de méthylcellulose de 0,6 % transforme les cellules de la lignée cellulaire cancéreuse testée en sphéroïdes compacts, ce qui indique que les sphéroïdes peuvent être générés à partir de plusieurs types de cancer colorectal à l’aide de ce protocole.
Les sphéroïdes cultivés avec 25 % de LCFS présentent des surfaces perturbées et une viabilité cellulaire diminuée de manière dose-dépendante. En effet, les cellules co-cultivées LCFS présentent des niveaux plus élevés d’expression de l’iodure de propidium par rapport aux cellules témoins viables. L’analyse PCR par transcriptase inverse, le Western blot et l’analyse cytométrique en flux de l’annexine V/7-AAD peuvent également être effectués pour évaluer les effets du LCFS sur l’apoptose des cellules cancéreuses.
Assurez-vous de manipuler les sphéroïdes avec précaution lors du retrait du milieu de croissance, car les sphéroïdes peuvent facilement se casser, ce qui rend impossible l’observation de l’effet du traitement LCFS. À la suite de cette procédure, des tests de viabilité cellulaire, une PCR quantitative en temps réel, un western blot et une analyse FACS peuvent être effectués pour caractériser plus en détail l’effet anticancéreux du LCFS.
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Aperçu
Cet article présente un protocole permettant d'étudier les effets anti-cancéreux du surnageant cellulaire sans cellules de Lactobacillus (LCFS) sur des sphéroïdes de cancer du côlon. L'étude optimise la génération de sphéroïdes et évalue les voies de signalisation impliquées dans la mort cellulaire.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Recherche sur le cancer
Contexte
- Le lactobacille est connu pour ses bienfaits potentiels sur la santé.
- Les surnageants acellulaires peuvent contenir des composés bioactifs.
- Le cancer colorectal demeure un défi médical important.
- Les cultures cellulaires en 3D imitent mieux les conditions in vivo.
Objectif de l'étude
- Étudier les effets anti-cancéreux des LCFS sur les sphéroïdes de cancer du côlon.
- Optimiser les techniques de génération des sphéroïdes.
- Analyser les voies de signalisation impliquées dans les effets observés.
Méthodes utilisées
- Préparation de plaques d'agar MRS dans une enceinte anaérobie.
- Ensemencement des plaques avec une souche bactérienne de Lactobacillus.
- Culture des bactéries dans un bouillon MRS enrichi en l-cystéine.
- Récupération et resuspension des colonies bactériennes en vue d'un traitement.
Résultats principaux
- Les lignées cellulaires de cancer colorectal ont présenté une mort cellulaire lorsqu'elles ont été traitées avec le LCFS.
- Les méthodes optimisées de génération de sphéroïdes ont amélioré les résultats expérimentaux.
- Les voies de signalisation impliquées dans la mort cellulaire ont été efficacement analysées.
- L'étude propose une approche novatrice pour la recherche sur le traitement du cancer.
Conclusions
- Le LCFS montre des signes prometteurs en tant qu'agent anticancéreux potentiel.
- Les techniques de culture en 3D sont essentielles pour une modélisation précise.
- Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour comprendre pleinement les mécanismes en jeu.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Ce protocole permet aux équipes de recherche et développement en biopharmacie d'évaluer l'activité anti-cancéreuse de surnageants dérivés de probiotiques dans des modèles tridimensionnels de cancer colorectal physiologiquement pertinents. En utilisant le surnageant cellulaire libre de Lactobacillus fermentum (LCFS) dans des cultures de sphéroïdes stables, cette méthode soutient la caractérisation mécanistique et la réduction des risques associés aux candidats produits naturels, tout en améliorant la fiabilité prédictive des efforts de validation ciblée. L'approche établit un lien entre le criblage en phase de découverte et la pertinence translationnelle en modélisant les interactions du microenvironnement intestinal qui influencent la viabilité des cellules cancéreuses.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet d'interroger des hypothèses thérapeutiques concernant les métabolites microbiens et leur impact sur les voies de mort cellulaire dans le cancer colorectal.
- Valeur opérationnelle : Permet la validation fonctionnelle de cibles grâce à des mesures de viabilité dépendantes de la dose dans des modèles de sphéroïdes en 3D.
- Valeur prédictive : Facilite le tri des projets en associant l'apoptose induite par LCFS à des marqueurs moléculaires mesurables par qRT-PCR, immunoblotting et cytométrie en flux.
Élaboration de tests et de criblages
- Préparation du test : Prépare des systèmes biologiques validés pour le criblage de composés en aval en utilisant une formation reproductible de sphéroïdes dans des plaques à adhérence ultra-faible.
- Résultats quantitatifs : Génère des données de réponse dose-dépendante (25 %, 12,5 %, 6 % de SFCL) permettant l'estimation de la CI50 et la modélisation des relations structure-activité.
- Extensibilité : Utilise un format 96-puits compatible avec la manipulation automatisée des liquides et le criblage de viabilité à haut débit.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour la maladie : Modélise la physiopathologie du cancer colorectal à l’aide de sphéroïdes dérivés de patients ou de lignées cellulaires établies, reflétant l’architecture tumorale in vivo.
- Continuité translationnelle : Relie les découvertes à la validation préclinique en maintenant des conditions de culture 3D constantes tout au long des étapes des tests.
- Décisions adaptées au risque : Facilite les critères de poursuite ou d’arrêt basés sur l’induction de l’apoptose et les seuils de viabilité observés dans les co-cultures de sphéroïdes.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre aux flux de travail de découverte précoce après l'identification de la cible et avant l'optimisation du composé candidat, en fournissant un système pertinent pour la maladie afin d'évaluer les surnageants bioactifs provenant de sources microbiennes.
- Biologie de la découverte : Permet de tester des hypothèses sur les mécanismes microbiens anti-cancéreux et de clarifier les voies impliquées à l’aide de modèles tridimensionnels offrant une meilleure prédiction des réponses in vivo.
- Criblage : Assure la standardisation et la reproductibilité des tests grâce à des protocoles normalisés de formation des sphéroïdes et de traitement par LCFS.
- Analyse : Permet des mesures quantitatives de variables dépendantes (viabilité, marqueurs d’apoptose) qui soutiennent la comparaison statistique entre différentes conditions de traitement et lignées cellulaires.
- Recherche translationnelle : Garantit une continuité entre le criblage basé sur les sphéroïdes et la validation préclinique en préservant la fidélité des cultures tridimensionnelles.
- Réutilisation à grande échelle : Met en place une plateforme réutilisable pour le criblage de surnageants probiotiques, d’extraits d’aliments fermentés ou de thérapeutiques dérivés du microbiome sur divers types de cancer.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant les faux positifs issus des modèles en 2D et en capturant les effets dépendants du microenvironnement.
- Valeur opérationnelle : Standardise les protocoles de génération et de traitement des sphéroïdes, améliorant ainsi la reproductibilité entre différents sites et réduisant la variabilité des tests.
- Valeur stratégique : Améliore l'efficacité du capital en permettant une réduction précoce des risques associés aux interventions ciblant le microbiome, avant des études in vivo coûteuses.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des candidats issus de produits naturels, fondée sur l'induction de l'apoptose et la réponse dose-dépendante dans des modèles cliniquement pertinents.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture bactérienne anaérobie, en manipulation de sphéroïdes tridimensionnels et en techniques d'essai de l'apoptose (qPCR, WB, FACS).
- Dépend d'instruments tels que des enceintes anaérobies, des incubateurs agitateurs, des spectrophotomètres et des cytomètres en flux.
- Implique une standardisation croisée entre équipes de microbiologie et de biologie du cancer pour une préparation reproductible des LCFS et un contrôle qualité des sphéroïdes.
- Suppose des adaptations lors de l'extension à d'autres souches bactériennes ou types de cancer autres que les modèles colorectaux.
- Est limité par la fragilité des sphéroïdes lors du changement de milieu, nécessitant une manipulation délicate afin de préserver leur intégrité structurelle et garantir des mesures précises.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:34
Bacterial Cell Culture and Lactobacillus Cell-Free Supernatant (LCFS) Preparation
2:18
Colorectal Cancer Cell Line Preparation
3:12
Spheroid Formation
3:49
3D colorectal Cancer Cell LCFS Treatment
4:26
Results: Representative Effects of LCFS Co-Culture on Spheroid Formation and Viability
5:22
Conclusion
