Name: Mesure continue du bruit biologique chez Escherichia Coli à l’aide d’une microscopie en accéléré (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Découvrez une méthode de microscopie en accéléré pour mesurer en continu le bruit biologique dans les circuits génétiques synthétiques d'Escherichia coli. Cette technique évalue la variabilité du signal et le rapport signal/bruit.

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Nous remercions M. Gil Gelbert (Faculté de génie électrique, Technion) d’avoir aidé avec le code MATLAB. Nous remercions le Dr Ximing Li (Faculté de génie biomédical, Technion) d’avoir aidé à prouver cet article. Cette recherche a été partiellement soutenue par la Fondation de la famille Neubauer et le ministère israélien des Sciences, subvention 2027345.

1. Préparation des médias et de la culture
<ol><li>Préparer une solution de stock de 1 000 x carbenicilline (50 mg/mL) ou antibiotique pertinent.<ol>
<li>. Peser 0,5 g de carbenicilline. Ajouter 10 mL de H2O stérile. Dissoudre complètement.</li>
		<li>Stériliser le stock de carbenicilline à l’intermédiaire d’un filtre à seringues de 0,22 μm. Aliquot la solution antibiotique et stocker à -20 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour préparer des assiettes de bouillon de lysogène (LB), mélanger 5 g de tryptone, 5 g de NaCl, 2,5 g d’extrait de levure et 7,5 g d’agar Bacto avec 0,5 L de H2O. Autoclave stérile la solution à 121 °C pendant 20 min.<ol>
<li>Plonger partiellement le mélange de gel fondu dans un bain d’eau de 50 °C. Ajouter 1 000 μL de carbenicilline (50 mg/mL).</li>
		<li>Préparez des boîtes de Pétri dans un environnement stérile. Laisser les assiettes à régler avant de les stocker au réfrigérateur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour les supports minimaux M9, préparez des solutions de stock distinctes des éléments suivants : sels 5x M9 (56,4 g/L), 2 M de glucose et 2 % d’acides casamino sans biotine. Autoclave les solutions à 121 °C pendant 20 min.</li>
	<li>Pour préparer 5 assiettes de Petri, mélanger 1125 mg d’agar à faible fusion et 400 mg d’agar avec 89,2 mL de média minimal (1x M9). Ajouter 10 mL de 2% d’acides casaminos (2% [vol/vol]) dans un flacon Erlenmeyer de 250 mL. REMARQUE : Assurez-vous de verser les supports sur les lèvres intérieures du flacon.</li>
	<li>Micro-ondes de la solution en rafales courtes de 3 à 4 secondes. Répétez jusqu’à ce que la solution soit claire. REMARQUE : Assurez-vous de ne pas atteindre le point d’ébullition.</li>
	<li>Placer la fiole Erlenmeyer de 250 mL dans un bain d’eau chaude (60 °C) pour mélanger davantage par diffusion, et laisser refroidir jusqu’à ce que sa température tombe à environ 45-50 °C.</li>
	<li>Allumez la flamme sur le banc de coulée de plaques.</li>
	<li>Ajoutez rapidement toutes les solutions dans l’ordre suivant : 800 μL de 50% de glycérol (0,4% [vol/vol]) 100 μL de thiamine (B1) 1100 μL de glucose (2M) 100 μL de carbenicilline (50 mg/mL).</li>
	<li>Faites tourbillonner la fiole Erlenmeyer pour assurer une distribution uniforme de tous les ingrédients dans l’ensemble de l’agar.</li>
	<li>Ouvrez une assiette à la fois à côté de la flamme et commencez à couler.<ol>
<li>Laisser les assiettes sur le banc pendant quelques minutes jusqu’à la solidification initiale.</li>
		<li>Retournez les plaques à l’envers pour empêcher la condensation de l’eau de s’insruger sur le gel.</li>
		<li>Laisser les assiettes se solidifier à température ambiante pendant environ 2 h.</li>
		<li>Une fois que les plaques se sont solidifiées et séchées, elles peuvent être conservées à 4 °C pendant environ 3 mois.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Construction de souches bactériennes et de plasmides
NOTE: Le circuit génétique contient une partie; une protéine fluorescente verte (GFP) entraînée par un promoteur PtetO résultant en une expression constitutive. Tous les plasmides de ce travail ont été construits en utilisant des techniques de clonage moléculaire de base et ont été transformés en Escherichia coli 10β, en utilisant un protocole standard de chocthermique 24. La construction finale a été transformée en souche de type sauvage Escherichia coli MG1655 pour analyse.
<ol><li>Transformez le plasmide désiré en cellules Escherichia coli MG1655 avec le protocole standard de choc thermique24.</li>
	<li>Faire pousser les cellules transformées sur une plaque d’agar LB pendant la nuit à 37 °C. REMARQUE : Il est possible de garder les boîtes de Petri de l’étape 2.2 jusqu’à 3 jours pour l’utilisation de microscopie.</li>
	<li>Inoculer une seule colonie en 5 mL de bouillon LB complété par les antibiotiques pertinents dans un tube de verre.</li>
	<li>Faire pousser les cellules à 37 °C avec une vitesse de secousse de 250 rpm dans l’incubateur pendant 2 h jusqu’à ce que le liquide soit nuageux.</li>
	<li>Préparez 1 mL de solution de dilution comme suit : 892 μL de supports minimants (1x M9) 8 μL de 50% de glycérol (0,4% [vol/vol]) 100 μL de 2% d’acides casaminos (0,2% [wt/vol]) 1 μL de thiamine (B1) 11 μL de glucose (2 M) 1 μL d’antibiotiques pertinents<ol>
<li>Mélanger et faire tourner vers le bas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Diluer la culture cellulaire (1:30) de l’étape 2.4 dans un tube de 2 mL en ajoutant 30 μL de croissance d’Escherichia coli à 1000 μL de solution de dilution (étape 2.5).</li>
	<li>Incuber le tube pendant 1 h en secouant (250 rpm) à 37 °C.</li>
	<li>Faire pousser 40 μL - 60 μL sur les plaques M9 préparées à l’étape 1.10. Incuber la plaque à 37 °C pendant la nuit. REMARQUE : La densité optique (OD600nm)pour le placage devrait être d’environ 0,1.</li>
	<li>Placez jusqu’à trois plaques de fond en verre de 35 mm sur le banc. REMARQUE : Assurez-vous que le verre de la plaque a la bonne épaisseur pour les lentilles de microscope utilisées.</li>
	<li>Préparer la culture pour l’ensemencement sur des plaques de gel, répéter les étapes 2,3 à 2,6 pour les colonies à partir de plaques préparées à l’étape 2.9 mesures au microscope.</li>
	<li>Préparez la solution suivante pour faire trois plaques de microscope.<ol>
<li>Préchauffer le bain d’eau à 60 °C.</li>
		<li>Mélanger 112,5 mg d’agar à faible fusion et 40 mg d’agar avec 8,92 mL de médias minimaux (1x M9) et ajouter 1 mL d’acides casaminos à 2 % (0,2 % [vol/vol]) dans une fiole Erlenmeyer de 25 mL. REMARQUE : Assurez-vous de verser les supports sur les lèvres intérieures du flacon.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Micro-ondes de la solution en rafales courtes de 2 à 3 secondes. Répétez jusqu’à ce que la solution soit claire. REMARQUE : Assurez-vous de ne pas atteindre le point d’ébullition.</li>
	<li>Placer la fiole Erlenmeyer de 25 mL dans un bain d’eau chaude (60 °C) pour le mélanger davantage par diffusion, et laisser refroidir sur le banc jusqu’à ce que sa température tombe à environ 45-50 °C.</li>
</ol>3. Préparation de coussinets d’agarose
<ol><li>Banc propre avec 70% d’éthanol. Stretch tape sur le banc nettoyé. Assurez-vous que le ruban est lisse et nivelé.</li>
	<li>Préparez deux coverslips : l’un sur bande et l’autre à proximité. Préparer une couverture.</li>
	<li>Retirer le flacon (préparé à l’étape 2.14) du bain d’eau, essuyer l’extérieur du flacon propre et laisser refroidir jusqu’à ce que sa température tombe à environ 45-50 °C.</li>
	<li>Pour faire la solution gel, mélanger rapidement toutes les solutions dans l’ordre suivant : 80 μL de 50% de glycérol (0,4% [vol/vol]) 1 mL de 2% d’acides casaminos (0,2% [wt/vol]) 10 μL de thiamine (B1) 110 μL de glucose (2 M) 10 μL d’antibiotiques pertinents.</li>
	<li>Verser 1,5 mL de gel sur le coverslip et le couvrir de la deuxième pièce faisant un « sandwich ».</li>
	<li>Remettre l’Erlenmeyer au bain d’eau chaude. Couvrir le sandwich avec le couvercle et régler la minuterie pendant 20 minutes.</li>
	<li>Dans le même temps, incuber le tube de l’étape 2.11 pendant 1 h à 37 °C avec secousses (250 rpm)</li>
	<li>Après 20 minutes, retourner le sandwich (étape 3.5), le couvrir et laisser reposer pendant 1 h. REMARQUE : Pour de meilleurs résultats, laissez reposer le « sandwich » à 4 °C pendant toute la durée de l’étape 3.8.</li>
	<li>Ensemencer la culture d’Escherichia coli à partir de l’étape 3.7 en pipetant l’échantillon sur le plat de 35 mm. REMARQUE : Le pipetting 6 μL des cellules comme petites gouttes séparées donne les meilleurs résultats.</li>
	<li>Laisser sécher les gouttes, pendant au moins 15 minutes et jusqu’à 30 minutes.</li>
	<li>Exposez le gel solidifié du sandwich de l’étape 3.8 en glissant le coverslip loin.</li>
	<li>Couper le sandwich en petits coussinets individuels avec un poinçon ou une pointe de biopsie.</li>
	<li>Penchez-le doucement sur l’échantillon (étape 3.9). Laisser le plat pendant 20 minutes sur le banc.</li>
</ol>4. Préparation de l’échantillon pour l’imagerie par microscopie
<ol><li>Retirer le flacon du bain d’eau de l’étape 3.6. Essuyer l’extérieur du flacon propre et laisser refroidir à température ambiante (25 °C). REMARQUE : Retirez le flacon à l’étape 4.1 environ 3 minutes avant la fin de la minuterie.</li>
	<li>Verser 3 mL de gel constamment au périmètre de la plaque dans un mouvement circulaire. Laisser solidifier pendant quelques minutes.</li>
	<li>Sceller les plaques avec du ruban adhésif et percer plusieurs trous avec une aiguille de 25 G. Retourner tous les plats pour éviter que la condensation de l’eau ne coule sur le gel.</li>
	<li>Incuber tous les plats à 4 °C pendant 30 min pour permettre une solidification complète tout en empêchant la mitose cellulaire. REMARQUE : Laissez les échantillons à 4 °C pour les mesures successives, pas plus d’une journée.</li>
	<li>Démarrez le microscope par instructions du fabricant.</li>
	<li>Trouvez la mise au point initiale à l’aide de l’objectif d’amplification le plus bas et engagez le système de mise au point automatique (AFS).</li>
	<li>Utilisez de l’huile si nécessaire, noyez la lentille avec de l’huile et étalez-la soigneusement en déplaçant la plaque avec un contrôleur de plate-forme (pas manuellement) et AFS peut être engagé à nouveau.</li>
	<li>Utilisez la section transversale relative dans la direction Z, suite à la suggestion par défaut pour les sections transversales z step. REMARQUE : Nous avons pris des images de champ lumineux toutes les 5 minutes et des images fluorescentes toutes les 20 minutes. Parfois, la mise au point doit être ajustée pendant les 30 premières minutes. Préchauffer la boîte d’incubateur de microscope et l’huile, tout en réfrigérant l’échantillon tend à aider à réduire la perte initiale de concentration.</li>
</ol>5. Analyse des données
REMARQUE : Afin de traiter les données de microscopie, nous avons conçu un logiciel informatique dans MATLAB. Ce logiciel facilite l’identification des limites cellulaires à partir d’images et de segments de tiff de champ lumineux et trie les cellules par zone. La sortie de cette analyse d’image peut être utilisée comme masque sur des images fluorescentes de tiff pour dériver des niveaux d’intensité cellulaire et annuler des artefacts dans le domaine fluorescent tel que le halo cellulaire dû aux limites de résolution de microscope. Le logiciel développé a été inspiréd’œuvres similaires 7,25,26,27,28,29,30 et fournit une solution élégante adaptée pour le laboratoire.
<ol><li>Tout d’abord, définissez les paramètres suivants dans main_code.m.<ol>
<li>Définissez le dossier des images d’acquisition.</li>
		<li>Définissez la période de temps d’image - étape de temps de canal de champ lumineux en minutes.</li>
		<li>Définir la fréquence GFP - taux d’acquisition d’images GFP.</li>
		<li>Définir la résolution du microscope (c.-à-d. combien de pixels équivaut à 1 μm).</li>
		<li>Décrivez histogramme bin range - cell area range. REMARQUE : Le processus de classification des données en fonction de la zone cellulaire est similaire aux principes de l’analyse des données de cytométrie du flux. Des barrières sont placées autour des populations de cellules avec des caractéristiques communes, généralement dispersées vers l’avant dispersées et dispersées latéralement, pour isoler et quantifier ces populations d’intérêt. La microscopie permet d’examiner, d’étudier et de quantifier plusieurs groupes cellulaires.</li>
		<li>Définir le noyau de convolution (3,3) - ce paramètre détecte les limites cellulaires par seuil global (count_cells.m). REMARQUE : Cette configuration n’est nécessaire que lors de la modification du laboratoire ou du microscope. Le logiciel nécessite que le canal de champ lumineux d’entrée soit étiqueté avec index c1, canal de fluorescence étiqueté comme c2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Exécutez main_code.m, qui exécutera tous les autres scripts automatiquement( count_cells.m, cell_growth_rate.m).<ol>
<li>Programme segmente automatiquement les images de champ lumineux (voir figure supplémentaire 2-4).</li>
		<li>Combinez l’image de segmentation avec l’image fluorescente (GFP) pour extraire le niveau d’intensité par cellule.</li>
		<li>Calculer le graphique de la quantité de cellules par temps et s’adapter en fonction de la croissance exponentielle.</li>
		<li>Calculer l’écart moyen et type (MT) pour chaque plage de zone cellulaire.</li>
		<li>Calculer le rapport signal/bruit (SNR) pour chaque plage de zone cellulaire.</li>
		<li>Tracer et adapter la distribution de la quantité de cellules par intensité.</li>
		<li>Calculez le coefficient de variance (CV) et comparez aux données de l’analyseur de flux. REMARQUE : Le logiciel donnera en tant que sortie les images de segmentation finales pour ajuster conv_kernel dans un nouveau dossier " yourfolder/Segmenté « . Le logiciel donnera comme sortie les graphiques dans un nouveau dossier « yourfolder/Graphs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Afin de comparer entre les expériences, utilisez compare_experiments.m.<ol>
<li>Définissez les répertoires pour les graphiques enregistrés et l’adresse du répertoire \CompareResult.</li>
		<li>Exécutez le fichier.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans le cadre de ces travaux, nous avons mis au point un protocole qui permet de retracer par ordinateur les cellules vivantes d’Escherichia coli, en suivant les niveaux de division et de fluo sur une période de plusieurs heures. Ce protocole nous permet de quantifier la dynamique stochastique des circuits génétiques d’Escherichia coli en mesurant le CV et le SNR en temps réel. Dans ce protocole, nous avons comparé les comportements stochastiques de deux circuits différents comme le montre la fi...

La biologie synthétique est un domaine multidisciplinaire qui a émergé au cours de la dernière décennie et vise à traduire les principes de conception d’ingénierie en conception biologique rationnelle1,2,3, dans un effort pour atteindre l’intégration multi-signaux et le traitement dans les cellules vivantes pour comprendre la science fondamentale4,5, diagnostic, thérapeutique et biotechnologique applications6,7,8,9,10. Notre capacité à quantifier la réponse intrant-sortie des circuits génétiques synthétiques a été révolutionné par les progrès récents de la technologie unicell cellules, y compris l’analyseur de flux et l’imagerie cellulaire vivante à l’aide de la microscopie automatisée time-lapse11. Un analyseur de flux est souvent utilisé pour mesurer la réponse de ces circuits àl’état stable 1,12, et la microscopie inversée est utilisée pour mesurer la réponse dynamique des circuits génétiques synthétiques au niveau d’une seule cellule3. Par exemple, l’un des premiers travaux en biologie synthétique a impliqué la construction de réseaux d’oscillateurs génétiques dans les cellules vivantes à l’aide de boucles de rétroaction négatives avecun retard de 3. Plus tard, les circuits oscillateurs génétiques ont été appliqués pour comprendre le contrôle métabolique dans l’environnement dynamique des cellules vivantes4. La microscopie automatisée en accéléré est une méthode pour caractériser ces circuits. Nous émettons l’hypothèse que les cellules hôtes, Escherichia coli,se synchronisent lors de la formation de micro-colonies, permettant la mesure du signal et le calcul du bruit sans suivre les relations mère-fille exactes.
Le bruit est un aspect fondamental et inhérent des systèmes biologiques qui proviennent souvent de sources multiples. Prenons, par exemple, les réactions biochimiques impliquant des signaux provenant du transport de porteurs aléatoires discrets tels que la diffusion des protéines13. Ces signaux se propagent avec des fluctuations aléatoires14. D’autres sources de bruit sont la disponibilité des ressources, la division cellulaire et les variations des conditions environnementales telles que la température, l’humidité et la pression. Les signaux biologiques qui se propagent dans les circuits génétiques synthétiques ont souvent un rapport signal/bruit très faible (SNR), ce qui perturbe les performances de ces circuits. Par conséquent, la conception des circuits génétiques demeure l’un des aspects les plus difficiles du géniegénétique 15. Par exemple, contrairement à la plupart des approches qui ne calculent que l’expression moyenne des gènes (mesurée sur l’ensemble de la population cellulaire), la variance du signal mesuré est prise en compte afin de concevoir un comportement prévisible par le biais de réseaux génétiquessynthétiques 12. En tant que tel, les niveaux de variabilité ou de bruit dans l’expression des protéines jouent un rôle dominant dans la conception et la performance des circuitsgénétiques analogiques et numériques 1,16,17.
De nombreuses approches ont été développées pour quantifier la variabilité cellule à cellule, y compris chez Escherichia coli3,7,18. Ces méthodes sont souvent utilisées pour étudier l’activation des gènes et les voies métaboliques, mais avec moins d’accent sur l’étude de la dynamique du bruit stochastique, comme la mesure et le démêlage de sources sonores spécifiques, en particulier pour les circuits génétiques dans les cellules vivantes où il s’agit d’un défifondamental 19,20,21. Plusieurs facteurs, hérités du circuit lui-même (intrinsèques) et dérivés des cellules hôtes (extrinsèques), peuvent perturber la performance continue des circuits génétiques. Dans cet article, nous avons développé un protocole qui vise à quantifier le bruit total dans les cellules d’Escherichia coli, y compris les sources de bruit intrinsèques et extrinsèques6,22. En quantifiant le bruit total, puis en évaluant le SNR23, la conception des circuits génétiques peut être améliorée. Cette méthode peut être modifiée pour mesurer séparément des sources sonores indépendantes, en surveillant plusieurs protéines fluorescentes6,20. Pour le protocole décrit ici, nous maintenez les conditions environnementales bien contrôlées et mesurons continuellement l’activité des cellules sans l’influence de facteurs externes. Nous mesurons le signal des protéines fluorescentes dans les cellules simples au fil du temps et les entions simultanément sous un substrat agarose. Les images qui en résultent sont analysées à l’aide du MATLAB personnalisé du laboratoire.
Idéalement, la mesure continue de l’activité en temps réel des protéines fluorescentes à l’intérieur d’une cellule produira des données précises grâce à la croissance et à la division des cellules. Toutefois, il est difficile d’acquérir de telles données. Cela est dû à la dégradation des protéines fluorescentes, connues sous le nom de photo-blanchiment7, quand ils sont exposés aux radiations dans le processus d’excitation. En outre, les cellules Escherichia coli sont également sensibles à l’excitation, ce qui pourrait conduire à la phototoxicité7. Les deux émissions limitent la quantité de cadres photo qui peuvent être acquis et le temps entre les acquisitions. Le substrat et les types moyens (p. ex., bouillon de lysogène) utilisés pour faire croître les cellules pendant l’imagerie jouent également un rôle essentiel. Nous recommandons fortement d’utiliser un milieu minimal, ce qui minimise le fond non fluorescent et prolonge le temps de division cellulaire.
De plus, l’échantillon doit être préparé en tenant compte des exigences suivantes (1) Le faible taux de division cellulaire permet des expositions moins fréquentes pour l’imagerie étroite du cycle de division et la réduction de la probabilité de phototoxicité et de photobleaching. Nous avons fixé le temps d’acquisition à environ la moitié du temps prévu de mitose (2) La faible densité cellulaire au début de l’expérience permet une meilleure uniformité et une meilleure traçabilité de la division. La densité cellulaire est affectée par le rapport de dilution des cellules d’Escherichia coli, qui est un paramètre significatif pour le succès de ce protocole et doit être déterminé pour chaque laboratoire. Afin d’établir le ratio, chaque nouvelle souche ou média Escherichia coli utilisé devrait être équipé de graphiques du taux de croissance(figure supplémentaire 1). Un rapport approprié a été atteint si les cellules peuvent se développer sans secousse supplémentaire après une courte incubation à partir d’une densité initiale d’environ600 nm OD = 0,1. Les cellules à cette phase se diviseront selon la température ambiante seulement (3) Restriction du mouvement cellulaire : le mouvement cellulaire dépend fortement de la fermeté du substrat (coussin agarose). La fermeté du substrat dépend de la quantité totale d’agarose et du temps de solidification du gel. Les gels ne peuvent pas être laissés pour se solidifier pendant la nuit à température ambiante, car l’Escherichia coli subira une mitose. D’autres facteurs qui influent sur la stabilité du substrat comprennent la quantité d’eau dans l’échantillon et l’humidité. D’autres questions sont examinées en détail dans les résultats représentatifs. Ce protocole fournit de nombreux détails et se déplace progressivement d’une étape à l’autre. Le protocole offre une longue stabilité pour les expériences d’imagerie et fournit un outil de traitement d’image de base.

<table><tbody><tr><td>Plat en verre de 35 mm</td><td>mat</td><td>P35G-0.170-14-C</td><td>d’épaisseur correspondant à la lentille du microscope.</td></tr><tr><td>Agarose&nbsp ;</td><td>Lonza</td><td>5004</td><td>LB préparation</td></tr><tr><td>AHL&nbsp ;</td><td>Inducteur Sigma-Aldrich</td><td>K3007</td><td></td></tr><tr><td>Bacto tryptone&nbsp ;</td><td>BD - Becton, Dickinson et Cie&nbsp ;</td><td>211705</td><td>préparation LB</td></tr><tr><td>Carb</td><td>Invitrogen</td><td>10177-012</td><td>antibiotique</td></tr><tr><td>Carb</td><td>Formedium</td><td>CAR0025</td><td>antibiotique</td></tr><tr><td>Acides aminés&nbsp ;</td><td>BD - Becton, Dickinson et Cie&nbsp ;</td><td>223050</td><td>solution média minimale</td></tr><tr><td>éclipse Ti</td><td>nikon</td><td></td><td>microscope inversé</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>solution média minimale</td></tr><tr><td>Glyserol</td><td>Bio-Lab</td><td>000712050100</td><td>substrat média minimal</td></tr><tr><td>Immersol 518F</td><td>zeiss</td><td>4449600000000</td><td>huile d’immersion</td></tr><tr><td>M9 solution saline&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6030</td><td>minimal media solution</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bio-Lab</td><td>214010</td><td>LB préparation Agar</td></tr><tr><td>noble</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5431</td><td>support minimal substrate</td></tr><tr><td>parafilm</td><td>tape Bemis</td><td>PM-996</td><td>référencé en tant que ruban dans le texte</td></tr><tr><td>Seaplaque gtg Agarose</td><td>Lonza</td><td>50111</td><td>support minimal</td></tr><tr><td>substrate thaymine B1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0376&nbsp ;</td><td>solution multimédia minimale</td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>BD - Becton, Dickinson and Company&nbsp ;</td><td>212750</td><td>Préparation LB</td></tr></tbody></table>

mesure continue du bruit biologique chez escherichia coli à l’aide d’une microscopie en accéléré

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

Le protocole développé ici offre un outil pour permettre le suivi informatique de la division Escherichia coli et des niveaux fluorescents sur plusieurs heures. Le processus commence par le dépistage des colonies qui survivent sur un minimum de médias, en supposant que seul Escherichia coli hébergeant le plasmide correct sera en mesure de prospérer dans les conditions spécifiques. Étant donné que le processus de construction de grands circuits génétiques, nécessitant l’assemblage de nombreuses parties d’ADN, est difficile, les composants du circuit sont souvent répartis entre plusieurs plasmides à différents numéros de copie nécessitant l’utilisation de plusieurs antibiotiques. Les mutations dans le plasmide peuvent détruire la transcription des gènes de résistance aux antibiotiques et interjecter avec la gestion des ressources dans la cellule menant à la nécrose. La colonie sélectionnée est fixée sur une boîte de Pétri à fond de verre et quelques plans de mise au point sont sélectionnés pour le suivi de la microscopie dans les domaines lumineux et fluorescents. Le protocole maintient la mise au point de l’image pendant plus de 12 heures dans des conditions initiales qui ne peuvent pas être réglementées, créant quelques difficultés. Par exemple, les cellules mortes commencent à s’accumuler dans le champ de concentration des lentilles après quelques heures d’imagerie, ce qui provoque l’accumulation de toxines et le signal de flou et de décomposition. L’épuisement des nutriments introduit de nouveaux processus métaboliques et entrave la réponse souhaitée du circuit. La température de l’expérience abaisse l’effectivité des inducteurs et des antibiotiques, ce qui peut endommager davantage la fiabilité du signal. Le gel média minimal rétrécit et sèche, et par conséquent la mise au point optique change au fil du temps. Nous avons développé cette méthode pour surmonter ces défis dans Escherichia coli, similaire aux travaux précédents développant des méthodes analogues pour d’autres micro-organismes. En outre, cette méthode offre un algorithme pour quantifier le bruit stochastique total dans les cellules inchangées et altérées, constatant que les résultats sont compatibles avec les prédictions de l’analyseur de flux comme le montre un coefficient de variation similaire (CV).

Le logiciel analyse les images de domaine de champ lumineux qui sont hors-blanc et noir. L’Escherichia coli ressemblera à des formes oblongues noires sur un fond blanc éteint et une plage dynamique de luminance devrait montrer une pointe en son centre (Figure 1). Dans les images fluorescentes, les cellules peuvent avoir un petit halo, mais les cellules individuelles aux formes oblongues peuvent encore être résolues. Un événement de mitose doit d’abord être détecté après 30 minutes. ...

Ce travail présente une méthode de microscopie qui permet l’imagerie en direct d’une seule cellule d’Escherichia coli pour l’analyse et la quantification du comportement stochastique des circuits génétiques synthétiques.

Mesure continue du bruit biologique chez Escherichia Coli à l’aide d’une microscopie en accéléré

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...

Ce protocole dans les plantes mesure continue des circuits génétiques dans E.coli et le calcul de la variabilité du signal et le rapport signal-bruit dans les cellules bactériennes individuelles pour évaluer les performances du circuit. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle est facilement adaptable à différentes souches et laboratoires, nécessite une formation minimale et pas d’équipement spécial, et est relativement peu coûteux. Le bruit joue un rôle important dans la détermination de la fonctionnalité des systèmes biologiques.À l’heure actuelle, il y a un intérêt à construire des circuits génétiques à grande échelle. Ces systèmes peuvent être inhibés par le bruit Assurez-vous de bien sécher les échantillons, de garder ces plaquettes froides à quatre degrés Celsius aussi longtemps que possible, et de couper et de diviser les pièces patiemment et doucement. Pour préparer les bactéries à l’analyse inoculer une seule colonie à partir d’une culture transfected E.coli.Par exemple, un circuit avec un journaliste GFP. Dans un tube de verre contenant cinq millilitres de bouillon LB, complétons-le avec les antibiotiques pertinents. Faire pousser les cellules à 37 degrés Celsius et 250 révolutions par minute dans un incubateur de secousses pendant deux heures jusqu’à ce que le bouillon soit nuageux.À la fin de l’incubation, faites tourner un millilitre de solution de dilution dans une mini centrifugeuse de deux millilitres et transférez 30 microlitres de bactéries et tout le volume de la solution de dilution dans un nouveau tube de deux millilitres. Ensuite, incuber la culture pendant une heure en secouant avant d’ensemencer 40 à 60 microlitres de cette suspension sur les plaques de culture M9. Pour préparer les bactéries à l’analyse, inoculer une seule colonie à partir d’une culture transfectée d’E.Coli.Par exemple, un circuit avec un journaliste GFP dans un tube de verre contenant cinq millilitres de bouillon LB complété par les antibiotiques pertinents. Faire pousser les cellules à 37 degrés Celsius et 250 révolutions par minute dans un incubateur de secousses pendant deux heures jusqu’à ce que le bouillon soit nuageux. À la fin de l’incubation, faites tourner un millilitre de solution de dilution dans un mini tube de micro centrifugeuse de deux millilitres et transférez 30 microlitres de bactéries et tout le volume de la solution de dilution dans un nouveau tube de deux millilitres.Puis incuber la culture pendant une heure avec des secousses. Pour préparer des plaques de microscope, mélanger 112,5 milligrammes d’agar à faible fusion avec 40 milligrammes d’agar, et un millilitre d’acide casamino de 2% dans un flacon Erlenmeyer de 25 millilitres. Ensuite, ajoutez 8,92 millilitres de milieu minimal sur les lèvres intérieures d’une fiole Erlenmeyer de 25 millilitres et micro-ondes la solution résultante en rafales courtes, de deux à trois secondes.Ensuite, réglez le bain d’eau à 55 degrés Celsius. Lorsque la solution est claire, placez le flacon Erlenmeyer de 25 millilitres dans un bain d’eau de 60 degrés Celsius et laissez refroidir la solution d’agar jusqu’à ce que sa température tombe à environ 45 à 50 degrés Celsius. Pendant le refroidissement de l’agar, nettoyez le banc de laboratoire avec 70 % d’éthanol et lissez un morceau de ruban adhésif de laboratoire sur le banc nettoyé.Placez une feuille de couvercle en verre sur la bande et placez un deuxième bordereau de couverture à proximité. Ajouter la solution d’agar refroidie aux antibiotiques et à la solution appropriés. Verser 1,5 millilitres de solution fraîchement préparée pour geler sur le bordereau de couverture placé sur la bande et placer le deuxième bordereau de couverture sur le gel, en prenant soin d’éviter les bulles.Remettre l’Erlenmeyer au bain d’eau chaude et couvrir les glissades de couverture pendant 20 minutes. Retournez les feuillets de couverture pendant une incubation d’une heure à quatre degrés Celsius. À la fin de l’incubation, retirer les feuillets de couverture du gel sec et couper un petit tampon de l’agarose.Pendant l’incubation, ajouter six gouttelettes de microlitre de la suspension bactérienne préparée dans un plat de 35 millimètres et laisser sécher les gouttes pendant au moins 15 à 30 minutes. Ensuite, placez soigneusement le tampon à la fois sur une gouttelette de bactéries et laissez les échantillons se fixer pendant 20 minutes à température ambiante. Pour placer le lit d’agar sans salir l’échantillon, placez soigneusement la garniture fraîche sur la gouttelette avec le tapotage doux.Pour l’image des échantillons, retirez le flacon de l’eau et laissez refroidir la solution gel à la température corporelle. Verser trois millimètres de gel sur le périmètre de la plaque d’échantillonnage. Lorsque l’agarose s’est solidifiée, sceller la plaque avec du ruban adhésif et utiliser une aiguille de calibre 25 pour percer plusieurs trous dans la bande.Placez ensuite la plaque à l’envers à quatre degrés Celsius pendant au moins 30 minutes pour permettre à l’agarose de se solidifier complètement, tout en empêchant la mitose cellulaire. Dans les 24 heures, utilisez un microscope confocal de fluorescence pour localiser l’échantillon au grossissement le plus bas et engager le système de focalisation automatique du microscope. Appliquez de l’huile sur l’objectif approprié et utilisez le contrôleur de plate-forme pour déplacer la plaque pour étendre soigneusement l’huile.Ensuite, engagez à nouveau la mise au point automatique et suivez la suggestion par défaut pour les sections transversales z step pour l’image de l’échantillon. L’E.coli doit apparaître sous forme de formes oblongues noires sur un fond blanc éteint. Et la plage dynamique de la luminance devrait montrer un pic en son centre.Les événements de mitose peuvent d’abord être détectés par microscopie de fluorescence après 30 minutes. Bien que les cellules individuelles peuvent être difficiles à détecter à faible grossissement. Les cultures de cellules bactériennes préparées à un rapport de dilution incorrect peuvent démontrer un nombre immuable de cellules, et les échantillons préparés sans scellement des plaques peuvent présenter un rétrécissement excessif, entraînant une perte de concentration.Les cellules peuvent également indent le gel dans leur recherche de nutriments, résultant en empilement des cellules bactériennes les uns sur les autres et compromettre le monocouche cellulaire, empêchant efficacement la détection cellulaire et la mesure fiable du signal fluorescent. Comme le suggèrent ces données, l’étape cellulaire du cycle de division n’affecte pas le niveau de bruit, car différentes plages de surface démontrent la même tendance. En outre, aucun changement substantiel dans le rapport signal-bruit n’est observé entre GFP et superfold GFP, comme l’illustrent ces données représentatives.Lors de l’exécution de cette procédure, prenez soin de déterminer le rapport de dilution correct pour la souche bactérienne utilisée pour l’expérience. La comparaison du rapport signal-bruit de chaque circuit réglementé à cette ligne de base permet de choisir le meilleur circuit de performance et peut révéler des phénomènes intéressants

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