Name: Préconcentration et isolation des microvesicules et des exosomes sur papier (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 26 s
Description: Découvrez la préconcentration et l'isolation des microvésicules et exosomes sur papier avec le dispositif XO Pad. Cette méthode sans chimie offre des taux de récupération supérieurs aux techniques conventionnelles.

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Cette étude a été soutenue par la National Research Foundation of Korea, Grant NRF-2018R1D1A1A09084044. J. H. Lee a reçu le soutien d’une subvention de recherche de l’Université Kwangwoon en 2019. Hyerin Kim a reçu l’appui du « Programme de développement des compétences pour les spécialistes de l’industrie » du Ministère coréen du commerce, de l’industrie et de l’énergie (MOTIE), géré par le Korea Institute for Advancement of Technology (KIAT) (No. P0002397, programme drh pour la convergence industrielle des appareils intelligents portables).

1. Fabrication d’appareils
<ol><li>Définir la région à imprimer sur papier à l’aide d’un logicield’imprimante( Table des matériaux ). REMARQUE : La conception comporte 12 couches à motifs de cire dans lesquelles les diamètres des zones d’échantillonnage circulaires se rétrécissent progressivement de 5 mm à 2 mm (figure 1A).</li>
	<li>Imprimer de la cire hydrophobe sur les régions désignées des deux côtés du papier cellulosique ( Tableau des matériaux) àl’aide d’uneimprimante de cire commerciale (Tableau des matériaux) ( Figure1B).</li>
	<li>Placer le papier imprimé ciré dans un four de laboratoire pendant 80 s à 120 °C. REMARQUE : Cette étape permet à la cire d’atteindre l’intérieur du papier en réalisant un réflow thermique de la cire imprimée. Avec ce protocole d’incubation, la résolution du motif est de ~2 mm. Ainsi, veillez à ne pas imprimer des motifs de moins de 2 mm. Sinon, les motifs seront bloqués par la cire.</li>
	<li>Couper le papier imprimé ciré à l’aide d’un coupeur pour fabriquer des appareils individuels (figure 1C).</li>
	<li>Baisse de 5 μL et de 2 μL de membrane permsélective (p. ex., Nafion; Tableau des matériaux) sur les zones d’échantillonnage dans les couches les plus à gauche et à droite, respectivement (figure 1D).</li>
	<li>Placez les couches recouvertes de la membrane permsélective sur une plaque chauffante à 70 °C pendant 30 min pour évaporer le solvant de membrane permsélective.</li>
	<li>Sceller la surface la plus externe de la couche enduite face à la solution tampon avec du ruban sensible à la pression, laissant un petit trou.</li>
	<li>Pliez l’appareil individuel imprimé (c.-à-d. Exo-PAD) d’avant en arrière le long des lignes blanches. REMARQUE : En pliant l’appareil, toutes les zones d’échantillonnage deviennent convergentes (figure 1E). Cette conception convergente concentre les lignes de champ électrique lorsque la tension est appliquée pour ICP, réalisant une préconcentration plus intensive des microvesicules et des exosomes.</li>
</ol>2. Enrichissement et focalisation spatiale des microvesicules et des exosomes par polarisation de la concentration d’ions
<ol><li>Chargez 15 μL de l’échantillon de microvesicle et d’exosome (~3 x 1011 particules/mL en 0,1x de phosphate tamponné saline [PBS] avec 0,05% Tween 20) dans les zones d’échantillonnage convergentes en pipeting et attendre quelques secondes pour assurer le mouillage complet de toutes les zones d’échantillonnage (Figure 1F).</li>
	<li>Placez deux chambres acryliques aux deux extrémités de l’Exo-PAD et serrez l’Exo-PAD en toute sécurité avec de petits pinces à reliure pour éviter le déploiement (Figure 1G).</li>
	<li>Remplissez les chambres de 110 μL de 0,1 x PBS et insérez deux électrodes Ag/AgCl (Figure 1H).</li>
	<li>Appliquer 30 V sur les électrodes pendant 20 min à l’aide d’un système de mesure de la source de tension de courant (Table des matériaux). REMARQUE : La tension appliquée génère le phénomène ICP et préconcentre donc les microvesicles et les exosomes sur les couches 8 et 9 de l’Exo-PAD.</li>
</ol>3. Isolation des microvesicules et exosomes enrichis
<ol><li>Séparez l’Exo-PAD plié des chambres acryliques et dépliez l’appareil pour isoler les microvesicules enrichies et les exosomes des autres couches (Figure 1I).</li>
	<li>Éperner les zones d’échantillonnage dans les couches 8 et 9, où les microvesicules et les exosomes sont enrichis, pour l’analyse en aval (Figure 1J).</li>
</ol>4. Analyse de microscopie électronique à balayage
<ol><li>Fixer les microvesicules enrichies et les exosomes en immergeant les zones perforées dans 2,5% de glutaraldéhyde dans 0,1 M tampon de cacodylate de sodium pour 1 h et dans 1% de tétroxide d’osmium dans 0,1 M de cacodylate de sodium pendant 1 h. ATTENTION : Le tétroxide d’osmium est un produit chimique hautement toxique et dangereux. Parce que le tétroxide d’osmium peut pénétrer dans les plastiques, il doit être stocké dans le verre. Toute manipulation de tétroxide d’osmium doit être effectuée dans un capot de fumée chimique avec des gants de nitrule double.</li>
	<li>Déshydrater les microvesicules fixes et les exosomes avec des teneurs ascendantes de 200 éthanols de preuve (c.-à-d. 50%, 70%, 90%, et 100%) pendant 30 min chacun.</li>
	<li>Sécher chimiquement l’échantillon en l’immergeant dans l’hexaméthyldisilazane dans un desiccateur pendant 30 min. ATTENTION : Hexaméthyldisilazane est un produit chimique inflammable et sensible à l’humidité. Il doit être stocké dans une zone sèche et bien aérée, à l’écart des sources d’inflammation.</li>
	<li>Enrober les microvesicules et les exosomes complètement séchés d’or/palladium (~20 nm) par pulvérisation et capture de microscopie électronique à balayage (SEM).</li>
</ol>5. Analyse de suivi des nanoparticules
<ol><li>Poinçonnez les zones d’échantillon dans les couches 6, 8 et 10 à l’aide d’un poinçon de biopsie après 20 min d’opération de l’appareil.</li>
	<li>Plongez chaque zone perforée dans une solution tampon (0,1 x PBS avec 0,01% Tween 20).</li>
	<li>Vortex pendant 10 min et centrifugeuse de 30 s à 6 000 tr/min pour réutiliser les microvesicules enrichies et les exosomes.</li>
	<li>Retirer les zones perforées de la solution et mesurer la concentration de microvesicules et d’exosomes par un instrument d’analyse de suivi des nanoparticules (NTA)(Tableau des matériaux).</li>
</ol>

<ol><li>Edgar, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Q+%26+A%3A+What+are+exosomes%2C+exactly%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Q & A: What are exosomes, exactly.</a> BMC Biology. 14 (1), 1-7 (2016).</li>
<li>Contreras-Naranjo, J. C., Wu, H. J., Ugaz, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+exosome+isolation+and+analysis%3A+Enabling+liquid+biopsy+for+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for exosome isolation and analysis: Enabling liquid biopsy for personalized medicine.</a> Lab on a Chip. 17 (21), 3558-3577 (2017).</li>
<li>Simons, M., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+-+vesicular+carriers+for+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Exosomes - vesicular carriers for intercellular communication.</a> Current Opinion in Cell Biology. 21 (4), 575-581 (2009).</li>
<li>Ståhl, A. L., Johansson, K., Mossberg, M., Kahn, R., Karpman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+microvesicles+in+normal+physiology%2C+pathophysiology%2C+and+renal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Exosomes and microvesicles in normal physiology, pathophysiology, and renal diseases.</a> Pediatric Nephrology. 34 (1), 11-30 (2019).</li>
<li>Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paper-based+devices+for+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Paper-based devices for isolation and characterization of extracellular vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52722(2015).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origami-paper-based+device+for+microvesicle%2Fexosome+preconcentration+and+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Origami-paper-based device for microvesicle/exosome preconcentration and isolation.</a> Lab on a Chip. 19 (23), 3917-3921 (2019).</li>
<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+Exosomes%2C+microvesicles%2C+and+friends%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends.</a> Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li>
<li>Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+microvesicles%3A+Extracellular+vesicles+for+genetic+information+transfer+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Exosomes and microvesicles: Extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy.</a> Human Molecular Genetics. 21, 125-134 (2012).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field-Free+Isolation+of+Exosomes+from+Extracellular+Vesicles+by+Microfluidic+Viscoelastic+Flows%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Field-Free Isolation of Exosomes from Extracellular Vesicles by Microfluidic Viscoelastic Flows.</a> ACS Nano. 11 (7), 6968-6976 (2017).</li>
<li>Marczak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+isolation+and+preconcentration+of+exosomes+by+ion+concentration+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Simultaneous isolation and preconcentration of exosomes by ion concentration polarization.</a> Electrophoresis. 39 (15), 2029-2038 (2018).</li>
<li>Livshts, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+exosomes+by+differential+centrifugation%3A+Theoretical+analysis+of+a+commonly+used+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol.</a> Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).</li>
<li>Chiriacò, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lab-on-chip+for+exosomes+and+microvesicles+detection+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Lab-on-chip for exosomes and microvesicles detection and characterization.</a> Sensors. 18 (10), 3175(2018).</li>
<li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 1-11 (2015).</li>
<li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li>
<li>Han, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrokinetic+size-based+spatial+separation+of+micro%2Fnanospheres+using+paper-based+3d+origami+preconcentrator%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Electrokinetic size-based spatial separation of micro/nanospheres using paper-based 3d origami preconcentrator.</a> Analytical Chemistry. 91 (16), 10744-10749 (2019).</li>
<li>Yeh, S. H., Chou, K. H., Yang, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+pre-concentration+with+high+enrichment+factors+at+a+fixed+location+in+paper-based+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Sample pre-concentration with high enrichment factors at a fixed location in paper-based microfluidic devices.</a> Lab on a Chip. 16 (5), 925-931 (2016).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Bien que l’Exo-PAD ait été utilisé avec succès pour l’enrichissement et l’isolement des microvesicules et des exosomes, plusieurs points critiques doivent être soigneusement examinés : 1) le temps et la température d’incubation du four pendant la préparation de l’appareil, 2) le temps de traitement, 3) l’application de la tension avec des nombres de couches variables et les diamètres de la surface d’échantillonnage, et 4) l’applicabilité aux échantillons cliniques.
Le temps et la température d...

Les microvesicules et les exosomes sont de petites vésicules membranaires mesurant respectivement 0,2−1 μm et 30−200 nm. Ils sont sécrétés dans l’environnement extracellulaire par plusieurs types de cellules différents1,2,3,4,5. Ils contiennent des informations relatives aux cellules parentales sous forme de sous-ensembles d’ADN, d’ARNm, de miARN, de protéines et de lipides, et circulent dans tout le corps via divers fluides corporels tels que le sérum, le plasma, l’urine, le liquide céphalo-rachidien, le liquide amniotique et la salive6,,7,8,9. Ainsi, les techniques d’isolement efficace des microvesicules et des exosomes des fluides biologiques peuvent fournir de vastes possibilités dans les domaines du diagnostic, du pronostic et de la surveillance en temps réel de la maladie, ainsi que dans le développement de nouvelles thérapies.
Cependant, la méthode d’isolement conventionnelle pour les microvesicules et les exosomes basée sur l’ultracentrifugation prend énormément de temps et entraîne une perte et une contamination importantes de l’échantillon. C’est parce qu’il implique plusieurs étapes lourdes de pipetage et de chargement et le rejet de divers réactifs avec ultracentrifugation répétée5,6,10,11,12. En outre, le stress de cisaillement élevé induit par l’ultracentrifugation (~100 000 x g)peut causer la lyse physique des microvesicules et des exosomes, ce qui donne de faibles taux de récupération (5−23%)6,13,14. Par conséquent, une technique d’isolement discrète et très efficace pour les microvesicules et les exosomes doit être développée pour réduire les dommages et les pertes, atteignant ainsi des taux de récupération plus élevés.
Un dispositif origami-papier (Exo-PAD) a été développé pour un isolement plus simple, plus doux et très efficace des microvesicules et des exosomes6. La conception de l’Exo-PAD est un papier multifréqué avec des zones d’échantillonnage reliées en série qui diminuent progressivement de diamètre. La technique de polarisation de la concentration des ions (ICP), qui est un phénomène nano-électrocinétique qui préconcentre les biomolécules chargées par les préconcentrés, a été intégrée à cette conception unique. L’utilisation de l’Exo-PAD a entraîné un enrichissement quintuple des microvesicules et des exosomes dans des couches spécifiques et leur isolement en déroulant simplement l’appareil. Cet article décrit l’Exo-PAD en détail, de la fabrication et de l’exploitation globales de l’appareil à l’analyse de son utilisation, pour illustrer la méthode et afficher des résultats représentatifs6.

<table><tbody><tr><td>Électrodes Ag/AgCl</td><td>A-M Systems, Inc.</td><td>531500</td> Albumine de sérum de bovin de <td>0,15" de diamètre</td></tr><tr><td>(BSA), conjugué Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A13101</td><td>BSA conjugué avec Alexa Fluor 594 (Ex/Em : 590/617 nm)</td></tr><tr><td>Tampon carbonate-bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3041-50CAP</td><td>Tampon carbonaté</td></tr><tr><td>Logiciel CorelDraw (Coral Co., Canada)</td>Logiciel d’imprimante <td>Corel Corporation</td><td></td><td>pour définir l’impression à la cire région</td></tr><tr><td>ColorQube 8870</td><td>Xerox Corporation</td><td></td><td>Imprimante à cire</td></tr><tr><td>Papier de chromatographie grade 1</td><td>Whatman</td><td>3001-861</td><td>Papier cellulose, dimension : 20 * 20 cm</td></tr><tr><td>Étalons d’exosomes marqués par fluorescence</td><td>HansaBioMed Life Sciences, Ltd.</td><td>HBM-F-PEP-100</td><td>Exosome marqué avec FITC (Ex/Em : 490/520 nm)</td></tr><tr><td>Keithley 2410 source-mètre de courant/tension</td><td>Keithley Instruments, Inc.</td><td></td><td>Actuel&ndash ; système de mesure de source de tension</td></tr><tr><td>Solution de résine perfluorée de nafion</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31175-20-9</td><td>Membrane permsélective, 20 % en poids dans le mélange d’alcools aliphatiques inférieurs et d’eau ; contient 34 % d’eau</td></tr><tr><td>NanoSight LM10</td><td>Technologie</td><td></td> NanoSight <td>Machine d’analyse de suivi des nanoparticules (NTA)</td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS, pH7,4)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010001</td><td></td></tr></tbody></table>

préconcentration et isolation des microvesicules et des exosomes sur papier

Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes

Les microvesicules et les exosomes sont de petites vésicules membraneuses libérées dans l’environnement extracellulaire et distribuées dans tout le corps. Étant donné qu’ils contiennent diverses biomolécules d’origine cellulaire parentale telles que l’ADN, l’ARNm, le miARN, les protéines et les lipides, leur enrichissement et leur isolement sont des étapes essentielles pour leur exploitation en tant que biomarqueurs potentiels pour les applications cliniques. Toutefois, les méthodes d’isolement conventionnelles (p. ex., l’ultracentrifugation) causent des pertes et des dommages importants aux microvesicules et aux exosomes. Ces méthodes nécessitent également de multiples étapes répétitives d’ultracentrifugation, de chargement et de gaspillage de réactifs. Cet article décrit une méthode détaillée pour fabriquer un dispositif à base de papier origami (Exo-PAD) conçu pour l’enrichissement et l’isolement efficaces des microvesicules et des exosomes d’une manière simple. La conception unique de l’Exo-PAD, composée de couches multiples en forme d’accordéon avec des zones d’échantillonnage convergentes, est intégrée à la technique de polarisation de la concentration des ions, permettant ainsi un enrichissement quintuple des microvesicules et des exosomes sur des couches spécifiques. En outre, les microvesicules enrichies et les exosomes sont isolés en déployant simplement l’Exo-PAD.

Le temps d’opération doit être optimisé pour atteindre le rendement maximal de récupération des microvesicles enrichis et des exosomes. Le temps insuffisant ne permet pas une migration suffisante des microvesicules et des exosomes, ce qui diminue l’enrichissement, alors que le temps excessif détériore la focalisation spatiale et disperse donc les microvesicules et les exosomes. Ainsi, grâce à l’étape d’optimisation du temps, le facteur maximum de préconcentration des microvesicules et des exosomes et l’emplacement final ...

Présenté est un protocole pour fabriquer un dispositif à base de papier pour l’enrichissement et l’isolement efficaces des microvesicules et des exosomes.

Préconcentration et isolation des microvesicules et des exosomes sur papier

Microvesicles and exosomes are small membranous vesicles released to the extracellular environment and circulated throughout the body. Because they ...

Dans ce protocole, nous décrivons une méthode simple pour fabriquer un dispositif basé sur le papier appelé le XO Pad, qui est conçu pour l’enrichissement efficace dans l’isolement des vésicules extracellulaires. Le XO Pad est un dispositif simple qui peut pré-concentrer et isoler la vésicule extracellulaire sans l’utilisation de produits chimiques ou de machines de travail, tout en montrant des taux de récupération plus élevés que les méthodes conventionnelles. Commencez par définir la région à imprimer avec un logiciel d’imprimante.La conception devrait avoir 12 couches à motifs de cire dans lesquelles les diamètres des zones de l’échantillon circulaire se rétrécir progressivement de cinq à deux millimètres. Ensuite, imprimez de la cire hydrophobe sur les régions désignées des deux côtés du papier cellulose. Placez le papier imprimé à la cire dans un four de laboratoire pendant 80 secondes à 120 degrés Celsius, puis coupez le papier imprimé à la cire à l’intérieur d’un coupeur pour fabriquer des appareils XO Pad individuels.Déposez respectivement cinq et deux microlitres de membrane sélective perm sur les zones de l’échantillon dans la plupart et la droite gauches de la plupart des couches. Placez les couches codées avec la membrane sélective perm sur une plaque chaude à 70 degrés Celsius pendant 30 minutes pour évaporer le solvant. Ensuite, scellez la surface extérieure de la couche enduite face à la solution tampon avec du ruban sensible à la pression, en laissant un petit trou.Pliez l’appareil XO Pad d’avant en arrière le long des lignes blanches pour relier convergentement toutes les zones de l’échantillon. Pipette 15 microlitres du microvesicle et de l’échantillon exosome dans les zones d’échantillonnage convergentes et attendre quelques secondes pour assurer un mouillage complet. Placez deux chambres acryliques aux deux extrémités de la garniture XO et serrez-la solidement avec de petites pinces de liant pour éviter le déroulement.Remplissez les chambres de 110 microlitres de 0,1 X PBS et insérez deux électrodes argentées. Ensuite, utilisez un système de mesure de la source de tension actuelle pour appliquer 30 volts sur les électrodes pendant 20 minutes. Pour isoler les microvesicles et exosomes enrichis, séparez le XO Pad plié des chambres acryliques et dépliez l’appareil pour isoler les particules enrichies des autres couches.Percer les zones de l’échantillon dans les couches huit et neuf où les microvesicles et les exosomes sont enrichis pour l’analyse en aval. Un test de migration en accéléré des microvesicles et exosomes étiquetés fluorescents a été effectué afin d’optimiser le temps de fonctionnement pour une récupération maximale des particules enrichies. Les intensités de fluorescence dans tous les secteurs d’échantillon ont été quantifiées avec le logiciel d’ImageJ.Avant le processus d’enrichissement, les microvesicles et les exosomes étaient dispersés dans toutes les zones de l’échantillon avec une diminution graduelle de l’intensité. Après 10 minutes de traitement, les particules ont migré électro-kinétiquement et une prise de pré-concentration instantanée est apparue sur la couche sept. Lorsque le temps a atteint 20 minutes, les microvesicles et les exosomes étaient fortement concentrés sur les couches huit et neuf et enrichis cinq fois en fonction des intensités de fluorescence.L’intégrité des microvesicles et exosomes enrichis dans la couche huit a été étudiée avec SEM. Beaucoup plus de particules non endommagées ont été observées après le processus d’enrichissement. La distribution de taille des microvésicules et exosomes enrichis a également été analysée.Par la suite, la concentration réelle des microvésicules et des exosomes enrichis sur les zones de l’échantillon dans les couches six, huit et 10 a été analysée. Dans la couche huit, les microvesicles et les exosomes ont été pré-concentrés par un facteur de 5.58, mais aucune pré-concentration notable n’a été observée dans les autres couches. Pour assurer la reproductibilité de cette procédure, précisément suivi le protocole pour le temps d’incubation du four et la température pendant la vérification de l’appareil et le temps de fonctionnement de l’appareil parce que ce sont les conditions optimisées.Le XO Pad peut également être utilisé pour séparer et isoler la vésicule extracellulaire d’échantillons riches en protéines, tels que le sérum ou le plasma, en utilisant un tampon carbonate. Ce protocole peut fournir un outil de préparation efficace et simple, avec ses capacités de pré-concentration et d’isolement requises pour la recherche clinique, telles que le diagnostic, l’administration de médicaments, l’immunothérapie et d’autres thérapeutiques.

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Biochimie

Ce document démontre des méthodes pour l'isolement, la purification et la détection des exosomes, ainsi que des techniques d'analyse de leur contenu moléculaire. Ces méthodes sont adaptables pour l'isolement des deux exosomes milieux de culture cellulaire et les fluides biologiques, et peut-delà de l'analyse de contenu moléculaire également être utile dans les études fonctionnelles.

Isolement et caractérisation de l&#39;ARN-Contenant exosomes

Ce protocole décrit en détail une méthode pour isoler des vésicules extracellulaires (VE), de petites particules libérées par des cellules membranaires, d'aussi peu que 10 échantillons de sérum ul. Cette approche évite la nécessité d'ultracentrifugation, ne nécessite que quelques minutes de temps de dosage, et permet l'isolement des véhicules électriques à partir d'échantillons de volumes limités.

Dispositifs à base de papier pour l&#39;isolement et la caractérisation de vésicules extracellulaire

Le liquide biliaire est une source précieuse de vésicules/exosomes extracellulaires qui contiennent des biomarqueurs potentiellement importants. Ce protocole représente une méthode robuste pour isoler les exosomes de la bile humaine en vue d’analyses plus approfondies, y compris le profilage des miARN.

L&#39;isolement et le profilage des exosomes de Bile humain contenant microARN-

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Isolement et caractérisation de microvésicules dans le sang périphérique

Nous présentons ici un protocole visant à purifier les exosomes de plasma et de sérum réduit co purification de protéines sanguines non-exosomal. Le protocole optimisé inclut l’ultrafiltration, le traitement de la protéase et chromatographie d’exclusion. Améliorée de purification des exosomes des analyses en aval avantages, y compris la quantification plus précise des vésicules et la caractérisation de la protéomique.

Digestion des protéines, Ultrafiltration et chromatographie d’Exclusion afin d’optimiser l’isolement des Exosomes de sérum et de Plasma sanguin humain

Il s'agit d'un protocole visant à isoler les vésicules extracellulaires tissulaires (VE) du foie. Le protocole décrit un processus en deux étapes impliquant la perfusion de collagène suivie de l'ultracentrifugation différentielle pour isoler les véhicules électriques du tissu hépatique.

Isolement des vésicules extracellulaires de tissu du foie

Ce protocole isole les vésicules extracellulaires (VE) loin des virions à haut rendement et à haut rendement en incorporant les précipitations EV, l'ultracentrifugation du gradient de densité et la capture des particules pour permettre un flux de travail rationalisé et une réduction du démarrage volumes, ce qui entraîne des préparations reproductibles pour une utilisation dans toutes les recherches sur les véhicules électriques.

Purification des préparations extracellulaires de vésicule à haut rendement loin du virus

Ce protocole montre comment isoler les petites vésicules extracellulaires des cellules souches mésenchymateuses dérivées du cordon ombilical humain (hUC-MSC-sEVs) avec un simple réglage de paillasse à l’échelle du laboratoire. La distribution granulométrique, la concentration en protéines, les marqueurs de sEVs et la morphologie des hUC-MSC-sEVs isolés sont caractérisés par l’analyse de suivi des nanoparticules, le dosage de la protéine BCA, le transfert Western et le microscope électronique à...

Une méthode de filtration de paillasse simple pour isoler de petites vésicules extracellulaires à partir de cellules souches mésenchymateuses humaines

Ce protocole fournit une méthode d’isolation rapide et spécifique à la taille pour les petites vésicules extracellulaires en optimisant la taille de la buse de pulvérisation d’air, la pression du fluide de gaine, la pression d’écoulement de l’échantillon, la tension, le gain et les paramètres de seuil de déclenchement.

Optimisation des paramètres de tri cytométrique en flux pour l’isolation et la purification à haut débit de petites vésicules extracellulaires

Les vésicules extracellulaires sont extrêmement prometteuses pour les applications biomédicales, mais les méthodes d’isolement actuelles prennent du temps et ne sont pas pratiques pour une utilisation clinique. Dans cette étude, nous présentons un dispositif microfluidique qui permet d’isoler directement des vésicules extracellulaires à partir de grands volumes de biofluides de manière continue avec un minimum d’étapes.

Isolement en une seule étape de vésicules extracellulaires à partir d’échantillons de grand volume avec un dispositif microfluidique A4F bifurqué

Ce protocole décrit l’isolement de petites vésicules extracellulaires à partir du muscle squelettique murin et de la moelle osseuse à l’aide de digestion enzymatique et de chromatographie à exclusion de taille, permettant la récupération reproductible de fractions enrichies en vésicule à partir de tissus structurellement complexes et à faible rendement pour une analyse moléculaire en aval.

Isolation de petites vésicules extracellulaires du muscle squelettique murin et de la moelle osseuse par chromatographie à exclusion de taille

Découvrez la préconcentration et l'isolation des microvésicules et exosomes sur papier avec le dispositif XO Pad. Cette méthode sans chimie offre des taux de récupération supérieurs aux techniques conventionnelles.

Préconcentration et isolation des microvesicules et des exosomes sur papier

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