Préconcentration et isolation des microvesicules et des exosomes sur papier

Dans ce protocole, nous décrivons une méthode simple pour fabriquer un dispositif basé sur le papier appelé le XO Pad, qui est conçu pour l’enrichissement efficace dans l’isolement des vésicules extracellulaires. Le XO Pad est un dispositif simple qui peut pré-concentrer et isoler la vésicule extracellulaire sans l’utilisation de produits chimiques ou de machines de travail, tout en montrant des taux de récupération plus élevés que les méthodes conventionnelles. Commencez par définir la région à imprimer avec un logiciel d’imprimante.

La conception devrait avoir 12 couches à motifs de cire dans lesquelles les diamètres des zones de l’échantillon circulaire se rétrécir progressivement de cinq à deux millimètres. Ensuite, imprimez de la cire hydrophobe sur les régions désignées des deux côtés du papier cellulose. Placez le papier imprimé à la cire dans un four de laboratoire pendant 80 secondes à 120 degrés Celsius, puis coupez le papier imprimé à la cire à l’intérieur d’un coupeur pour fabriquer des appareils XO Pad individuels.

Déposez respectivement cinq et deux microlitres de membrane sélective perm sur les zones de l’échantillon dans la plupart et la droite gauches de la plupart des couches. Placez les couches codées avec la membrane sélective perm sur une plaque chaude à 70 degrés Celsius pendant 30 minutes pour évaporer le solvant. Ensuite, scellez la surface extérieure de la couche enduite face à la solution tampon avec du ruban sensible à la pression, en laissant un petit trou.

Pliez l’appareil XO Pad d’avant en arrière le long des lignes blanches pour relier convergentement toutes les zones de l’échantillon. Pipette 15 microlitres du microvesicle et de l’échantillon exosome dans les zones d’échantillonnage convergentes et attendre quelques secondes pour assurer un mouillage complet. Placez deux chambres acryliques aux deux extrémités de la garniture XO et serrez-la solidement avec de petites pinces de liant pour éviter le déroulement.

Remplissez les chambres de 110 microlitres de 0,1 X PBS et insérez deux électrodes argentées. Ensuite, utilisez un système de mesure de la source de tension actuelle pour appliquer 30 volts sur les électrodes pendant 20 minutes. Pour isoler les microvesicles et exosomes enrichis, séparez le XO Pad plié des chambres acryliques et dépliez l’appareil pour isoler les particules enrichies des autres couches.

Percer les zones de l’échantillon dans les couches huit et neuf où les microvesicles et les exosomes sont enrichis pour l’analyse en aval. Un test de migration en accéléré des microvesicles et exosomes étiquetés fluorescents a été effectué afin d’optimiser le temps de fonctionnement pour une récupération maximale des particules enrichies. Les intensités de fluorescence dans tous les secteurs d’échantillon ont été quantifiées avec le logiciel d’ImageJ.

Avant le processus d’enrichissement, les microvesicles et les exosomes étaient dispersés dans toutes les zones de l’échantillon avec une diminution graduelle de l’intensité. Après 10 minutes de traitement, les particules ont migré électro-kinétiquement et une prise de pré-concentration instantanée est apparue sur la couche sept. Lorsque le temps a atteint 20 minutes, les microvesicles et les exosomes étaient fortement concentrés sur les couches huit et neuf et enrichis cinq fois en fonction des intensités de fluorescence.

L’intégrité des microvesicles et exosomes enrichis dans la couche huit a été étudiée avec SEM. Beaucoup plus de particules non endommagées ont été observées après le processus d’enrichissement. La distribution de taille des microvésicules et exosomes enrichis a également été analysée.

Par la suite, la concentration réelle des microvésicules et des exosomes enrichis sur les zones de l’échantillon dans les couches six, huit et 10 a été analysée. Dans la couche huit, les microvesicles et les exosomes ont été pré-concentrés par un facteur de 5.58, mais aucune pré-concentration notable n’a été observée dans les autres couches. Pour assurer la reproductibilité de cette procédure, précisément suivi le protocole pour le temps d’incubation du four et la température pendant la vérification de l’appareil et le temps de fonctionnement de l’appareil parce que ce sont les conditions optimisées.

Le XO Pad peut également être utilisé pour séparer et isoler la vésicule extracellulaire d’échantillons riches en protéines, tels que le sérum ou le plasma, en utilisant un tampon carbonate. Ce protocole peut fournir un outil de préparation efficace et simple, avec ses capacités de pré-concentration et d’isolement requises pour la recherche clinique, telles que le diagnostic, l’administration de médicaments, l’immunothérapie et d’autres thérapeutiques.