Name: Un essai automatisé de coloration nucléaire différentielle pour la détermination précise de la cytotoxicité mitocan (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Apprenez un essai automatisé de coloration nucléaire différentielle pour évaluer la viabilité cellulaire indépendamment de la fonction mitochondriale. Cette méthode rapide et économique utilise Hoechst 33342 et l'iodure de propidium pour le criblage à haut débit.

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NVK, un chercheur du CPRIT en recherche sur le cancer, remercie le Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) pour son généreux soutien, la subvention du CPRIT RR150044. Ces travaux ont également été soutenus par la Subvention de recherche C-1930 de la Fondation Welch et par les National Institutes of Health R35 GM129294 attribués à NVK. Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.

1. Cytotoxicity Assay: Configuration
<ol><li>Préparer des solutions de composés d’intérêt aux concentrations désirées dans les médias appropriés (sans sérum ou 1, 2,5 ou 5 % FBS RPMI-1640).<ol>
<li>Pour mesurer la cytotoxicité d’un seul composé (p. ex., pour déterminer des doses efficaces), préparez des composés à une concentration finale de 2 x.</li>
		<li>Pour mesurer la cytotoxicité des combinaisons composées, préparer les composés à la concentration finale 4x.</li>
		<li>Préparez des commandes uniquement sur solvant en mélangeant la même quantité de solvant avec le milieu approprié. Par exemple, si les composés d’essai sont dissous dans le DMSO et le méthanol, faites un contrôle solvant uniquement pour chaque solvant.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recueillir les cellules du plat de culture ou du flacon dans un tube conique de 15 mL.</li>
	<li>Transférer 10 μL de suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugeuse et tacher avec 10 μL 0,4% de trypan bleu. Utilisez un hémocytomètre pour compter les cellules viables et non viables pour chaque source cellulaire.</li>
	<li>Cellules de granulés à 200 g pendant 5 min. Aspirer ou décanter supernatant.</li>
	<li>Resuspendez la pastille cellulaire dans un média approprié au test (sans sérum ou 1, 2,5, 5 % FBS RPMI-1640) à une densité cellulaire de 3*105 cellules/mL. NOTE 1 : La densité cellulaire de 3*105 cellules/mL fournit une densité d’ensemencement de 15 000 cellules/puits. La densité d’ensemencement est un paramètre important et devrait idéalement être prédéfinie avant l’expérience. La densité d’ensemencement devrait tenir compte de 1) la taille des cellules – habituellement de plus grandes cellules sont ensemencées à une densité inférieure; 2) durée du traitement – les cellules sont généralement ensemencées à une densité inférieure pour des expériences qui dureront plus longtemps; et 3) taux de division cellulaire – les cellules ayant un taux de division plus élevé sont ensemencées à une densité inférieure. Exemples spécifiques de densités d’ensemencement optimisées : cellules K562, plus grandes, durée de 24 h – 10 000 cellules/puits; Cellules MOLM-13, taille modérée, traitement à 24 h – 15 000/puits; Cellules MOLM-13, traitement à 48 h – 8 000/puits; petites cellules mononucléaires périphériques saines de sang (PBMCs), traitement de 24 h - 50.000/puits ; cellules primaires de la LAM, traitement à 24 h – 15 000 à 20 000/puits. NOTE 2 : La présence de FBS dans les médias peut affecter l’activité des composés. La réduction de la concentration de FBS peut rendre les résultats d’analyse plus simples à interpréter, mais il réduit également la précision physiologique.</li>
	<li>Graine 50 μL de suspension cellulaire de l’étape 1.5 dans chaque puits d’une plaque de 96 puits à l’aide d’une pipette multicanal.</li>
	<li>Ajoutez des composés comme suit :<ol>
<li>Pour les analyses composées simples, ajouter 50 μL de solution composée 2x dans chaque puits. Pour les puits de contrôle des solvants, ajouter 50 μL de supports d’essai contenant le solvant à la concentration de 2 x.</li>
		<li>Pour les analyses combinées, ajouter 25 μL de chacun des composés (solutions 4x) dans chaque puits. Pour les puits à commande composée unique, ajouter 25 μL de solution composée 4x et 25 μL de milieu d’essai. Pour les puits de contrôle des solvants, ajouter 50 μL de milieu d’essai ou de milieu d’essai contenant le solvant. NOTE 1 : La concentration finale de DMSO ne doit pas dépasser 0,5 %. NOTE 2 : Il est recommandé d’ajouter le média contenant les composés avec la pipette touchant le mur de chaque puits en raison du faible volume.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Appuyez doucement sur la plaque pour assurer le mélange du contenu des puits.</li>
	<li>Incuber les plaques à 37 °C dans une atmosphère humidifiée de CO2 à 5 % pendant un temps approprié, par exemple, 24 h.</li>
</ol>2. Cytotoxicity Assay: coloration avec Hoechst 33342 et propidium Iodide
<ol><li>Préparez la solution de coloration 10x. Cette solution doit être préparée fraîchement avant chaque expérience, elle ne peut pas être stockée. Les concentrations finales de colorant doivent être déterminées avant l’expérience.<ol>
<li>Pour les lignées de cellules leucémiques et les cellules leucémiques primaires, 1 mL de tampon de coloration de 10 x contient 10 μL de Hoechst 33342 mM et 50 μL d’iodure propidium de 1 mg/mL en PBS stérile (concentrations finales : Hoechst 33342 20 μM, PI 5 μg/mL).</li>
		<li>Pour les PBMCs sains, 1 mL de tampon de coloration de 10x contient 10 μL de 20 mM Hoechst 33342 et 10 μL de 1 mg/mL d’iodure de propidium en PBS stérile (concentrations finales : Hoechst 33342 20 μM, PI 1 μg/mL). REMARQUE : La concentration finale d’iodure de propidium doit être déterminée avant les expériences. Les cellules doivent être testées à l’aide d’une gamme de concentrations d’IP (1, 2,5, 5 μg/mL), puis la viabilité calculée par Hoechst/PI doit être comparée à la viabilité mesurée par le bleu trypan. Les concentrations d’IP énumérées ci-dessus ont été choisies en fonction de la viabilité des cellules cibles dans les puits de contrôle des médias (au-dessus de ~90 % pour les lignées de cellules leucémiques, au-dessus de ~70 % pour les PBMCs en bonne santé). AVERTISSEMENT : Hoechst 33342 et iodure de propidium sont des carcinogènes potentiels. Portez l’équipement de protection individuelle approprié lors de leur manipulation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Après l’incubation, utiliser une pipette multicanal pour ajouter 10 μL de tampon de coloration 10x à chaque puits. REMARQUE : Pour éviter la contamination croisée, assurez-vous que les pointes de pipette ne touchent pas le média.</li>
	<li>Appuyez doucement sur la plaque pour mélanger et dégager les bulles. Tache à 37 °C pendant 15 min.</li>
	<li>Centrifuger la plaque à 200 g pendant 4 min pour amener toutes les cellules au fond de la plaque. Essuyez soigneusement le fond de la plaque à l’aide d’un kimwipe humide pour enlever les fibres et/ou les débris qui interfèrent avec l’imagerie. NOTE 1 : La centrifugation de la plaque garantit les chances les plus élevées pour toutes les cellules d’être capturées dans l’image. Souvent, les cellules mortes se détachent et flottent, fournissant des valeurs trompeuses de cytotoxicité. La centrifugation atténue cet effet. NOTE 2 : La plaque doit être photographiée le plus rapidement possible après centrifugation, idéalement, dans les 15 minutes. Centrifugation peut réduire la sélectivité de la coloration pi et peut permettre aux cellules d’accumuler lentement iodure de propidium. L’amélioration de la précision obtenue en visualisant les cellules mortes l’emporte sur la légère augmentation de la coloration ip. Il est recommandé de terminer l’imagerie dans les 1 h de centrifugation.</li>
</ol>3. Cytotoxicity Assay: acquisition de données
<ol><li>Réglez le logiciel pour l’imageur automatisé microscope/plaque pour détecter la fluorescence pour hoechst 33342 (excitation maximale 350 nm, maximum d’émission 461 nm) et PI (excitation maximale 493 nm, maximum d’émission 636 nm). Acquérir des images pour chaque puits dans les deux canaux.</li>
	<li>En utilisant le logiciel (comme CellProfiler, un studio d’analyse d’image gratuit basé sur MatLab http://cellprofiler.org/, ImageJ, ou des logiciels propriétaires tels que Gen5) compter les cellules dans chaque puits dans chaque canal. REMARQUE : Puisque chaque cellule doit être tachée de Hoechst 33342, et que les cellules mortes doivent être tachées d’IP, le rapport entre les morts et tous représente la fraction des cellules mortes. Par exemple, si le nombre automatisé dans l’échantillon non traité montre 467 cellules tachées de PI (cellules mortes) et 2335 cellules tachées de Hoechst 33342 (cellules totales), la fraction morte est de 0,2 ou 20%. Cette valeur est ensuite comparée à un échantillon manipulé à l’identique où le traitement a été utilisé.</li>
	<li>Description détaillée de l’acquisition de données Hoechst/PI à l’aide du logiciel Cytation5 Cell Imaging Multi-Mode Reader et du logiciel Gen5 v. 3.00 :<ol>
<li>Réglez le lecteur/imageur de plaque multimode Cytation5 sur des cellules d’image dans des plaques en plastique noir génériques à fond plat, de 96 puits.</li>
		<li>Définissez un protocole d’imagerie pour utiliser les ensembles de filtres DAPI et Texas Red standard. Prenez des images au centre du puits à l’aide d’un objectif de grossissement 4x. N’utilisez aucun décalage (X/Y ou Z). Utilisez les paramètres d’imagerie suivants : DAPI – LED - 10, temps d’intégration - 99, gain - 0; Texas Red - LED - 8, temps d’intégration - 950, gain - 18. Effectuer un autofocus à l’aide du signal DAPI; il ne devrait pas y avoir de compensation dans la focalisation entre les canaux.</li>
		<li>Effectuez l’analyse d’image à l’aide du logiciel Gen5 v 3.00. Dans les paramètres logiciels, définissez les cellules comme des formes comprises entre 5 et 25 μm dans leur taille. Exclure les objets à bord primaire et diviser les objets touchants en tournant l’option spéciale « Split toucher les objets ».  Ensuite, traiter l’image pour supprimer l’arrière-plan (soustraction de fond sombre), appliquer un masque nucléaire (valeur seuil DAPI &gt;= 6000 AU), et compter les objets. Effectuez une analyse de sous-population basée sur la coloration PI (valeur seuil Texas Red &gt;= 5000 UA), et comptez les objets. La viabilité cellulaire % est définie comme (1 - <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61295/61295eq1.jpg"> .</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Lema, C., Varela-Ramirez, A., Aguilera, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+nuclear+staining+assay+for+high-throughput+screening+to+identify+cytotoxic+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Differential nuclear staining assay for high-throughput screening to identify cytotoxic compounds.</a> Current Cellular Biochemistry. 1 (1), 1-14 (2011).</li>
<li>Döhner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+management+of+acute+myeloid+leukemia+in+adults%3A+recommendations+from+an+international+expert+panel%2C+on+behalf+of+the+European+LeukemiaNet%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and management of acute myeloid leukemia in adults: recommendations from an international expert panel, on behalf of the European LeukemiaNet.</a> Blood. 115 (3), 453-474 (2010).</li>
<li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+Investigations+of+the+Mitochondrial+Complex+I+Inhibitor+Rotenone+in+the+Context+of+Pharmacological+and+Safety+Evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Mechanistic Investigations of the Mitochondrial Complex I Inhibitor Rotenone in the Context of Pharmacological and Safety Evaluation.</a> Scientific Reports. 7, 45465(2017).</li>
<li>Fan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Energy+Metabolism+and+Potential+of+3-Bromopyruvate+as+an+Inhibitor+of+Aerobic+Glycolysis%3A+Implications+in+Tumor+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Tumor Energy Metabolism and Potential of 3-Bromopyruvate as an Inhibitor of Aerobic Glycolysis: Implications in Tumor Treatment.</a> Cancers (Basel). 11 (3), (2019).</li>
<li>Pal, R., Mamidi, M. K., Das, A. K., Bhonde, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+effects+of+dimethyl+sulfoxide+%28DMSO%29+on+the+differentiation+potential+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Diverse effects of dimethyl sulfoxide (DMSO) on the differentiation potential of human embryonic stem cells.</a> Archives of Toxicology. 86 (4), 651-661 (2012).</li>
<li>Tunçer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+dose+dimethyl+sulfoxide+driven+gross+molecular+changes+have+the+potential+to+interfere+with+various+cellular+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Low dose dimethyl sulfoxide driven gross molecular changes have the potential to interfere with various cellular processes.</a> Scientific Reports. 8 (1), 14828(2018).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Bien que le protocole d’analyse de cytotoxicité Hoechst/PI soit robuste et nécessite relativement peu de temps pratique, plusieurs détails expérimentaux sont très importants pour assurer des résultats précis. Premièrement, il est essentiel de s’assurer que la concentration de DMSO reste inférieure à 0,5 % (v/v). Il est généralement admis que l’exposition à des doses même faibles de DMSO peut modifier considérablement la morphologie et l’attachement des cellules et retarder considérablement la progression du cycle<sup cla...

La première étape pour identifier des traitements efficaces contre le cancer est la sélection d’un essai robuste et impartial de cytotoxicité qui peut être utilisé pour examiner l’effet du traitement. Un choix commun pour les expériences à faible débit est l’exclusion du colorant bleu trypan des cellules vivantes. Cette méthode est favorisée parce qu’elle permet une méthode relativement impartiale pour quantifier la survie cellulaire. trypan bleu diffuse passivement dans les cellules dont les membranes sont compromises, mais il est effectivement bloqué d’entrer dans les cellules saines1. Le quotient des cellules vivantes et des cellules totales représente la viabilité en pourcentage, ce qui indique l’efficacité du traitement. L’inconvénient le plus important de l’essai bleu trypan est qu’il est mal adapté pour les méthodologies à haut débit. Il a un rapport signal-bruit relativement faible et une coloration prolongée peut entraîner des artefacts en raison de la coloration de cellules viables. Par conséquent, trypan exclusion bleue est généralement, mais pas toujours2, relégué au comptage manuel. Cela le rend trop lent et introduit la forte possibilité de partialité due au jugement subjectif du chercheur (à moins que des dénombrements aveuglants ou indépendants ne soient utilisés, ce qui réduit encore le débit du laboratoire). En général, le débit de cet essai est insuffisant pour la découverte moderne de médicaments.
Les analyses de viabilité, qui ont généralement un débit beaucoup plus élevé, permettent aux chercheurs de contourner cette limitation, mais viennent avec des mises en garde importantes (voir le tableau 1). Ces méthodes se regroupent généralement en deux groupes. Un groupe est composé d’analyses colorimétriques qui sont basées sur la fonction des enzymes redox cellulaires. Les substrats incolores ou non fluorescents sont convertis en produits vibrants qui peuvent être quantifiés à l’aide d’un spectrophotomètre. Les sels de tétrazolium (MTT, WST-1, XTT, etc.) et la resazurine en sont des exemples classiques. Cette catégorie comprend également des analyses luminescentes qui utilisent la luciferine pour évaluer le niveau ATP. Les analyses de ce type ont la limitation sous-jacente qu’ils mesurent le métabolisme cellulaire, qui n’est pas la viabilité cellulaire en soi. Il est assez fréquent pour les cellules de devenir quiescent dans des conditions défavorables, mais conservent encore la capacité dediviser 3,4,5. Par exemple, les cellules souches cancéreuses sont souvent relativement métaboliquement quiescent6,7,8,9, et sont susceptibles d’être difficiles à faire des analyses en utilisant ces techniques. L’efficacité des traitements qui endommagent la fonction mitochondriale, comme la plupart des mitocans, est également susceptible d’être surestimée de manière significative.
Une méthodologie alternative tire parti des propriétés chimiques de diverses substances qui leur permettent de traverser ou non des membranes biologiques croisées. Un exemple sont les taches nucléaires telles que SYTOX ou propidium iodure (PI). Cette catégorie comprend également des analyses de concept similaires mais de fonction différente, comme l’essai de déshydrogénase lactate (LDH), qui mesure la libération de LDH dans le milieu extracellulaire comme indicateur de nécrose cellulaire (figure 1, tableau 1). Ces analyses sont plus capables de faire la distinction entre les cellules métaboliquement inactives et les cellules mortes.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Analyse/colorant</td>
			<td>Type (s) de mort cellulaire détecté</td>
			<td>Équipement nécessaire</td>
			<td>Caractéristiques clés</td>
		</tr>
<tr>
<td>MTT, CKK-8, Alamar Blue (resazurin)</td>
			<td>Apoptose/Nécrose</td>
			<td>Spectrophotomètre</td>
			<td>Peu coûteux, rapide; analyse du point de terminaison; dépend de l’activité des enzymes (exclusivement mitochondriale en cas de MTT) et ne fait pas de distinction entre les modes de mort cellulaire1,10
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Libération de la LDH</td>
			<td>Nécrose</td>
			<td>Spectrophotomètre</td>
			<td>Rapide, indépendant de l’activité des enzymes mitochondriques; coûteux pour les tests à haut débit; détecte les cellules nécrotiques avec membrane plasmatique compromisée11,12
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Trypan Blue (TB)</td>
			<td>Apoptose/Nécrose</td>
			<td>Microscope</td>
			<td>Imperméant cellulaire; ne fait pas de distinction entre les modes de mort cellulaire; laborieux et ne convient pas au criblage à haut débit; plus difficile à utiliser avec les cellules adhérentes; sujettes au jugement subjectif de l’utilisateur, mais est considéré comme la méthode standard de mesure de la viabilité cellulaire13
</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Orange acridine (AO)</td>
			<td>Apoptose/Nécrose/</td>
			<td rowspan="2">Microscope à fluorescence</td>
			<td rowspan="2">Un colorant d’acide nucléique avec des propriétés spectrales uniques, peut distinguer entre l’apoptose et la nécrose/nécroptose14
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nécroptose</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hoechst 33342, DAPI</td>
			<td>Apoptose</td>
			<td>Microscope à fluorescence ou cytomètre d’écoulement</td>
			<td>Perméable aux cellules; inappropriée à elle seule pour surveiller la mort cellulaire; utile pour la co-coloration; peut être utilisé pour évaluer la condensation de chromatine et la fragmentation des noyaux dans l’apoptose précoce; peut être jumelé avec de l’iodure de propidium pour distinguer l’apoptose de lanécrose 15,16
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Propidium Iodide (IP)</td>
			<td>Apoptose/nécrose tardive</td>
			<td>Microscope à fluorescence ou cytomètre d’écoulement</td>
			<td>Intercalateur de cellule-imperméant ; détecte à la fois l’apoptose tardive et les modes de nécrose de la mortcellulaire 17. Toxique et perméable après de longues périodes d’incubation18
</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1. Liste des analyses de cytotoxicité. Les analyses de cytotoxicité, dont certaines ont été utilisées dans cette étude, énumérées avec la brève description de leurs caractéristiques clés.
Des études récentes ont démontré que le métabolisme mitochondrial est modifié dans certains cancers19,20,21,22,23,24,25. Par exemple, il a été démontré que les leucémies myéloïdes aiguës (LAM) reréglementent leur masse mitochondriale, leur teneur en MTDNA et leur respiration mitochondriale pour répondre à leursbesoins énergétiques 19,26,27. D’autre part, quelques tumeurs pleines sont caractérisées par le dysfonctionnement mitochondrique, ou plutôt la « reprogrammation métabolique », telle que la downregulation des protéines mitochondriques impliquées dans OXPHOS ou la teneur diminuée de mtDNA, qui a été associée à l’invasiveness de tumeur, au potentiel métastatique et à la résistance aux drogues apoptose-induisant28,29. En outre, récemment, il y a eu un intérêt accru en utilisant les composés mécanistes divers qui affectent la fonction mitochondrique (généralement appelée mitocans30),comme thérapies potentielles pour des cancers particuliers. Ces médicaments ciblent la synthèse ATP, l’ADN mitochondrial, oxphos, et la production de ROS, aussi bien que les protéines pro-apoptotiques et anti-apoptotiques liées aux mitochondries30,31. Plusieurs études ont montré que cette approche a une promessesignificative 19,32,33,34. Cependant, ces déviations métaboliques dans la biologie de cellules cancéreuses ou les traitements de mitochondries-ciblage peuvent affecter de manière significative des analyses conventionnelles de viabilité qui sont basées sur la fonctionnalité mitochondrique.
Ici, un protocole optimisé pour un essai différentiel de coloration nucléaire est décrit. Le protocole permet une détermination rapide et précise de la cytotoxicité des mitocans ou de leurs combinaisons avec d’autres composés. Hoechst 33342 est un colorant nucléaire perméant pour les cellules qui traverse facilement les membranes cellulaires pour tacher l’ADN, ce qui permet d’obtenir le nombre total de cellules. En co-souillant avec pi, qui n’entre que dans les noyaux des cellules mortes, la proportion de cellules vivantes (Hoechst seulement) et mortes (tachées avec les deux) cellules peut être déterminée avec précision. Ce protocole affine l’analysepubliée 35 en ajoutant une étape pour l’optimisation de la concentration de colorant (en recoupant les résultats avec la méthode orthogonale trypan bleu) et centrifugation de la plaque avant l’imagerie. Étant donné que de nombreuses lignées cellulaires sont semi-adhérentes ou suspendues, la centrifugation augmente la proportion de cellules qui sont photographiées et améliore fortement la précision. L’essai a plusieurs avantages, y compris que la coloration ne nécessite pas l’enlèvement des médias ou le lavage. Le mélange de colorant est également peu coûteux, facile à préparer et compatible avec les systèmes de pipetage multicanaux/robotiques.
Une fois que les cellules ont été tachées, elles sont photographiées à l’aide d’un microscope automatisé. Cela a l’avantage supplémentaire de créer un enregistrement permanent des images qui peuvent être ré-analysées plus tard et les effets de composés particuliers peuvent être réévalués par inspection visuelle des images capturées. Une fois que les images ont été obtenues, les cellules peuvent être comptées manuellement ou en utilisant l’un ou l’autre de plusieurs proxèmes logiciels, y compris les logiciels gratuits (p. ex., ImageJ, CellProfiler, etc.) et les logiciels commerciaux (p. ex., Metamorph, Gen5, etc.). Le comptage automatisé des cellules est généralement préférable puisque les pipelines automatisés de comptage cellulaire correctement développés sont plus précis et moins biaisés que les comptages manuels. Ils ignorent également plus efficacement les débris cellulaires ou les complexes insolubles. Le développement de ces pipelines est généralement simple et simplifié par l’efficacité des taches utilisées. La sortie est quantitative puisque le nombre réel de cellules mortes est automatiquement calculé en fonction du nombre total de cellules, et différents seuils peuvent être appliqués pour augmenter ou diminuer la rigueur de la détection35. Pour plus de commodité, des paramètres optimisés pour compter les cellules utilisant gen5 v. 3.00 logiciel compatible Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader sont inclus.

<table><tbody><tr><td>2-Deoxy-D-glucose/2-DG</td><td>Chem-Impex</td><td>50-519-067</td><td></td></tr><tr><td>3-bromo-pyruvate</td><td>Alfa Aesar</td><td>1113-59-3</td><td></td></tr><tr><td>Plaques à 96 puits</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655090</td><td>Plaques à fond plat noir ou transparent à 96 puits </td></tr><tr><td>Réactif de viabilité cellulaire HS bleu Alamar (100mL)&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher</td><td>A50101</td><td></td></tr><tr><td>Compteur de cellules automatisé Countess II</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher</td><td>62249</td><td>Solution de 20 mM ; concentration finale 1:1 000 </td></tr><tr><td>HyClone sérum fœtal bovin</td><td>GE Healthcare</td><td>#25-514</td><td></td></tr><tr><td>m-chlorophénylhydrazone/CCCP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2759</td><td></td></tr><tr><td>Comprimés</td><td>PBS Thermo Fisher</td><td>BP2944100</td><td>1 comprimé + 200 mL d’eau stérile = 1x solution PBS </td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine-Glutamine (100X)</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Kit de dosage LDH</td><td>Thermo Fisher</td><td>50-103-5952</td><td></td></tr><tr><td>Iodure de propidium</td><td>Thermo Fisher</td><td>50-596-072</td><td>Poudre sèche ; matière 1 mg/mL dans PBS ; concentration finale 5 & micro ; g/mL (cellules leucémiques), 1 & micro ; g/mL (PBMCs normaux) </td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Ark Pharm</td><td>AK115691</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium Avec L-glutamine et bicarbonate de sodium, liquide, filtré stérilement, adapté à la culture cellulaire</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8758-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Bromure de tétrazolium de thiazolyle</td><td>ACROS Organics</td><td>AC158990010</td><td></td></tr><tr><td>Coloration bleue de trypan (0,4 %)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Lignées cellulaires</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>K562</td><td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td>CML Lignée cellulaire </td></tr><tr><td>MOLM-13</td><td>ATCC</td><td></td><td>AML </td></tr><tr><td>MOLT-4</td><td>ATCC</td><td>CRL-1582</td><td>Lignée cellulaire ALL </td></tr><tr><td>OCI-AML2</td><td>ATCC</td><td></td><td>AML </td></tr></tbody></table>

un essai automatisé de coloration nucléaire différentielle pour la détermination précise de la cytotoxicité mitocan

An Automated Differential Nuclear Staining Assay for Accurate Determination of Mitocan Cytotoxicity

La contribution des mitochondries à la transformation oncogène fait l’objet d’un grand intérêt et d’une étude active. Comme le domaine du métabolisme du cancer devient plus complexe, l’objectif de cibler les mitochondries à l’aide de divers composés qui infligent des dommages mitochondriaux (soi-disant mitocans) devient très populaire. Malheureusement, de nombreux tests de cytotoxicité existants, tels que ceux à base de sels de tétrazolium ou de résazurine nécessitent des enzymes mitochondriques fonctionnelles pour leur performance. Les dommages infligés par les composés qui ciblent les mitochondries compromettent souvent l’exactitude de ces analyses. Ici, nous décrivons un protocole modifié basé sur la coloration différentielle avec deux colorants fluorescents, dont l’un est perméant de cellules (Hoechst 33342) et l’autre n’est pas (iodure de propidium). La différence dans la coloration permet de discriminer les cellules vivantes et mortes. L’analyse est appropriée à la microscopie automatisée et à l’analyse d’image, qui augmente le débit et réduit le biais. Cela permet également d’utiliser l’essai de façon à haut débit à l’aide de plaques de 96 puits, ce qui en fait une option viable pour les efforts de découverte de médicaments, en particulier lorsque les médicaments en question ont un certain niveau de mitotoxicité. Fait important, les résultats obtenus par Hoechst/PI colorant l’analyse montrent une cohérence accrue, à la fois avec des résultats d’exclusion bleu trypan et entre les répliques biologiques lorsque l’essai est comparé à d’autres méthodes.

Le protocole susmentionné a été développé à l’aide de cellules OCI-AML2, qui ont été prises comme une lignée de cellules myéloïdes myéloïdes aiguës représentatives. La LAM se caractérise par une prolifération anormale de cellules hématopoïétiques indifférenciées et non fonctionnelles dans la moelleosseuse 26. Malgré les développements récents de la thérapie ciblée contre la LAM, la norme de soins est demeurée inchangée pendant plusieurs décennies et consiste en une thérapie par induction (générale...

Le protocole décrit un essai rapide, à haut débit, fiable, peu coûteux et impartial pour déterminer efficacement la viabilité cellulaire. Cet essai est particulièrement utile lorsque les mitochondries des cellules ont été endommagées, ce qui interfère avec d’autres analyses. L’essai utilise le comptage automatisé des cellules tachées de deux teintures nucléaires – Hoechst 33342 et iodure de propidium.

Un essai automatisé de coloration nucléaire différentielle pour la détermination précise de la cytotoxicité mitocan

The contribution of mitochondria to oncogenic transformation is a subject of wide interest and active study. As the field of cancer metabolism becomes ...

Cette méthode permettra aux chercheurs d’évaluer la viabilité cellulaire indépendamment de la fonction mitochondriale. Et il est possible d’obtenir des efforts de dépistage de drogues à haut débit. Cette technique est rapide, précise, peu coûteuse, et permet la détermination des composés cytotoxicité, y compris ceux qui altèrent la fonction mitochondrique dans la plupart des types de cellules.Ce protocole est facile à exécuter. Il est important de prêter attention à la préparation des médicaments, aux conditions de traitement et à la densité cellulaire afin d’assurer l’exactitude et la validité expérimentales. La démonstration visuelle de cette méthode est importante parce que les étapes d’acquisition d’image et d’analyse d’image peuvent être difficiles à récapituler, en particulier pour les chercheurs ayant peu d’expérience avec Gen5 Software.Commencez par préparer des solutions des composés d’intérêt à la concentration désirée. Assurez-vous toujours de mélanger les composés en vortexant soigneusement. Pour mesurer la cytotoxicité d’un seul composé, préparer les composés à une concentration finale de 2 X.Si vous mesurez la cytotoxicité des combinaisons composées, préparez-les à une concentration finale 4X. Préparez les commandes de solvant seulement en mélangeant la même quantité de solvant avec le milieu approprié. Recueillir les cellules dans un tube conique de 15 millilitres et aliquot 10 microlitres de la suspension cellulaire.Pour la coloration bleue trypan, ajouter 10 microlitres de 0,4% de bleu trypan à l’aliquot et utiliser un hémocytomètre ou un compteur cellulaire pour compter les cellules viables et non viables. Les cellules de granulés dans le tube de 15 millilitres à 200 fois G pendant cinq minutes, puis aspirer ou décamper le supernatant. Nous suspendons la pastille cellulaire dans l’essai des médias appropriés à une densité cellulaire de trois fois 10 à la cinquième cellule par millilitre.Utilisez une pipette multicanal pour ensemencer 50 microlitres de suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque de puits de 96. Pour les analyses composées simples, ajouter 50 microlitres de solution composée 2X dans chaque puits. Pour les puits de contrôle des solvants, ajouter 15 microlitres de supports d’essai contenant le solvant à concentration de 2 X.Pour les analyses combinées ajouter 25 microlitres de chacun des composés 4X dans chaque puits. Pour les puits de contrôle composés simples, ajouter 25 microlitres chacun de solution composée 4X et milieu d’essai. Assurez-vous que la concentration finale de DMSO ne dépasse pas 0,5 % Pour assurer la reproductibilité, ajoutez des médicaments avec les pointes de pipette touchant le côté des puits.Prendre soin d’ajouter les médicaments à différents endroits. Ces coups de couteau doivent être effectués très rapidement, de préférence en ne prenant pas plus de 30 minutes par plaque. Appuyez doucement sur la plaque pour mélanger le contenu des puits et l’incuber à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.Lorsqu’ils sont prêts à tacher les cellules avec Hoechst 33342 et propidium iodure préparer fraîche solution de coloration 10X et ajouter 10 microlitres à chaque puits. Appuyez doucement sur la plaque et incubez-la à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Centrifuger la plaque à 200 fois G pendant quatre minutes pour amener toutes les cellules au fond de la plaque.Essuyez ensuite soigneusement le fond de la plaque à l’aide d’un lingette humide de laboratoire pour enlever les débris qui pourraient interférer avec l’imagerie. Imagez la plaque dans les 15 minutes suivant la centrifugation. Ouvrez gen5 Software et créez un nouveau protocole standard, cliquez sur Procédure et choisissez le type de plaques à utiliser.Habituellement, 96 plaques de plastique bien noir. Ensuite, définissez la méthode de lecture à l’image, cliquez sur Ok, et choisissez DAPI et Texas Red Filter ensembles avec un objectif de grossissement 4X. Aucun décalage n’est nécessaire, puisque les centres de puits seront photographiés.Pour le filtre DAPI, réglez la LED à 10, le temps d’intégration à 99, et gagnez à zéro. Pour Texas Red, réglez la LED à huit, le temps d’intégration à 950, et le gain à 18. Cliquez sur Options pour vous assurer que l’accent automatique est effectué sur le canal DAPI et il n’y a pas de décalage dans la focalisation entre les canaux.Enregistrez le protocole en cliquant sur Okay. Maintenant, les images peuvent être enregistrées à l’aide du bouton Lire nouveau. Une fois les images enregistrées, cliquez sur Réduction de données et choisissez le prétraitement de l’image.Appliquez le prétraitement d’image avec la soustraction foncée de fond utilisant la taille d’aplatissement automatique basée sur le signal de DAPI. Pour Texas Red, utilisez les mêmes options que pour Channel 1. Une fois terminé, cliquez sur Ok.Ensuite, allez au panneau d’analyse cellulaire et appliquez un masque nucléaire basé sur le signal DAPI transformé d’une valeur seuil de 6 000 unités, une taille minimale d’objet de cinq micromètres et une taille maximale d’objet de 25 micromètres. Analyser l’image entière, exclure les objets de bord primaire à la limite de l’image et diviser les objets touchants. Dans les options avancées de détection, réglez le diamètre de la boule roulante sous forme de 30 micromètres et évaluez l’arrière-plan en fonction de 5 % des pixels les plus bas.Ne gardez le nombre de cellules que dans les mesures calculées. Après ça, effectuez une analyse de sous-population basée sur le signal rouge du Texas transformé moyen avec une valeur seuil de 5000 unités pour compter les cellules mortes. Enfin, accédez au nombre de cellules qui en résulte.Des images représentatives de cellules tachées de Hoechst, d’iodure de propidium sont montrées ici. Le nombre total de cellules est raisonnablement élevé et supérieur au nombre de cellules mortes. Quand un panneau des essais de cytotoxicité a été comparé à l’exclusion bleue de trypan, il a été constaté que MTT et les essais bleus d’Alamar ont inexactement mesuré la viabilité cellulaire.Ces analyses mitochondriques à base d’enzymes ont montré une viabilité significativement plus faible par rapport à l’exclusion bleue trypan. La double coloration avec Hoechst 33342 et PI a eu la meilleure combinaison de robustesse, de sensibilité, et de cohérence avec la coloration bleue de trypan et la plus petite déviation médiane de la méthode bleue d’exclusion de trypan après traitement de CCP ou de 2-DG. L’essai hoechst PI a également été efficace pour déterminer la viabilité cellulaire après le traitement avec les mitochondries ciblant les molécules Rotenone et trois bromopyruvate.Il a été validé par un panel de lignées de cellules leucémiques. Ces cellules ont varié dans la sensibilité de Rotenone s’étendant de très sensible aux cellules de résistance. Une mauvaise exécution de l’essai peut compromettre son exactitude.Plusieurs résultats compromis sont montrés ici. La surstaining avec PI, négligeant l’étape de centrifugation, ou surexposition dans le canal de Hoechst, causera des résultats sous-optimaux. Lors du chronométrage de ce protocole, n’oubliez pas d’optimiser la concentration de colorant et le temps de coloration pour chaque lignée cellulaire.En outre, centrification pour une plaque d’échantillon, est nécessaire pour assurer la qualité de l’imagerie. Après identification des composés de l’effet de cytotoxicité sur les cellules cancéreuses, les chercheurs peuvent procéder à des études mécanistes pour identifier leurs cibles pertinentes. Le criblage des bibliothèques de petites molécules avec cette technique en parallèle aux analyses conventionnelles de MTT, permettra d’identifier rapidement les molécules qui ciblent la fonction mitochondrique.

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Recherche sur le cancer

Cette vidéo présente une méthode de coloration nucléaire pour détecter l’effet cytotoxique du mitocan sur les cellules cancéreuses sensibles aux médicaments et les variantes saines. La double coloration avec des colorants liant l’ADN tels que l’iodure de propidium et le colorant Hoechst permet de distinguer clairement les cellules mortes des cellules vivantes, aidant ainsi à évaluer la cytotoxicité du médicament.

Dosage différentiel de coloration nucléaire : un dosage pour déterminer la cytotoxicité du mitocan par l’iodure de propidium et la double coloration de Hoechst

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La bioénergie des lymphocytes T CD8 peut être interrogée à l’aide du test de stress Mito. Cette méthodologie peut être utilisée pour étudier la programmation métabolique aiguë et chronique. Ce protocole décrit des approches pour examiner les relations entre la biologie des récepteurs des lymphocytes T et l’analyse bioénergétique.

Mesure de la fonction mitochondriale des lymphocytes T CD8 naïfs et effecteurs

Ici, nous décrivons une méthode de création de gouttelettes à double émulsion encapsulant un lymphocyte T et une cellule cible cancéreuse afin d’examiner la destruction cellulaire au niveau de la cellule unique. Cette méthode permet une double quantification des molécules cytotoxiques et de l’apoptose des cellules cibles au sein d’une large population de lymphocytes T.

Essai de cytotoxicité basé sur des gouttelettes pour évaluer les lymphocytes T à récepteur de l’antigène chimérique au niveau de la cellule unique

Apprenez un essai automatisé de coloration nucléaire différentielle pour évaluer la viabilité cellulaire indépendamment de la fonction mitochondriale. Cette méthode rapide et économique utilise Hoechst 33342 et l'iodure de propidium pour le criblage à haut débit.

Un essai automatisé de coloration nucléaire différentielle pour la détermination précise de la cytotoxicité mitocan

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