Name: Imagerie Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos Imaging Intra (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Découvrez la microinjection d'actine rhodaminée dans des embryons de Drosophila pour étudier l'assemblage des bâtonnets d'actine intranucléaires sous stress thermique. Cette méthode permet d'explorer la réponse au stress actinique en biologie cellulaire.

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Les auteurs reconnaissent avec gratitude le travail de Liuliu Zheng et Zenghui Xue, qui ont contribué au pionnier de cette technique dans le laboratoire Sokac, ainsi que Hasan Seede qui a aidé à l’analyse. Les travaux de cette étude sont financés par une subvention des NIH (R01 GM115111).

<ol><li>Figard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin-mediated+Actin+Stress+Response+is+maladaptive+in+heat-stressed+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cofilin-mediated Actin Stress Response is maladaptive in heat-stressed embryos.</a> Cell Reports. 26 (49), 3493-3501 (2019).</li>
<li>Ashworth, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADF%2Fcofilin+mediates+actin+cytoskeletal+alterations+in+LLC-PK+cells+during+ATP+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">ADF/cofilin mediates actin cytoskeletal alterations in LLC-PK cells during ATP depletion.</a> American Journal of Physiology Renal Physiology. 284 (4), 852-862 (2003).</li>
<li>Vandebrouck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+analysis+of+rod+composition+and+actin+dynamics+in+inherited+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuropathology+and+Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">In vitro analysis of rod composition and actin dynamics in inherited myopathies.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 69 (5), 429-441 (2010).</li>
<li>Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+stimuli+induce+persistent+ADF%2Fcofilin-actin+rods+that+disrupt+distal+neurite+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function.</a> Nature Cell Biology. 2 (9), 628-636 (2000).</li>
<li>Bamburg, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADF%2FCofilin-actin+rods+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Alzheimer+Research%22%5BJournal%5D)">ADF/Cofilin-actin rods in neurodegenerative diseases.</a> Current Alzheimer Research. 7 (3), 241-250 (2010).</li>
<li>Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+dynamics+and+cofilin-actin+rods+in+alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Actin dynamics and cofilin-actin rods in alzheimer disease.</a> Cytoskeleton. 73 (9), 477-497 (2016).</li>
<li>Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+actin-ADF%2Fcofilin+rods+transiently+retards+decline+of+mitochondrial+potential+and+ATP+in+stressed+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22AJP%3A+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons.</a> AJP: Cell Physiology. 291 (5), 828-839 (2006).</li>
<li>Munsie, L. N., Desmond, C. R., Truant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin+nuclear-cytoplasmic+shuttling+affects+cofilin-actin+rod+formation+during+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Cofilin nuclear-cytoplasmic shuttling affects cofilin-actin rod formation during stress.</a> Journal of Cell Science. 125 (17), 3977-3988 (2012).</li>
<li>Iida, K., Iida, H., Yahara, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+induction+of+intranuclear+actin+rods+in+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Heat shock induction of intranuclear actin rods in cultured mammalian cells.</a> Experimental Cell Research. 165, 207-215 (1986).</li>
<li>Ohta, Y., Nishida, E., Sakai, H., Miyamoto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dephosphorylation+of+cofilin+accompanies+heat+shock-induced+nuclear+accumulation+of+cofilin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Dephosphorylation of cofilin accompanies heat shock-induced nuclear accumulation of cofilin.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16143-16148 (1989).</li>
<li>Iida, K., Matsumoto, S., Yahara, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+KKRKK+sequence+is+involved+in+heat+shock-induced+nuclear+translocation+of+the+18-kDa+actin-binding+protein%2C+cofilin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Structure+and+Function%22%5BJournal%5D)">The KKRKK sequence is involved in heat shock-induced nuclear translocation of the 18-kDa actin-binding protein, cofilin.</a> Cell Structure and Function. 17 (1), 39-46 (1992).</li>
<li>Minamide, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+cytoplasmic+cofilin-actin+rods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of cytoplasmic cofilin-actin rods.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (8), 5450-5460 (2010).</li>
<li>Masurovsky, E. B., Benitez, H. H., Kim, S. U., Murray, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin%2C+development%2C+and+nature+of+intranuclear+rodlets+and+associated+bodies+in+chicken+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Origin, development, and nature of intranuclear rodlets and associated bodies in chicken sympathetic neurons.</a> The Journal of Cell Biology. 44 (7), 172-191 (1970).</li>
<li>Feldman, M. L., Peters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranuclear+rods+and+sheets+in+rat+cochlear+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurocytology%22%5BJournal%5D)">Intranuclear rods and sheets in rat cochlear nucleus.</a> Journal of Neurocytology. 1 (2), 109-127 (1972).</li>
<li>Nishida, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin+is+a+component+of+intranuclear+and+cytoplasmic+actin+rods+induced+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cofilin is a component of intranuclear and cytoplasmic actin rods induced in cultured cells.</a> Cell Biology. 84 (8), 5262-5266 (1987).</li>
<li>Ono, S., Abe, H., Nagaoka, R., Obinata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+of+ADF+and+cofilin+in+intranuclear+actin+rods+of+cultured+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Muscle+Research+and+Cell+Motility%22%5BJournal%5D)">Colocalization of ADF and cofilin in intranuclear actin rods of cultured muscle cells.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (2), 195-204 (1993).</li>
<li>Xue, Z., Sokac, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Back-to-back+mechanisms+drive+actomyosin+ring+closure+during+Drosophila+embryo+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Back-to-back mechanisms drive actomyosin ring closure during Drosophila embryo cleavage.</a> The Journal of Cell Biology. 215 (3), 335-344 (2016).</li>
<li>Cao, J., Albertson, R., Riggs, B., Field, C. M., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuf%2C+a+Rab11+effector%2C+maintains+cytokinetic+furrow+integrity+by+promoting+local+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nuf, a Rab11 effector, maintains cytokinetic furrow integrity by promoting local actin polymerization.</a> Journal of Cell Biology. 182 (2), 301-313 (2008).</li>
<li>Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pros+and+cons+of+common+actin+labeling+tools+for+visualizing+actin+dynamics+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis.</a> Developmental Biology. 393 (2), 209-226 (2014).</li>
<li>Chen, Q., Nag, S., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formins+filter+modified+actin+subunits+during+processive+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Formins filter modified actin subunits during processive elongation.</a> Journal of Structural Biology. 177 (1), 32-39 (2012).</li>
<li>Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+interference+by+dsRNA+injection+into+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), 2477(2011).</li>
<li>Juarez, M. T., Patterson, R. A., Li, W., McGinnis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+wound+assay+and+in+vivo+localization+of+epidermal+wound+response+reporters+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microinjection wound assay and in vivo localization of epidermal wound response reporters in Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. 81, 50750(2013).</li>
<li>Carreira-Rosario, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombineering+homologous+recombination+constructs+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Recombineering homologous recombination constructs in Drosophila.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), 50346(2013).</li>
<li>Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+techniques+for+studying+mitosis+in+the+Drosophila+melanogaster+syncytial+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microinjection techniques for studying mitosis in the Drosophila melanogaster syncytial embryo.</a> Journal of Visualized Experiments. (31), 1382(2009).</li>
<li>Catrina, I. E., Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+and+tracking+endogenous+mRNAs+in+live+Drosophila+melanogaster+egg+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Visualizing and tracking endogenous mRNAs in live Drosophila melanogaster egg chambers.</a> Journal of Visualized Experiments. (148), 58545(2019).</li>
<li>Wessel, A. D., Gumalla, M., Grosshans, J., Schmidt, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanical+properties+of+early+Drosophila+embryos+measured+by+high-speed+video+microrheology%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The mechanical properties of early Drosophila embryos measured by high-speed video microrheology.</a> Biophysical Journal. 108 (8), 1899-1907 (2015).</li>
<li>Mollinari, C., González, Microinjection and transgenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMollinari%2C+C+%22Microinjection+and+Transgenesis%3A+Strategies+and+Protocols%22">Microinjection and Transgenesis: Strategies and Protocols</a>. Cid-Arregui, A., García-Carrancá, A. , Springer. Berlin. 587-603 (1998).</li>
<li>Figard, L., Sokac, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cell+shape+change+in+living+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Imaging cell shape change in living Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), 2503(2011).</li>
<li>Oesterle, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOesterle%2C+A+%22Pipette+Cookbook+2018%3A+P-97+and+P-1000+Micropipette+Pullers%22">Pipette Cookbook 2018: P-97 and P-1000 Micropipette Pullers</a>. , Sutter Instruments. Novato, CA. (2018).</li>
<li>Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photographic+study+of+development+in+the+living+embryo+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">A photographic study of development in the living embryo of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 33 (3), 789-801 (1975).</li>
<li>Powsner, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+temperature+on+the+durations+of+the+developmental+stages+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Zoology%22%5BJournal%5D)">The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster.</a> Physiological Zoology. 8 (4), 474-520 (1935).</li>
<li>Hunter, M. V., Willoughby, P. M., Bruce, A. E. E., Fernandez-Gonzalez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+Stress+Orchestrates+Cell+Polarity+to+Promote+Embryonic+Wound+Healing%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Oxidative Stress Orchestrates Cell Polarity to Promote Embryonic Wound Healing.</a> Developmental Cell. 47 (3), 377-387 (2018).</li>
</ol>

Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

L’importance de cette méthode est qu’elle utilise le protocole bien établi de microinjection chez les embryons de Drosophile 21 , 22,23,24,25,26,27pour permettre de nouvelles recherches concernant l’ASR et l’assemblage de tiges d’actine qui l’accompagnent. Un avantage majeur de l’in...

Ce protocole décrit comment injecter G-actinRed pour visualiser l’assemblage de tiges d’actine intranucléaires dans les embryons stressés par la chaleur qui subissent une réponse inductible au stress actin (ASR)1. Nous avons développé ce protocole pour faciliter les études de l’ASR, qui dans les embryons conduit à une morphogenèse perturbée et une viabilité réduite, et dans les types de cellules humaines adultes est associée à des pathologies, y compris l’insuffisancerénale 2, myopathies musculaires3, et la maladie d’Alzheimer et de Huntington4,5,6,7,8. Cet ASR est induit par de nombreuses contraintes cellulaires, y compris le chocthermique 9,10,11, stress oxydatif4,6, réduction de la synthèse ATP12, et anormal Huntingtin ou oligomérisation β-amyloïde4,5,6,7,9,13,14,15,16. Une caractéristique de l’ASR est l’assemblage de tiges d’actine aberrantes dans le cytoplasme ou le noyau des cellules affectées, qui est entraînée par l’hyperactivation induite par le stress d’une protéine actin interagissant, Cofilin1,5,6,10. Malheureusement, des lacunes importantes subsistent en matière de connaissances concernant le RSE. Par exemple, la fonction des tiges d’actine n’est pas connue. Nous ne comprenons pas pourquoi les tiges se forment dans le cytoplasme de certains types de cellules, mais le noyau d’autres. Il n’est pas clair non plus si l’ASR est protecteur ou inadapté pour les cellules ou les embryons soumis à un stress. Enfin, nous ne connaissons toujours pas les mécanismes détaillés sous-jacents à l’hyperactivation cofiline ou à l’assemblage de tiges d’actine. Ainsi, ce protocole fournit un essai rapide et polyvalent pour sonder l’ASR en visualisant la formation et la dynamique de tige d’actine dans le système expérimental hautement tractable de l’embryon vivant de mouche de fruit.
Le protocole de microinject G-actinRouge dans les embryons vivants de Drosophila a été initialement développé pour étudier la dynamique des structures normales d’actine cytoplasmique17 pendant des événements de construction de tissu. Dans ces études, nous avons constaté que l’injection rouge de G-actin n’a pas affecté défavorablement des processus développementaux tôt dans l’embryon, y compris la cytokinésie ou la gastrulation17,18. Nous avons ensuite modifié le protocole, en adaptant la manipulation de l’embryon etl’injection rouge de G-actine pour permettre l’imagerie des tiges d’actine dans les embryons stressés par la chaleur subissant l’ASR1. D’autres méthodes que l’injection de G-actin Red peuvent être utilisées pour visualiser l’actine chez les embryons. Ces méthodes reposent sur l’expression de protéines fluorescentes (FPs) étiquetées à l’actine ou à des domaines de protéines liant l’actine, telles que utrophine-mCherry, Lifeact, F-tractin-GFP, et Moesin-GFP (examinédans 19). Toutefois, l’utilisation de ces sondes FP exige de la prudence parce qu’elles peuvent stabiliser ou perturber certaines structures d’actine, ne pas étiqueter également toutes les structures d’actine20, et dans le cas de l’actin-GFP, sont fortement surexprimées – problématiques pour l’analyse de l’assemblage de tiges qui dépend non seulement du stress, mais aussi de la concentration d’actinedépendante 1. Ainsi, G-actinRed est la sonde préférée pour les études de tige dans les embryons de mouche, et la grande taille de l’embryon permet son injection facile.
Le flux de travail de ce protocole est similaire à d’autres techniques bien établies de microinjection qui ont été utilisées pour injecter des protéines, des acides nucléiques, des médicaments et des indicateurs fluorescents dans les embryons de Drosophile 21,22,23,24,25,26,27. Cependant, à la suite de la microinjection de G-actinRouge ici, les embryons sont exposés à un léger stress thermique pour induire l’ASR et l’assemblage intranucléaire de tige d’actine. Pour les laboratoires ayant accès aux mouches et une plate-forme d’injection, cette méthode devrait être facilement implémentable et adaptable pour des lignes d’étude spécifiques en ce qui concerne l’ASR, y compris son induction par différents stress ou modulation dans des milieux génétiques distincts.

<table><tbody><tr><td>Adénosine triphosphate (ATP)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>A23835G</td><td>Composant du tampon G</td></tr><tr><td>Jus de pomme, Mott’s, 64 fl oz</td><td>Mott’s</td><td></td><td>014800000344 Composant des assiettes de jus de pomme</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td>Composant des plaques de jus de pomme Eau de</td></tr><tr><td>Javel, germicide PureBright, hypochlorite de sodium à 6,0 %</td><td>KIK International</td><td>059647210020</td><td>Pour les embryons déchorionnés</td></tr><tr><td>Chlorure</td><td>de calcium Millipore-Sigma</td><td>C1016500G</td><td>Composant de G</td></tr><tr><td>tampon Passoire à cellules, 70 &mu ; m</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td>Pour la collecte d’embryons déchorionnés Microscope</td></tr><tr><td>confocal, LSM 880 34 canaux avec Airyscan</td><td>Zeiss</td><td>0000001994956</td><td>Pour l’imagerie de bâtonnets d’actine intranucléaires</td></tr><tr><td></td><td>Déshydratant Drierite</td><td>24001</td><td>Pour la dessiccation d’embryons</td></tr><tr><td>Microscope de dissection, Stemi 508 Stéréoscope avec zoom 8:1</td><td>Zeiss</td><td>4350649000000</td><td>Pour disposer les embryons sur un coin de gélose</td></tr><tr><td>Aiguille de dissection, 5 po</td><td>Fisher Scientific</td><td>08965A</td><td>Pour disposer les embryons sur un coin</td></tr> de <tr><td>gélose Dithiothréitol (DTT)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1725</td><td>Composant du tampon G</td></tr><tr><td>Ruban adhésif double face, Scotch Permanent, 0,5 po x 250 po</td><td>3M</td><td>021200010323</td><td>Pour fabriquer de la colle embryonnaire</td></tr><tr><td>Cage de collecte d’embryons</td><td>Genessee Scientific</td><td>59100</td><td>Pour l’hébergement des mouches adultes et la collecte d’embryons</td></tr><tr><td>Pince à épiler à pointe fine, pince Dumont, Style 5</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>72701D</td><td>Pour disposer les embryons sur un coin de gélose</td></tr><tr><td>Capillaires en verre, verre borosilliqué, minces 1 mm x 0,75 mm</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW1004</td><td>Pour micro-aiguilles</td></tr><tr><td>Huile d’halocarbure 27</td><td>Millipore-Sigma</td><td>H8773100ML</td><td>Pour l’hydratation des embryons</td></tr><tr><td>Incubateur à étage chauffé</td><td>Zeiss</td><td>4118579020000, 4118609020000, 4118609010000</td><td>Pour l’imagerie confocale</td></tr><tr><td>Essuie-glaces de laboratoire, KimWipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td>Essuie-glaces de laboratoire</td></tr><tr><td>Microscope optique, Invertoskop 40C Contraste de phase inversé microscope, remis à neuf</td><td>Zeiss</td><td>Discontinué</td><td>Microscope à injection</td></tr><tr><td>Méthyl-4-hydroxybenzoate</td><td>Millipore-Sigma</td><td>H36471KG</td><td>Composant des plaques de jus de pomme</td></tr><tr><td>Micro-injecteur, FemtoJet4x</td><td>Eppendorf</td><td>5253000025</td><td>Micro-injecteur</td></tr><tr><td>Embouts de micro-chargeur, epU.I.P.S. 20 &mu ; L</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>Pour le chargement de micro-aiguilles</td></tr><tr><td>Micromanipulateur et platine d’injection avec cadrans x,y,z pour le réglage de l’aiguille</td><td>Bernard Instruments, Inc (Houston, TX)</td><td>Personnalisé</td><td>Pour effectuer des micro-injections</td></tr><tr><td>Extracteur de micropipettes, Modèle P-97, Flaming/Brown</td><td>Sutter Instruments</td><td>P97</td><td>Pour tirer des tubes capillaires pour fabriquer des micro-aiguilles</td></tr><tr><td>Verre de couverture de microscope 24x50-1.5</td><td>Fisher Scientific</td><td>12544E</td><td>Pour le montage d’embryons</td></tr><tr><td>Lames de microscope, Lilac Colorfrost, Prénettoyées, 25 x 75 x 1mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>22037081</td><td>Pour le montage d’embryons pour injection</td></tr><tr><td>n-Heptane</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3601</td><td>Composant de colle embryonnaire</td></tr><tr><td>Objectif, 10x</td><td>Zeiss</td><td>Discontinued</td><td>Objectif 10x pour microscope</td></tr> <tr><td>à injectionObjectif, C-Apochromat 40x/1,2 W Korr. FCS</td><td>Zeiss</td><td>4217679971711</td><td>Objectif à eau 40x pour objectif confocal</td></tr><tr><td>, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0,8 Imm Cor DIC M27 pour immersion dans l’huile, l’eau, l’huile de silicone ou la glycérine (D=0-0,17mm) (WD=0,57mm à D=0,17mm)</td><td>Zeiss</td><td>4208529871000</td><td>Objectif à immersion mixte 25x pour objectif confocal</td></tr>, <tr><td>Plan-Apocrhomat 63x/1,40 Huile DIC f/ELYRA</td><td>Zeiss</td><td>4207829900799</td><td>63x Objectif à huile pour confocal</td></tr><tr><td>Pinceau, Robert Simmons Expression E85 Pointu Rond taille 2</td><td>Daler-Rowney</td><td>038372016954</td><td>Pour le transfert d’embryons</td></tr><tr><td>Essuie-tout, Mouchoirs en papier à pliage en C,</td><td>Kimberly-Clark</td> blanc <td>884266344845</td><td>Pour passoire à cellules buvard</td></tr><tr><td>, pipette Pasteur, 5 3/4 po</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367820A</td><td>Pour recouvrir les embryons d’huile</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri, verre, 100 x 20 mm</td><td>Corning</td><td>3160102</td><td>Pour chambre d’incubation humide</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri, plastique, 60 x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25384092</td><td>Pour plaques de jus de pomme</td></tr><tr><td>Pipette, Eppendorf Référence 0.5-10 &mu ; L</td><td>Eppendorf</td><td>2231000604</td><td>Pour le chargement de la micro-aiguille</td></tr><tr><td>Pointe de pipette, xTIP4 250 &mu ; L</td><td>Biotix</td><td>63300006</td><td>Pour ajouter de la colle embryonnaire à la lamelle</td></tr><tr><td>Lame de rasoir</td><td>VWR</td><td>55411050</td><td>Pour couper le coin de gélose, le ruban, les pointes de pipette</td></tr><tr><td>Actine globulaire conjuguée à la rhodamine, plaquette humaine (non musculaire ; 4x10 &mu ; g)</td> <td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>APHR-A</td><td>G-actin^Red</td></tr><tr><td>Flacon à scintillation, 20 mL Verre borosillicate avec doublure en polyéthylène et bouchons d’urée</td><td>Fisher Scientific</td><td>033377</td><td>Pour la fabrication de colle d’embryon</td></tr><tr><td>Pot à vis, 16 oz</td><td>Nalgene</td><td>000194414195</td><td>Pour la dessiccation des embryons</td></tr><tr><td>Micromètre de stade Microscopie</td> électronique <td>Sciences</td><td>602104PG</td><td>Pour calibrer le volume de l’injection de G-actine</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Millipore-Sigma</td><td>840971KG</td><td>Composant des assiettes de jus de pomme</td></tr><tr><td>Base Trizma</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T15031KG</td><td>Composant de la levure tampon G</td></tr><tr><td>, Levure Lesaffre Yeast Corporation, Red Star Active Dry, 32 oz</td><td>Levure Lesaffre Corporation</td><td>117929157002</td><td>Composant de la pâte de levure</td></tr></tbody></table>

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Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Le but de ce protocole est de visualiser les tiges intranucléaires d’actine qui se réunissent dans les embryons vivants de Drosophila melanogaster suivant le stress thermique. Les tiges d’actine sont la marque d’une réponse de stress actin (ASR) conservée et inductible qui accompagne les pathologies humaines, y compris les maladies neurodégénératives. Précédemment, nous avons montré que l’ASR contribue aux échecs de morphogenèse et à la viabilité réduite des embryons en développement. Ce protocole permet d’étudier en continu les mécanismes sous-jacents à l’assemblage des tiges d’actine et à l’ASR dans un système modèle très sensible à l’imagerie, à la génétique et à la biochimie. Les embryons sont recueillis et montés sur un coverslip pour les préparer à l’injection. L’actine globulaire conjuguée à la rhodamine (G-actinRed)est diluée et chargée dans un microneedle. Une seule injection est effectuée au centre de chaque embryon. Après injection, les embryons sont incubés à haute température et les tiges d’actine intranucléaire sont ensuite visualisées par microscopie confoccale. La récupération de la fluorescence après des expériences de photobleaching (FRAP) peut être effectuée sur les tiges d’actine; et d’autres structures riches en actine dans le cytoplasme peuvent également être photographiées. Nous constatons que G-actinRed polymérise comme la G-actine endogène et n’interfère pas, à lui seul, avec le développement normal de l’embryon. Une limitation de ce protocole est que le soin doit être pris pendant l’injection pour éviter des dommages graves à l’embryon. Cependant, avec la pratique, l’injection de G-actinRouge dans les embryons de Drosophila est un moyen rapide et fiable de visualiser les tiges d’actine et peut facilement être utilisé avec des mouches de n’importe quel génotype ou avec l’introduction d’autres contraintes cellulaires, y compris l’hypoxie et le stress oxydatif.

Un flux de travail schématique de la manipulation des embryons est représenté à la figure 1,et un calendrier pour une expérience typique est présenté dans le tableau 1. Une estimation pour un bon résultat expérimental est que pour chaque 10 embryons injectés, au moins la moitié des embryons vus seront au stade de développement correct, intact, et présentent un ASR robuste avec le stress thermique à 32 °C. Cet ASR sera démontré par l’assemblage de tiges d’actine intranucléai...

Le but de ce protocole est d’injecter de la globulaire conjuguée à la rhodamine dans les embryons de Drosophila et l’assemblage intranucléaire de tige d’actine d’image suivant le stress thermique.

Imagerie Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos Imaging Intra

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...

Notre protocole est important car il utilise la technique bien établie de la micro-injection dans les embryons de drosophile pour permettre de nouvelles recherches sur la réponse au stress d’actine et l’assemblage des bâtonnets d’actine qui l’accompagne. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons étudier la réponse au stress d’actine dans divers contextes, tels qu’un dépistage de mutants ou dans différentes conditions de stress. Une personne qui n’a jamais pratiqué cette technique auparavant peut avoir du mal à manipuler les embryons et à effectuer la micro-injection.Nous vous recommandons de pratiquer ces étapes jusqu’à ce que l’utilisateur se sente à l’aise. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes de manipulation, de positionnement et de montage de l’embryon pour la micro-injection et l’imagerie peuvent ne pas être claires à partir des seules instructions écrites. Préparez les gobelets de prélèvement d’embryons et les assiettes de gélose au jus de pomme selon les instructions du manuscrit.Pour favoriser la ponte la plus généreuse possible, installez des gobelets de collecte avec des mouches deux jours avant l’expérience. Ajoutez au moins 100 mouches femelles et 50 mouches mâles dans chaque tasse de collecte, puis couvrez-la d’une assiette de jus de pomme. Préparez une solution de travail de rouge de G-actine et conservez-la sur de la glace jusqu’à ce qu’elle soit chargée dans la micro-aiguille.Laissez les mouches pondre des embryons pendant 30 minutes sur les plaques de jus de pomme avec de la pâte de levure à 18 degrés Celsius. Pendant que les mouches pondent, découpez un quartier rectangulaire de quatre centimètres sur un centimètre de gélose au jus de pomme avec une lame de rasoir et placez-le sur une lame de verre de 25 x 75 millimètres. Récoltez la plaque de la collection et déchorionnez les embryons en versant une solution d’eau de Javel fraîche sur la plaque et en la faisant tourner pendant une minute.Humidifiez les poils d’un pinceau avec de l’eau distillée, puis utilisez-le pour transférer les embryons déchoionnés et lavés du panier de collecte sur le quartier d’agar au jus de pomme préparé sur la lame de verre. À l’aide d’une pince à épiler à pointe fine ou d’une aiguille à disséquer, disposez 10 embryons en ligne droite le long de l’axe long du coin de gélose rectangulaire. Disposez les embryons de la tête à la queue de manière à ce que leur face dorsale soit face au chercheur.Coupez un demi-centimètre de l’extrémité d’une pointe de pipette P200 avec une lame de rasoir et trempez-le dans la colle de l’embryon. Enduisez généreusement une zone de cinq millimètres le long du bord long d’une lamelle rectangulaire de 24 x 50 millimètres et laissez-la sécher côté colle vers le haut. Une fois que la colle d’embryon a séché, placez délicatement la lamelle côté colle vers le bas sur la rangée d’embryons alignés sur la gélose, en laissant deux à trois millimètres d’espace entre le bord de la lamelle et la rangée d’embryons.Retournez la lamelle de manière à ce que les embryons soient orientés vers le haut. Ils doivent être collés en ligne le long d’un bord long de la lamelle, leur région ventrale faisant face au bord le plus proche. Placez la lamelle sur 150 grammes de déshydratant bleu frais dans un bocal à vis de 16 onces et vissez fermement le couvercle.Desséchez les embryons pendant 8 à 10 minutes, puis retirez la lamelle du pot déshydratant et collez chaque côté court de la lamelle sur une lame de microscope côté embryon vers le haut. Ajoutez deux à trois gouttes d’huile creuse de carbone 27 avec une pipette Pasteur pour couvrir les embryons alignés et les protéger d’une déshydratation supplémentaire. Pendant que les embryons se dessèchent, chargez le surnageant rouge de G-actine préalablement préparé dans la micro-aiguille à l’aide d’une pointe de microchargeur.Fixez la micro-aiguille au porte-aiguille et serrez la vis. Placez la lame avec les embryons montés sur la platine du microscope et utilisez les commandes à micro-aiguille pour amener l’aiguille dans le même plan focal que les embryons. Insérez la micro-aiguille dans l’embryon de manière à ce qu’elle frappe l’embryon au milieu de sa région ventrale à l’équateur de l’embryon.Lorsque la pointe de la micro-aiguille est visible à l’intérieur du milieu de l’embryon, déclenchez l’injection. Après l’injection, retirez lentement la micro-aiguille. Déplacez la platine et effectuez l’injection sur les autres embryons.Une fois que tous les embryons ont été injectés, placez la lame avec les embryons dans une chambre d’incubation humide et fermez le couvercle. Retirez la lame avec les embryons injectés de la chambre d’incubation humide. En travaillant rapidement, soulevez doucement les morceaux de ruban adhésif double face qui ont été utilisés pour faire adhérer la lamelle à la diapositive.Collez ensemble deux morceaux de ruban adhésif double face de 2,5 centimètres de long et coupez-les en deux dans le sens de la longueur pour former deux bandes. Collez les 2/3 de la longueur de chaque bande de ruban adhésif sur la première lamelle, en masquant chaque côté des embryons. Laissez 1/3 des bandes de ruban adhésif pendre du bord de la première lamelle où les embryons sont coincés.Placez délicatement une deuxième lamelle rectangulaire sur les bandes de ruban adhésif pour prendre en sandwich les embryons entre les lamelles, en alignant les bords de 25 millimètres mais en gardant les bords de 50 millimètres décalés les uns des autres d’un centimètre. Vérifiez que l’étage chauffé est à la température appropriée. Et si vous utilisez un microscope inversé, ajoutez du liquide d’immersion sur l’objectif sélectionné.Placez soigneusement le sandwich sur la platine, en vous assurant que la nouvelle surface d’imagerie est celle qui touche le liquide d’immersion. Concentrez-vous sur un embryon en cellularisation, puis passez en mode d’acquisition laser sur le microscope confocal et ajustez la puissance et le gain du laser, la taille de l’image, le pavage et les paramètres de projection comme vous le souhaitez. Prenez des images de surface à travers les plans focaux des noyaux de l’embryon pour trouver des bâtonnets d’actine intranucléaires.Les bâtonnets doivent apparaître dans plusieurs orientations sous forme de traînées ou de points brillants à l’intérieur des noyaux relativement sombres. La réponse au stress actinique et les embryons stressés par la chaleur sont évidents par l’assemblage de bâtonnets d’actine intranucléaires. Les bâtonnets d’actine apparaissent dans différentes orientations à l’intérieur des noyaux et peuvent être imagés à travers plusieurs plans focaux.En comparaison, les embryons témoins incubés à 18 degrés Celsius ne présentent pas de bâtonnets d’actine. Le pourcentage de noyaux contenant des bâtonnets peut être quantifié et des expériences FRAP peuvent être effectuées sur les bâtonnets. Un exemple de graphique de récupération de fluorescence pour une région blanchie par rapport à une région non blanchie d’un bâtonnet d’actine est présenté ici.Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que la formation des bâtonnets d’actine dépend de la température. Pour les étapes qui suivent la microinjection, il est crucial de maintenir les embryons à la température d’incubation souhaitée. Après la microinjection, le chercheur peut effectuer un FRAP pour confirmer l’absence de renouvellement de l’actine F dans les bâtonnets d’actine ou pour quantifier les changements dans le renouvellement de l’actine F se produisant dans d’autres structures riches en actine.

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