Système de nanoparticules de membrane cellulaire indigène pour l’analyse d’interaction protéine-protéine de membrane

Ce protocole aidera les chercheurs à déterminer avec plus de précision l’état oligomérique natif des protéines membranaires en utilisant le système de nanoparticules de membrane cellulaire native en conjonction avec la microscopie électronique. L’avantage de cette technique est qu’elle fournit des données structurelles précises sur les protéines membranaires dans un environnement de type membrane cellulaire native, et qu’elle peut être utilisée pour la détermination future de la structure à haute résolution. Kyle Kroeck, un boursier postdoctoral de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure.

Pour préparer des nanoparticules de membrane cellulaire native, remettez en suspension un gramme de la pastille de membrane d’intérêt dans 10 millilitres de tampon NCMN A.Utilisez un homogénéisateur de verre pour homogénéiser l’échantillon de membrane cellulaire remis en suspension à 20 degrés Celsius et transférez l’échantillon en suspension dans un tube en polypropylène de 50 millilitres. Ajouter la solution mère de polymère actif membranaire et le tampon A NCMN supplémentaire à l’échantillon jusqu’à une concentration finale de 2,5 % de polymère actif membranaire et agiter la solution pendant deux heures à 20 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, ultracentrifugez l’échantillon.

Pendant la centrifugation, équilibrez une colonne de nickel NTA de cinq millilitres avec 25 millilitres de tampon NCMN A.At la fin de la centrifugation, transférez le surnageant sur la colonne et utilisez une pompe à seringue réglée sur un débit de 0,5 millilitre par minute pour charger le surnageant sur la colonne à 20 degrés Celsius. Lavez les lignes de la machine de chromatographie liquide protéique rapide avec suffisamment de tampon B NCMN pour rincer complètement le système et connecter la colonne à la machine de chromatographie. Lavez la colonne avec 30 millilitres de tampon B NCMN à un débit d’un millilitre par minute et récupérez le flux.

Lavez la colonne avec 30 millilitres de tampon C NCMN à un débit d’un millilitre par minute et récupérez le flux. Elutez la protéine avec 20 millilitres de tampon D NCMN à un débit de 0,5 millilitre par minute et utilisez un collecteur de fractions pour collecter des fractions d’un millilitre de l’échantillon, puis stockez les échantillons de protéines à quatre degrés Celsius à l’aide de SDS-PAGE pour vérifier les échantillons qui correspondent aux pics observés sur le graphique d’élution par chromatographie liquide à protéines rapides. Pour préparer des grilles de coloration négatives, enveloppez une lame de verre avec du papier filtre avec le côté carbone vers le haut et placez les grilles qui vont être utilisées pour la préparation de l’échantillon sur la lame.

Placez la lame de verre avec les grilles du microscope électronique dans la chambre d’un déchargeur de luminescence entre les deux électrodes et replacez le couvercle en verre en vous assurant que le couvercle est centré et bien scellé. Faites fonctionner la machine à décharge lumineuse et assurez-vous que la lumière violette générée par le plasma est visible. Lorsque la machine a fini de fonctionner, attendez que la chambre ait atteint la pression atmosphérique avant de retirer le couvercle en verre et de placer la glissière sur le banc.

Ajustez la concentration des échantillons de protéines purifiées à environ 0,1 milligramme par millilitre et chargez 3,5 microlitres de l’échantillon de protéines sur la grille de carbone de 10 nanomètres d’épaisseur. Au bout d’une minute, utilisez un morceau de papier filtre pour retirer le liquide de la surface de la grille de microscopie électronique et lavez la surface de la grille trois fois avec une gouttelette de trois microlitres d’eau par lavage. Après le dernier lavage à l’eau, lavez la surface de la grille deux fois de plus avec trois gouttelettes d’un microlitre d’acétate d’uranium frais filtré à 2 % par lavage.

Après le dernier lavage à l’acétate d’uranium, colorez la grille avec une gouttelette de trois microlitres d’acétate d’uranium frais filtré à 2 % pendant une minute. À la fin de l’incubation, utilisez un nouveau morceau de papier filtre pour enlever les gouttelettes et faites sécher la grille à l’air libre pendant au moins une minute avant de ranger la grille dans une boîte à grille pour une utilisation ultérieure. Ici, des images de coloration négative obtenues par microscopie électronique à transmission, comme démontré, peuvent être observées.

L’image négative de la coloration de l’échantillon de protéine B du canal de résistance de l’Acraflavine de type sauvage purifié au détergent révèle une solution homogène de particules monodispersées, la protéine présentant une structure quaternaire trimérique bien définie. Ces structures trimériques correspondent au chromatogramme d’exclusion stérique observé après purification. En comparaison, dans l’image de coloration négative pour le mutant P223G également purifié avec un détergent, une solution hétérogène de nanoparticules polydispersées avec une propension à l’agrégation mais aucun trimère natif observable ne peut être observée.

Ces résultats sont également étayés par la chromatographie d’exclusion stérique. Des résultats similaires ont été observés pour les protéines de type sauvage et mutantes après purification avec le polymère actif membranaire NCMNP11. L’utilisation du polymère NCMNP52 facilite la génération de nanoparticules de membrane cellulaire native de tailles beaucoup plus grandes, ce qui permet d’imager plusieurs trimères de protéine B du canal de résistance de l’acraclavine dans une seule particule de membrane cellulaire native.

Dans l’échantillon mutant, cependant, aucune particule de trimère n’est observée, même en regardant les grandes plaques bicouches de la membrane cellulaire native. L’analyse SDS-PAGE des échantillons de protéines purifiées confirme la présence de la résistance B de l’acraflavine dans tous les échantillons avec une pureté supérieure à 95 % au poids moléculaire prévu de la protéine. Lors de la modification de ce protocole pour d’autres protéines, il est important de déterminer expérimentalement la quantité appropriée de fraction membranaire ainsi que la durée, le temps et la température du processus de solubilisation.

Si les images de votre échantillon révèlent une solution homogène de particules monodispersées avec des unités structurelles bien définies, l’échantillon peut être utilisé pour la détermination de la structure à haute résolution par cryo-microscopie électronique.