Name: Différenciation guidée des podocytes rénaux matures à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme dans des conditions chimiquement définies (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Découvrez une méthode chimiquement définie pour différencier des podocytes matures à partir de cellules souches pluripotentes induites humaines avec une efficacité supérieure à 90% en 26 jours. Cette technique permet la modélisation de maladies rénales et les tests de néphrotoxicité.

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Ce travail a été soutenu par l’école d’ingénierie Pratt de l’Université Duke, la Division de néphrologie de la Duke Medical School, un prix de recherche de chaire du département de médecine de l’Université Duke et un prix spécial de transition de carrière PDEP du Burroughs Wellcome Fund à S.M.. M.B a été soutenu par le programme de bourses de recherche pour diplômés de la National Science Foundation. Nous remercions le laboratoire Bursac de nous avoir généreusement fourni la lignée de cellules souches DU11 et le laboratoire Varghese de l’Université Duke d’avoir temporairement partagé leur installation de culture tissulaire avec notre groupe. Cette publication est dédiée à la professeure Laura L. Kiessling, professeure Novartis de chimie au Massachusetts Institute of Technology, à l’époque de son 60e anniversaire.

1. Préparation des réactifs
<ol><li>Diluer le supplément de milieux de culture cellulaire (CCM) 5x hiPS décongelé dans un milieu basal de culture cellulaire hiPS pour obtenir une solution 1x de CCM hiPS. REMARQUE: Le supplément de CCM surgelé 5x hiPS nécessite un processus de décongélation lent, idéalement à 4 ° C pour la nuit. Les aliquotes du CCM 1x hiPS peuvent être conservées jusqu’à 6 mois à -20 °C.</li>
	<li>Préparation de plaques à membrane basale (BM) matricielle 1 pour la culture cellulaire hiPS : Décongeler la matrice BM 1 pendant la nuit sur de la glace à 4 °C. Une fois décongelés, préparer les aliquotes avec les facteurs de dilution appropriés, comme suggéré par le fabricant. REMARQUE: En règle générale, les aliquotes sont préparées pour dilution ultérieure dans 25 mL de DMEM/F12 froid dans un tube conique de 50 mL suivi d’un mélange approfondi pour dissoudre complètement la matrice BM 1 et éviter la formation de cristaux résiduels.</li>
	<li>Transférer 1 mL de la solution BM matrix 1 dans chaque puits d’une plaque de 6 puits et incuber à 37 °C pendant 1-2 h ou à 4 °C pendant au moins 24 h, enveloppé dans un film de paraffine. Les plaques revêtues de la matrice BM 1 peuvent être conservées à 4 °C jusqu’à 2 semaines.</li>
	<li>Préparation de la matrice à membrane basale (BM) 2 - plaques revêtues : Diluer des quantités appropriées de matrice BM 2 dans 9 mL d’eau distillée stérile pour préparer une concentration finale de 5 μg/mL. Ajouter 700 μL de la solution BM matrix 2 à chaque puits d’une plaque de 12 puits et incuber la plaque à température ambiante pendant 2 h ou pendant la nuit à 4 °C.</li>
	<li>Préparer des solutions sous forme de BMP7, d’Activine A et de VEGF à 100 μg/mL comme suit : reconstituer le BMP7 dans de l’eau distillée stérile contenant 0,1 % (p/vol) de BSA et reconstituer séparément l’activine A et le VEGF dans du PBS stérile contenant 0,1 % (p/vol) de BSA. Pour éviter les cycles fréquents de congélation-décongélation, préparez des aliquotes de 100 μL à partir de chaque solution d’élevage et conservez-les à -20 °C jusqu’à 6 mois.</li>
	<li>Préparer une solution mère de 10 mM de Y27632 en dissolvant 10 mg de Y27632 dans 3,079 mL d’eau distillée stérile. Aliquote 100 μL du stock et conserver à -20 °C jusqu’à 6 mois.</li>
	<li>Dissoudre 2 mg de CHIR99021 dans 143,4 μL de DMSO stérile pour préparer une solution mère de 30 mM. Préparer des aliquotes de 5 μL et conserver à -20 °C jusqu’à 1 mois (ou selon la recommandation du fabricant).</li>
	<li>Dissoudre 10 mg d’acide rétinoïque touttrans dans 3,33 mL de DMSO stérile. Préparer des aliquotes de 500 μL et conserver à -20 °C jusqu’à 6 mois.</li>
</ol>2. Préparation des milieux de culture
<ol><li>Préparer le milieu de différenciation du mésoderme en reconstituant les solutions mères correspondantes à une concentration finale de 100 ng/mL d’Activine A, de 3 μM CHIR99021, de 10 μM Y27632 et de 1x supplément sans sérum B27 dans un volume approprié de DMEM/12 avec un supplément de glutamine. REMARQUE: Le milieu de différenciation du mésoderme doit être fraîchement préparé avant les étapes de différenciation et à un volume approprié à l’échelle de l’expérience (généralement, 50 mL de milieu sont suffisants pour deux plaques de 12 puits).</li>
	<li>Préparer le milieu intermédiaire de différenciation du mésoderme en reconstituant les solutions mères correspondantes à une concentration finale de 100 ng/mL BMP7, 3 μM CHIR99021 et 1x supplément sans sérum B27 dans DMEM/F12 avec un supplément de glutamine. REMARQUE: Si nécessaire, le milieu peut être complété par 1% (vol / vol) de pénicilline-streptomycine. Réglez le volume du milieu en utilisant DMEM/F12 avec un supplément de glutamine. Ce milieu peut être préparé en grandes quantités; toutefois, il est recommandé de les conserver dans des aliquotes plus petites (p. ex., 45 mL dans des tubes coniques de 50 mL) pour éviter les cycles répétés de gel-dégel. Ce milieu peut être conservé à -20 °C jusqu’à 3 mois et peut être décongelé à 4 °C pendant la nuit avant utilisation.</li>
	<li>Préparer le milieu d’induction des podocytes en reconstituant à une concentration finale de 100 ng/mL de BMP7, 100 ng/mL d’activine A, de 50 ng/mL de VEGF, de 3 μM de CHIR99021, de 1x supplément sans sérum B27 et d’acide rétinoïque tout-trans de 0,1 μM dans du DMEM/F12 avec un supplément de glutamine. Protéger le milieu de la lumière (p. ex., en enveloppant le contenant avec du papier d’aluminium). REMARQUE: Ce milieu peut être préparé en grandes quantités et stocké dans l’obscurité à -20 ° C pendant 3 mois. Les aliquotes congelées doivent être décongelées pendant la nuit à 4 °C avant utilisation.</li>
	<li>Préparer 25 mL de solution neutralisante de trypsine en ajoutant 10 % (vol/vol) de FBS inactivé par la chaleur dans le DMEM/F12 et filtrer dans des conditions stériles.</li>
	<li>Pour le maintien post-différenciation des podocytes dérivés de cellules souches, préparer le milieu complet avec un milieu d’entretien des podocytes en ajoutant le supplément au milieu basal conformément aux directives du fabricant et conserver à 4 ° C jusqu’à deux semaines.</li>
</ol>3. Culture cellulaire hiPS sans mangeoire utilisant un milieu de culture cellulaire hiPS
<ol><li>Aspirer la solution résiduelle de la matrice BM 1 des plaques pré-enduites et laver les puits 3 fois avec 1 à 2 mL de DMEM/F12 réchauffé.</li>
	<li>Aspirer le CCM hiPS des cellules hiPS et rincer les cellules 3 fois avec du DMEM/F12 réchauffé. Ajouter 1 mL de solution chaude de détachement cellulaire et incuber pendant 1 min à 37 °C pour aider à dissocier les cellules. Effectuez une inspection visuelle des cellules sous un microscope de culture tissulaire et assurez-vous que les bords des colonies cellulaires semblent arrondis, puis aspirez rapidement la solution de détachement cellulaire des cellules (en veillant à ce que les colonies cellulaires soient toujours attachées à la plaque, bien que lâchement). Rincez doucement les cellules une fois avec DMEM/F12 pour éliminer la solution de détachement cellulaire.</li>
	<li>Ajouter 3 mL de CCM hiPS aux cellules hiPS (dans chaque puits d’une plaque de 6 puits) qui ont été traitées avec la solution de détachement cellulaire. Grattez les colonies à l’aide d’un élévateur de cellules et pipettez doucement la suspension de cellules de haut en bas pour déloger les cellules faiblement adhérentes. Lavez soigneusement la plaque pour vous assurer que toutes les cellules sont récoltées. REMARQUE: L’utilisation d’une pipette de 5 mL est recommandée pour éviter un cisaillement excessif sur les cellules.</li>
	<li>Transférer 0,5 mL de la suspension cellulaire dans chaque puits d’une nouvelle plaque de 6 puits revêtue de matrice BM 1 contenant 2 mL de CCM hiPS par puits. Déplacez la plaque en figure huit pour répartir les colonies cellulaires dans les puits et incuber à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2. Rafraîchissez le milieu tous les jours jusqu’à ce que les cellules soient prêtes à être passées ou utilisées pour l’expérience de différenciation (environ 70 % de confluence). REMARQUE: La taille idéale de la colonie pour le passage de routine des CS IPS se situe entre 200 et 500 μm dans des conditions sans mangeoire en utilisant hiPS CCM (sans inhibiteur de ROCK). Si les cellules sont individualisées pendant le traitement avec des enzymes de dissociation ou des tampons, le CCM hiPS peut être complété par un inhibiteur de ROCK (par exemple, 10 μM Y27632) pour améliorer la viabilité cellulaire.</li>
</ol>4. Différenciation des cellules hiPS en cellules mésodermiques (jours 0-2)
<ol><li>Alors que les cultures cellulaires hiPS sont en phase de croissance exponentielle (environ dans les 4 jours suivant la culture après le passage, et environ 70% de confluence), inspectez visuellement la présence de cellules spontanément différenciées à l’intérieur et autour des bords des colonies. Si nécessaire, grattez de manière aseptique les zones de différenciation.</li>
	<li>Aspirer hiPS CCM à partir de cellules hiPS et rincer les cellules 3 fois avec du DMEM/F12 chaud. Incuber les cellules avec 1 mL de tampon de dissociation cellulaire sans enzyme pendant 10 min à 37 °C et vérifier la dissociation au microscope. En raison des différences inhérentes entre les différentes lignées cellulaires hiPS, le temps d’incubation réel du tampon de dissociation cellulaire doit être déterminé pour une lignée cellulaire donnée.</li>
	<li>Grattez doucement le puits avec un élévateur de cellules pour déloger les cellules faiblement adhérentes et transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL, puis pipetez plusieurs fois pour individualiser les cellules hiPS.<ol>
<li>Porter la suspension cellulaire au volume de 15 mL avec du DMEM/F12 chaud et centrifuger pendant 5 min à 290 x g à température ambiante.</li>
		<li>Aspirer doucement le surnageant et resuspendez les cellules avec du DMEM/F12 chaud pour une autre série de centrifugation afin d’éliminer les composants résiduels de la matrice BM 1 et du tampon de dissociation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aspirer les cellules surnageantes et les réaporer dans 1 mL de milieu d’induction du mésoderme comme décrit ci-dessus. Compter le nombre total de cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de coulter pour déterminer le volume approprié de milieu de différenciation du mésoderme nécessaire pour atteindre une concentration de 1 x10 5 cellules/mL.</li>
	<li>Aspirer la solution ECM à partir des plaques enduites de la matrice BM 2 et rincer les plaques deux fois avec du DMEM/F12 chaud. Mélangez doucement la suspension de la cellule hiPS en pipetant plusieurs fois. Transférer 1 mL de la suspension cellulaire dans chaque puits des plaques de 12 puits revêtues de la matrice BM à 2, puis secouer doucement les plaques pour répartir les cellules plus uniformément.</li>
	<li>Incuber la plaque à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2. Rafraîchissez le milieu d’induction du mésoderme le lendemain. REMARQUE: Après 2 jours, les cellules mésodermiques dérivées des cellules hiPS seraient prêtes pour l’induction intermédiaire du mésoderme.</li>
</ol>5. Différenciation des cellules mésodermiques dérivées des cellules hiPS en mésoderme intermédiaire (jours 2-16)
<ol><li>Au jour 2 du protocole de différenciation, aspirer le milieu d’induction du mésoderme et reconstituer avec 1 mL par milieu d’induction du mésoderme intermédiaire.</li>
	<li>Rafraîchissez le milieu tous les jours pour maintenir un seuil précis de facteurs de croissance et de petites molécules pour les cellules métaboliquement actives. S’il y a une croissance cellulaire importante et un épuisement rapide des nutriments des milieux (indiqué par le jaunissement des milieux), le volume du milieu intermédiaire de différenciation du mésoderme peut être augmenté à 1,3 mL par puits des 12 plaques de puits.</li>
	<li>Culturez des cellules pendant 14 jours supplémentaires pour obtenir des cellules de mésoderme intermédiaires. Au jour 16, ces cellules peuvent être cryoconservées pour une utilisation ultérieure.</li>
</ol>6. Différenciation des cellules mésodermiques intermédiaires dérivées des cellules hiPS en podocytes (jours 16 à 21)
<ol><li>Rincer les cellules du mésoderme intermédiaire avec du DMEM/F12 chaud suivi d’une incubation des cellules avec 0,5 mL par puits de trypsine-EDTA à 0,05 % pendant 3 min à 37 °C. Effectuez une inspection visuelle pour vous assurer que les cellules commencent à se dissocier.</li>
	<li>Gratter les cellules à l’aide d’un élévateur de cellules et pipeter la suspension cellulaire plusieurs fois à l’aide d’une pointe de pipette de 1 000 μL pour obtenir des cellules individualisées (ou de petits amas). REMARQUE: À ce stade, assurez-vous que les cellules sont complètement dissociées car les cellules agrégées peuvent ne pas acquérir un phénotype différencié en phase terminale dans la chronologie du protocole.</li>
	<li>Ajouter environ 2 mL par puits de solution neutralisante de trypsine pour arrêter l’activité de la trypsine.</li>
	<li>Transférer les cellules dans un tube conique de 50 mL et porter le volume à 50 mL en utilisant DMEM/F12, puis centrifuger la suspension de la cellule pendant 5 min à 201 x g à température ambiante.</li>
	<li>Aspirer les cellules surnageantes et les réaporer dans le milieu d’induction des podocytes. Pour des résultats optimaux, assurez-vous d’une densité d’ensemencement finale d’environ 100 000 cellules/puits d’une plaque de 12 puits. Ajoutez la suspension cellulaire aux plaques à 2 couches de la matrice BM et secouez doucement la plaque pour aider à répartir les cellules plus uniformément.</li>
	<li>Incuber les cellules à 37 °C et 5 % de CO2 et rafraîchir le milieu quotidiennement jusqu’à 5 jours pour obtenir des podocytes au jour 21. REMARQUE: Les podocytes dérivés de cellules hiPS résultants peuvent être maintenus en culture pendant 2 à 4 semaines supplémentaires en utilisant un milieu complet avec un milieu d’entretien des podocytes. Une fois dans un milieu d’entretien des podocytes, les cellules peuvent être nourries tous les deux jours et peuvent être utilisées pour des études ultérieures ou des analyses en aval.</li>
</ol>

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</ol>

S.M. est l’auteur d’un brevet en instance pour des méthodes de génération de podocytes rénaux à partir de cellules souches pluripotentes (demande de brevet américain 14/950859). Les autres auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.

Dans ce rapport, nous décrivons un protocole pour la génération de podocytes glomérulaires rénaux à partir de cellules hiPS. Les podocytes dérivés des cellules hiPS présentent des caractéristiques morphologiques et moléculaires associées au phénotype13du podocyte rénal mature. Dans des publications antérieures, nous avons montré que les podocytes dérivés des cellules hiPS peuvent imiter la structure et la fonction de filtration sélective du glomérule rénal lorsqu’ils sont co-cultivés avec des cell...

Les progrès de la culture de cellules souches pluripotentes humaines sont sur le point de révolutionner la médecine régénérative, la modélisation des maladies et le dépistage des médicaments en fournissant aux chercheurs une source renouvelable et évolutive de matériel biologique qui peut être conçue pour obtenir presque n’importe quel type de cellule dans le corps humain1. Cette stratégie est particulièrement utile pour dériver des types de cellules spécialisées et fonctionnelles qui seraient autrement difficiles à obtenir. Les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPS)2,3,4,5 sont particulièrement attrayantes en raison de leur origine cellulaire somatique et du potentiel qu’elles représentent pour la médecine personnalisée. Cependant, le développement de méthodes pour dériver d’autres lignées cellulaires à partir de cellules hiPS reste difficile en raison de l’utilisation fréquente de conditions de culture mal définies, ce qui conduit à une faible efficacité et à une génération non spécifique de populations cellulaires hétérogènes6,7.
Présenté ici est une méthode pour la dérivation de podocytes rénaux matures à partir de cellules hiPS avec spécificité et haute efficacité dans des conditions chimiquement définies. En tenant compte des rôles de multiples facteurs dans le microenvironnement cellulaire, une stratégie de différenciation des cellules souches a été développée qui impliquait l’optimisation des facteurs solubles présentés dans le milieu de culture cellulaire ainsi que des facteurs insolubles, tels que les composants de la matrice extracellulaire ou les substrats adhésifs. Compte tenu de l’importance de la signalisation de l’intégrine dans le développement et la fonction des podocytes, l’expression des récepteurs de l’intégrine à la surface de la cellule a été initialement examinée. Les intégrines β1 étaient fortement exprimées non seulement dans les cellules hiPS, mais aussi dans leurs dérivés, y compris les cellules mésodermiques et les cellules mésodermiques intermédiaires8,9,10. Des expériences ultérieures ont confirmé que les ligands qui se lient aux intégrines β1 (y compris la laminine 511 ou le fragment de laminine 511-E8) soutiennent l’adhésion et la différenciation des cellules hiPS en podocytes lorsqu’ils sont utilisés en conjonction avec les milieux inductifs solubles décrits ci-dessous.
L’induction de l’engagement de la lignée cellulaire a été initiée en confirmant d’abord que les cellules hiPS cultivées sur les surfaces recouvertes de laminine pendant deux jours en présence d’un milieu contenant de l’activine A, chir99021 et Y27632 Inhibiteur de roche peuvent se différencier en cellules qui expriment les marqueurs mésodermiques précoces HAND1, goosecoid et brachyury8,11. Le traitement des cellules du mésoderme pendant 14 jours avec un milieu complété par la protéine morphogénétique osseuse 7 (BMP-7) et CHIR99021 a permis la dérivation de cellules mésodermiques intermédiaires qui exprimaient les marqueurs cellulaires néphron-progéniteurs de la tumeur de Wilm 1 (WT1), la protéine apparentée impaire 1 (OSR1)8,11et la protéine 2 du gène de boîte appariée (PAX2)12. Pour obtenir les podocytes glomérulaires rénaux matures, les cellules intermédiaires du mésoderme ont été traitées pendant 4 à 5 jours avec un nouveau milieu composé de BMP-7, d’activine A, de facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF), d’acide rétinoïque touttrans et de CHIR99021. La cytométrie en flux et l’immunocoloration ont été utilisées pour confirmer que >90% des cellules résultantes présentaient les caractéristiques moléculaires, morphologiques et fonctionnelles du podocyte rénal mature8,11,13. Ces caractéristiques comprennent le développement de processus de pied primaire et secondaire; l’expression de gènes spécifiques à la lignée podocytaire, y compris SYNPO, PODXL, MAF, EFNB28 et l’expression de protéines telles que la podocine, la néphrine et WT114,15,16. En outre, il a été constaté que les podocytes dérivés des cellules hiPS peuvent être maintenus en culture jusqu’à quatre semaines in vitro en utilisant un milieu8,11 disponible dans le commerce qui offre une flexibilité supplémentaire dans le calendrier des expériences en aval. Pour plus d’informations concernant les panels de cytométrie en flux utilisés pour déterminer la pureté des podocytes hiPS, veuillez vous référer à notre publication précédente11.

<table><tbody><tr><td>Cellules</td> humaines Cells<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DU11</td> La lignée cellulaire iPS DU11 (clone #11 de l’Université Duke) a été générée à la plateforme iPSC de l’Université Duke et nous a été fournie par le laboratoire Bursac de l’Université Duke.<td></td><td></td><td> Cette lignée a été testée pour le mycoplasme et a été caryotypée pour la dernière fois en juillet 2019 par notre laboratoire, et s’est avérée être caryotypiquement normale.</td></tr><tr><td>Growth Factors and Media Supplements</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>All-trans retinoïque (500 mg)</td><td>72262</td><td>Stem Cell Technologies</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplément sans sérum</td><td>17504044</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>04-0004</td><td>Stemgent</td><td>May show variation d’un lot à l’autre</td></tr><tr><td>Kit complet de milieu avec CultureBoost-R</td><td>4Z0-500-R</td><td>Cell Systems</td><td>Milieux d’entretien des podocytes</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>12634028</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 avec supplément GlutaMAX</td><td>10565042</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>DMEM/F12 avec supplément de glutamine</td></tr><tr><td>FBS inactivé</td> thermiquement <td>10082147</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Activine humaine A</td><td>PHC9564</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Humain BMP7</td><td>PHC9544</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Humain VEGF</td><td>PHC9394</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 milieu</td><td>05850</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>hiPS milieux de culture cellulaire (CCM)</td></tr><tr><td>Pénicilline&ndash ; streptomycine liquide (100&times ;)</td><td>15140-163</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Y27632 Inhibiteur de ROCK</td><td>1254</td><td>Anticorps Tocris</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488&ndash ; et Alexa Fluor 594&ndash ; anticorps secondaires conjugués</td><td>A32744 ; A32754 ; A-11076 ; A32790</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Brachyury(T)</td><td>ab20680</td><td>Abcam</td><td></td></tr><tr><td>Nephrin</td><td>GP-N2</td><td>Progen</td><td></td></tr><tr><td>OCT4</td><td>AF1759</td><td>R& D Systems</td><td></td></tr><tr><td>PAX2</td><td>71-6000</td><td>Invitrogen</td><td></td></tr><tr><td>WT1</td><td>MAB4234</td><td>Millipore</td><td></td></tr><tr><td>ECM Molecules</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>iMatrix-511 Fragment de laminine-E8 (LM-E8)</td><td>N-892012</td><td>Iwai Amérique du Nord</td><td>Matrice de membrane basale (BM) 2</td></tr><tr><td>Matrigel hESC Matrix, flacon de 5 mL</td><td>354277</td><td>BD Biosciences</td><td>Matrice de membrane basale (BM) 1. Peut présenter une variation d’un lot à l’autre</td></tr> <tr><td>< Enzymes et autres réactifs </forts>></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>A1110501</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>Solution de détachement cellulaire</td></tr><tr><td>BSA</td><td>A9418</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>D2438</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DMSO est toxique. Doit être manipulé dans une cagoule de sécurité chimique</td></tr><tr><td>Tampon de dissociation cellulaire sans enzyme, Hank' sel équilibré 13150016</td><td></td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’éthanol, 70 % (vol/vol), qualité biotechnologique</td><td>97065-058</td><td>L’éthanol VWR</td><td>est inflammable et toxique</td></tr><tr><td>FBS</td><td>431097</td><td>Corning</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (PFA)</td><td>28906</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>Le PFA doit être manipulé dans une hotte chimique avec un équipement de protection individuelle approprié, y compris des gants, une blouse de laboratoire et des lunettes de sécurité. Évitez l’inhalation et le contact avec la peau.</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>14190-250</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Eau distillée stérile</td><td>15230162</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>97062-208</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA, 0,05%</td><td>25300-120</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettes aspirantes, emballées individuellement</td><td>29442-462</td><td>Centrifugeuse Corning</td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-15R</td><td>B99516</td><td>Beckman Coulter</td><td></td></tr><tr><td>Tube à centrifuger conique, 15 mL</td><td>352097</td><td>Tube</td> à centrifuger conique Corning<td></td></tr><tr><td>, 50 mL</td><td>352098</td><td>Corning</td><td></td></tr><tr><td>Cryoboxes</td><td>3395465</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>Pour le stockage congelé aliquotes</td></tr><tr><td>EVOS M7000</td><td>AMF7000</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>Microscope fluorescent utilisé pour l’acquisition d’images de cellules iPS fixes et colorées et de leurs dérivés</td></tr><tr><td>Hémocytomètre</td><td>100503-092</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>Heracell VIOS 160i Incubateur CO2</td><td>51030403</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>Pour la culture et l’entretien de routine des cellules iPS et de leurs dérivés</td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer inversé équipé d’une caméra AxioCam 503</td><td>491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(caméra)</td><td>Microscopie Carl Zeiss</td><td>Utilisé pour acquérir des images en contraste de phase de cellules iPS vivantes et de leurs dérivés à chaque étape de la différenciation des podocytes</td></tr><tr><td>Gants en nitrile Kimberly-Clark</td><td>40101-346</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes, grand</td><td>21905-049</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes, petit</td><td>21905-026</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>P10 pointes de pipette barrière de précision</td><td>P1096-FR</td><td>Denville Scientific</td><td></td></tr><tr><td>P100 pointes de pipette barrière</td><td>P1125</td><td>Denville Scientific</td><td></td></tr><tr><td>P1000 pointes de pipette barrière</td><td>P1126</td><td>Denville Scientific</td><td></td></tr><tr><td>P20 pointes de pipette barrière</td><td>P1121</td><td>Denville Scientific</td><td></td></tr><tr><td>P200 pointes</td> <td>de pipette barrièreP1122</td> Pipette sérologique <td>Denville Scientific</td><td></td></tr><tr><td>, 10 mL, emballée individuellement</td><td>356551</td><td>Pipette</td> sérologique Corning<td></td></tr><tr><td>, 25 mL, emballée individuellement</td><td>356525</td><td>Pipette</td> sérologique Corning<td></td></tr><tr><td>, 5 mL, emballée individuellement</td><td>356543</td><td>Corning</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip, 0,22 &mu ; m, PES</td><td>SCGP00525</td><td>EMD Millipore</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation stériles</td><td>1138W14</td><td>Thomas Scientific</td><td>Pour l’aliquotage des facteurs de croissance</td></tr><tr><td>Culture tissulaire&ndash ; plaques traitées à 12 puits</td><td>353043</td><td>Corning</td><td></td></tr><tr><td>Culture tissulaire&ndash ; plaques à six puits traitées</td><td>353046</td><td>Corning</td><td></td></tr><tr><td>VWR blouse de laboratoire blanche</td><td>10141-342</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>Élévateur de cellules à large biseau</td><td>3008</td><td>Corning</td><td></td></tr></tbody></table>

différenciation guidée des podocytes rénaux matures à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme dans des conditions chimiquement définies

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Les maladies rénales touchent plus de 10 % de la population mondiale et coûtent des milliards de dollars en dépenses fédérales. Les formes les plus graves de maladie rénale et éventuellement d’insuffisance rénale terminale sont souvent causées par les dommages aux podocytes glomérulaires, qui sont les cellules épithéliales hautement spécialisées qui fonctionnent avec les cellules endothéliales et la membrane basale glomérulaire pour former la barrière de filtration du rein. Les progrès de la médecine rénale ont été entravés par la disponibilité limitée de tissus primaires et le manque de méthodes robustes pour la dérivation de cellules rénales humaines fonctionnelles, telles que les podocytes. La capacité de dériver des podocytes à partir de sources renouvelables, telles que les cellules souches, pourrait aider à faire progresser la compréhension actuelle des mécanismes du développement et de la maladie des reins humains, ainsi que fournir de nouveaux outils pour la découverte thérapeutique. L’objectif de ce protocole était de développer une méthode pour dériver des podocytes post-mitotiques matures à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPS) avec une efficacité et une spécificité élevées, et dans des conditions chimiquement définies. Les podocytes dérivés des cellules hiPS produits par cette méthode expriment des marqueurs spécifiques à la lignée (y compris la néphrine, la podocine et la tumeur de Wilm 1) et présentent les caractéristiques morphologiques spécialisées (y compris les processus primaires et secondaires du pied) associés aux podocytes matures et fonctionnels. Curieusement, ces caractéristiques spécialisées sont notamment absentes dans la lignée cellulaire podocytaire immortalisée largement utilisée dans le domaine, ce qui suggère que le protocole décrit ici produit des podocytes rénaux humains qui ont un phénotype plus mature sur le plan du développement que les lignées cellulaires podocytaires existantes généralement utilisées pour étudier la biologie rénale humaine.

L’objectif de ce protocole était de démontrer que les podocytes humains matures peuvent être dérivés de cellules hiPS dans des conditions chimiquement définies. Les données présentées dans ce manuscrit ont été générées en utilisant la lignée cellulaire DU11 hiPS17, qui a d’abord été testée et s’est avérée exempte de mycoplasmes. Une analyse chromosomique a également été effectuée et les cellules se sont avérées normales sur le plan caryotypique. En commençant par les cellules hiPS DU11 indifférenc...

Présenté ici est un protocole chimiquement défini pour la dérivation des podocytes rénaux humains à partir de cellules souches pluripotentes induites avec une efficacité élevée (>90%) et indépendant des manipulations génétiques ou de la sélection de sous-populations. Ce protocole produit le type de cellule souhaité dans les 26 jours et pourrait être utile pour les tests de néphrotoxicité et la modélisation de la maladie.

Différenciation guidée des podocytes rénaux matures à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme dans des conditions chimiquement définies

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Les protocoles de différenciation des cellules souches en cellules rénales fonctionnelles restent insaisissables. Cette méthode produit des podocytes matures avec spécificité et efficacité, fournissant de nouveaux outils pour l’étude des mécanismes des maladies rénales. Cette méthode utilise un milieu de culture cellulaire et des protéines de matrice extracellulaire avec une composition chimiquement définie pour produire des podocytes dérivés de cellules iPS humaines d’une grande pureté sans utiliser de sélection de sous-population ou de manipulation génétique.Les options thérapeutiques pour les patients atteints d’insuffisance rénale sont limitées. Cette méthode a des implications pour la modélisation et la compréhension des mécanismes de la maladie, ce qui pourrait faciliter le développement de nouveaux biomarqueurs et traitements. Pour mettre en place une culture humaine d’iPSC sans nourrisseur, aspirez la solution résiduelle de la matrice de membrane basale 1 à partir de plaques pré-enduites et lavez les puits trois fois avec un à deux millilitres par puits de milieu basal chauffé.Aspirez le milieu de culture cellulaire usagé d’une culture iPSC humaine et rincez les cellules trois fois avec un milieu réchauffé. Ajouter un millilitre de solution chaude de détachement cellulaire dans chaque puits pour une incubation d’une minute à 37 degrés Celsius. Après avoir confirmé les bords arrondis de la colonie cellulaire au microscope de culture tissulaire, aspirez rapidement la solution de décollement cellulaire et rincez doucement les cellules avec un milieu de culture cellulaire.Ajoutez trois millilitres de milieu de culture iPSC humain aux cellules souches pluripotentes induites par l’homme et utilisez un élévateur de cellules pour gratter les colonies. Pipetez doucement la suspension cellulaire pour déloger les cellules qui adhèrent lâchement et lavez soigneusement la plaque pour assurer la récolte de toutes les cellules. Transférez 500 microlitres de cellules dans chaque puits d’une nouvelle matrice de membrane basale, 1 plaque à six puits revêtue contenant deux millilitres de cellules souches pluripotentes induites par l’homme par puits et déplacez la plaque en huit pour répartir uniformément les colonies cellulaires dans les puits.Placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire, en rafraîchissant le milieu quotidiennement jusqu’à ce que les cellules atteignent environ 70 % de confluence. Si nécessaire, gratter aseptiquement les zones de différenciation avant d’aspirer le surnageant des puits. Après avoir lavé les puits trois fois, dissociez les cellules comme démontré et tirez les suspensions cellulaires résultantes dans un tube conique de 15 millilitres.Après le mélange par pipetage, porter le volume final dans le tube à 15 millilitres avec un milieu chaud et recueillir les cellules par centrifugation. Remettez la pastille en suspension dans un milieu frais pour une deuxième centrifugation et mettez les cellules en suspension dans un millilitre de milieu d’induction du mésoderme pour le comptage. Après le comptage, remettez les cellules en suspension à une fois 10 à la cinquième cellules par millilitre de concentration de milieu d’induction du mésoderme et aspirez la solution de matrice extracellulaire de la matrice de membrane basale 2 plaques revêtues.Rincez les plaques deux fois avec un milieu chaud et mélangez la suspension de cellules souches pluripotentes induite par l’homme avec un pipetage doux. Ajoutez un millilitre de cellules à chaque puits de la matrice de la membrane basale, 2 plaques revêtues de 12 puits et secouez doucement les plaques pour répartir les cellules plus uniformément. Placez ensuite la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire.Aux jours 2 à 15 de la différenciation, remplacez le milieu d’induction du mésoderme par un millilitre de milieu d’induction du mésoderme intermédiaire par puits. Si une croissance cellulaire importante et un épuisement rapide des nutriments sont observés, comme l’indique le jaunissement du milieu, le volume du milieu de différenciation intermédiaire du mésoderme peut être augmenté à 1,3 millilitre par puits. Au 16e jour de la culture, rincez les cellules intermédiaires du mésoderme avec un milieu chaud et incubez les cellules avec 500 microlitres de 0,05 % de trypsine EDTA par puits pendant trois minutes à 37 degrés Celsius.Lorsque les cellules commencent à se dissocier, grattez les cellules avec un lève-cellules et mélangez doucement les cellules par pipetage. Arrêtez la réaction avec environ deux millilitres de solution neutralisante de trypsine par puits et transférez les cellules dans un tube conique de 50 millilitres. Portez le volume à 50 millilitres avec un fluide et récupérez les cellules par centrifugation.Remettez la pastille en suspension dans un milieu d’induction de podocytes à une fois 10 à la cinquième cellules par millilitre de concentration de milieu et ajoutez les cellules à la matrice de membrane basale 2 plaques revêtues. Ensuite, secouez doucement la plaque pour aider à répartir les cellules plus uniformément et placez les cellules dans l’incubateur jusqu’à cinq jours. En utilisant la stratégie de culture démontrée, les cellules souches peuvent d’abord être différenciées en cellules mésodermiques qui expriment Brachyury, puis différenciées en cellules intermédiaires du mésoderme PAX2 positives, et finalement en podocytes glomérulaires rénaux matures.Les podocytes dérivés de cellules souches se colorent pour WT1, ainsi que pour la néphrine, marqueur d’identification de la lignée. Curieusement, la localisation subcellulaire de la néphrine se fait principalement dans les processus du pied podocytaire et le cytoplasme cellulaire, ce qui correspond à un phénotype de podocytes matures. Les cellules ensemencées à des densités qui dépassent significativement la densité recommandée de un fois 10 à la cinquième cellule par puits d’une plaque de 12 puits produisent de grands amas de cellules qui n’ont pas le phénotype morphologique attendu des podocytes matures dans la chronologie standard du protocole.L’ensemencement aux densités recommandées dans ce protocole permet cependant d’obtenir des cultures de cellules ayant la morphologie souhaitée. Nous recommandons d’utiliser la protéine de la membrane basale appropriée pour le détachement cellulaire et de maintenir la densité d’ensemencement cellulaire correcte pour l’induction du mésoderme et des podocytes. Cette méthode de différenciation des podocytes peut être intégrée à des systèmes microfluidiques d’organes sur puce ou à des technologies de bio-impression 3D pour développer des modèles fonctionnels du rein humain pour le dépistage de médicaments et les tests de néphrotoxicité.Le manque de modèles de culture cellulaire appropriés a entravé les progrès dans la compréhension des mécanismes des maladies rénales. Ce protocole fournit aux chercheurs une source inépuisable de podocytes dérivés de patients pour la modélisation de la maladie.

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Dans cette vidéo, nous décrivons le protocole permettant de dériver des podocytes de reins humains à partir de cellules souches pluripotentes induites par différenciation cellulaire dans des conditions chimiques définies. Les podocytes générés peuvent être utilisés pour les tests de néphrotoxicité et la modélisation de la maladie.

Dérivation de podocytes rénaux humains à partir de cellules souches pluripotentes induites : une procédure de différenciation dirigée de podocytes rénaux matures à partir de cellules souches

Nous décrivons ici un protocole pour générer des organoïdes rénaux à partir de cellules souches pluripotentes humaines (CSEh). Ce protocole génère des organoïdes rénaux en deux semaines. Les organoïdes rénaux qui en résultent peuvent être cultivés dans des flacons de spinner à grande échelle ou des plaques d’agitation magnétiques multi-puits pour des approches parallèles de test de drogues.

Une méthode simplifiée pour générer des organoïdes rénaux à partir de cellules souches pluripotentes humaines

Un protocole visant à concevoir un système personnalisé d’organe sur puce qui récapitule la structure et la fonction de la barrière de filtration glomérulaire rénal en intégrant des cellules endothéliales épithéliales et vasculaires génétiquement appariées différenciées des cellules souches pluripotentes induites par l’homme. Ce système de bio-ingénierie peut faire progresser la médecine de précision rénale et les applications connexes.

Puce de glomérule rénal isogénique conçue à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Ce manuscrit décrit un protocole en deux étapes pour générer des podocytes spécifiques au patient à partir de fibroblastes dermiques via une reprogrammation épisomique en cellules souches pluripotentes induites par l’homme (CSPhi) et une différenciation ultérieure en podocytes.

Génération de podocytes dérivés de patients à partir de biopsies cutanées

Ce protocole présente une méthode complète et efficace pour produire des organoïdes rénaux à partir de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) en utilisant des conditions de culture en suspension. L’objectif principal de cette étude réside dans la détermination de la densité cellulaire initiale et de la concentration d’agonistes WNT, ce qui profite aux chercheurs intéressés par la recherche sur les organoïdes rénaux.

Génération d’organoïdes rénaux en suspension à partir de cellules souches pluripotentes induites

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Microcapsules d&#39;alginate comme une plate-forme 3D pour la Propagation et différenciation des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) à différentes lignées

Ce protocole décrit le développement, l'expansion et l'imagerie in vivo des cellules NK dérivées de CSEh et iPSCs.

Le développement, l&#39;expansion et<em&gt; In vivo</em&gt; Suivi des cellules NK humaines à partir de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et et induit des cellules souches pluripotentes (CISP)

Les progéniteurs myogéniques dérivés de cellules souches pluripotentes induites (csps) sont des candidats prometteurs pour les stratégies de thérapie cellulaire visant à traiter les dystrophies musculaires. Ce protocole décrit la transplantation et les mesures fonctionnelles exigées pour évaluer l’engraftment et la différentiation des mesoangioblasts iPSC-dérivés (un type de progéniteurs de muscle) dans des modèles murins de régénération aiguë et chronique de muscle.

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Un protocole est présenté afin de préparer le polyvinyliques alcool-co-itaconique acides hydrogels avec raideur variable, qui ont été greffés avec et sans les oligopeptides, pour étudier l’effet de la rigidité des biomatériaux sur la différenciation et la prolifération des cellules souches. La rigidité des hydrogels était contrôlée par le temps de réticulation.

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Découvrez une méthode chimiquement définie pour différencier des podocytes matures à partir de cellules souches pluripotentes induites humaines avec une efficacité supérieure à 90% en 26 jours. Cette technique permet la modélisation de maladies rénales et les tests de néphrotoxicité.

Différenciation guidée des podocytes rénaux matures à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme dans des conditions chimiquement définies (Vidéo) | JoVE Journal

Différenciation guidée des podocytes rénaux matures à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme dans des conditions chimiquement définies

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