Modélisation des tumeurs osseuses primaires et des métastases osseuses avec implantation d’une greffe de tumeur solide dans l’os

Cette étude permet une flexibilité dans la création de tumeurs osseuses primaires ou de métastases osseuses en plaçant des greffes de tumeurs solides dans l’os. Cette technique s’écarte de l’injection de suspensions de cellules tumorales dans l’os. Cette méthode surmonte la limitation des injections de suspension de cellules tumorales pulmonaires.

Un autre avantage est de créer un modèle plus uniforme par rapport aux métastases osseuses spontanées ou après injection intravasculaire de cellules. Sur la base de l’implantation d’une greffe de tumeur solide, des possibilités existent au-delà des modèles humains ou murins, mais l’utilisation de xénogreffes dérivées du patient peut conduire à des thérapies adaptées à des patients spécifiques. L’objectif principal est d’être utilisé dans la recherche sur le cancer, comme le microenvironnement tumoral, les métastases, la découverte de médicaments, la génétique du cancer et la médecine de précision.

La démonstration visuelle est essentielle pour montrer les étapes clés de la création de la tumeur sous-cutanée, de la dissection et de la création de la greffe tumorale, et de l’implantation chirurgicale dans le tibia. Pour l’induction tumorale sous-cutanée, récoltez la lignée cellulaire d’intérêt à l’aide d’une solution de dissociation cellulaire appropriée et remettez les cellules en suspension à une à deux fois 10 à la cinquième cellule à une concentration de PBS stérile de 100 à 150 microlitres. Placez les cellules sur de la glace.

Nettoyez la peau exposée avec de l’éthanol à 70 % et chargez les cellules dans une seringue à la tuberculine équipée d’une aiguille de calibre 27. Injectez ensuite la cellule par voie sous-cutanée dans une région de peau désinfectée qui ne sera pas impactée par le mouvement des omoplates. Utilisez un pied à coulisse pour surveiller la taille de la tumeur sous-cutanée recouvrant le thorax dorsal ou l’abdomen, et mesurez le poids corporel de l’animal chaque semaine pour vous assurer que la tumeur ne s’ulcère pas ou que la souris ne répond pas aux critères d’élimination précoce établis par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux.

Lorsque la tumeur atteint 15 millimètres dans n’importe quelle dimension, utilisez de l’éthanol à 70 % pour stériliser la peau et utilisez un scalpel à 15 pour inciser la peau recouvrant la tumeur. Utilisez des ciseaux chirurgicaux stériles pour disséquer brusquement la tumeur des tissus mous environnants et placez la tumeur dans un puits d’une plaque à six puits contenant un milieu de croissance complet. Utilisez le scalpel pour hacher la tumeur en fragments de taille appropriée et placez les fragments dans un nouveau récipient de milieu de croissance complet stérile à température ambiante.

Pour la cryoconservation, mettez en commun plusieurs fragments dans un seul cryoflacon dans un milieu de croissance complet complété par 20 % de sérum de veau fœtal et 10 % de sulfoxyde de diméthyle et utilisez un système de cryoconservation commercial à moins 80 degrés Celsius pour congeler progressivement le tissu avant un stockage à long terme dans de l’azote liquide. Pour conserver les fragments de tumeur en vue d’une analyse ultérieure mais pas d’une implantation future, congelez les échantillons par immersion dans de l’azote liquide et stockez les fragments de tumeur congelés à long terme à moins 80 degrés Celsius. Pour l’implantation sous-cutanée de fragments de tumeur, amenez d’abord la suspension de fragments de tumeur à température ambiante.

Ensuite, confirmez une absence de réponse au réflexe de pédale chez une souris receveuse anesthésiée et administrez l’analgésie par voie sous-cutanée. Pour minimiser le traumatisme potentiel de la peau, utilisez une crème épilante pour enlever les poils sur l’articulation du genou droit et le tibia proximal de la patte arrière connectée. Frottez la peau exposée avec de l’éthanol à 70 %, puis alternez les gommages à la chlorhexidine et au sérum physiologique.

Tout en fléchissant et en étendant l’articulation, visualisez le tibia proximal comme la région juste distale de l’articulation du genou et utilisez une lame de scalpel de 15 pour créer une incision de trois à quatre millimètres au niveau du tibia proximal sur la face médiale du membre à travers la peau et le tissu sous-cutané pour exposer le cortex médial du tibia proximal. Pour créer un petit trou dans le cortex médial du tibia proximal, utilisez la pointe d’une aiguille de calibre 25 pour appliquer une légère pression tout en tournant la pointe d’environ deux millimètres distale de l’articulation du genou et à égale distance entre les cortex tibial crânien et caudal. Lorsque le trou a été créé, utilisez une pince stérile ou une aiguille de calibre 27 à 30 pour insérer un minimum de fragments de tumeur de 0,5 millimètre cube dans la cavité médullaire du tibia proximal et utilisez une aiguille de calibre 27 à 30 pour manipuler les fragments de tumeur dans le canal médullaire.

Après avoir placé tous les fragments, opposez les bords de la peau avec le matériau approprié et remettez l’animal dans sa cage avec surveillance jusqu’à la déambulation. Ensuite, évaluez la croissance de la tumeur tibiale de manière non invasive par radiographie numérique hebdomadaire, imagerie par bioluminescence ou par fluorescence, et utilisez des pieds à coulisse pour mesurer le membre au site d’implantation. La réussite de la greffe peut être documentée à l’aide d’une imagerie avancée.

Dans cette analyse représentative, le défaut cortical créé pour l’implantation de la greffe tumorale était visible dans le tibia proximal une semaine après l’implantation. À la deuxième semaine, une ostéolyse visible et un remodelage osseux adjacent au défaut cortical ont pu être observés. De la deuxième à la cinquième semaine, une destruction osseuse progressive supplémentaire et la formation de nouveaux os associés à la greffe et à la croissance tumorales se sont produites.

Des précautions doivent être prises lors de la création d’un petit trou dans le tibia proximal. Comptez sur la rotation de la pointe avec une pression douce à minimale pour permettre à la pointe de l’aiguille de faire le travail. À la suite de cette procédure, le placement d’une greffe tumorale dans d’autres sites osseux, le placement d’organoïdes ou de cellules tumorales dans la matrice extracellulaire dans le défaut osseux ou l’analyse moléculaire et histologique en plus de l’imagerie peuvent être effectués.