Automatisation des mesures de microscope à force bioatomique sur des centaines de cellules de C. albicans

L’automatisation du microscope à force atomique est une innovation clé dans l’évolution de la technologie vers des applications biomédicales. Il ouvre également l’accès à l’étude des propriétés biomécaniques des populations cellulaires. Notre méthode permet d’enregistrer des mesures AFM pour 1 000 cellules en quatre heures, par rapport aux méthodes habituelles, qui prennent quatre heures pour mesurer 10 cellules, c’est vraiment un gain de temps significatif.

Si l’automatisation est une condition préalable à l’introduction de cette technologie dans les laboratoires hospitaliers, ce protocole de validation de principe suggère son potentiel d’utilisation dans le développement de stratégies de diagnostic médical spécifiques. Ce protocole utilise une tige PDMS polyvalente qui peut être remplie de divers microbes permettant d’explorer différents systèmes. Pour préparer le tampon PDMS, mélanger 55 grammes de solution pré-polymère PDMS à un rapport de masse de 10 à un dans des PDP, des oligomères et un agent de durcissement et dégazer la solution résultante sous vide à un moment donné 10 à la négative une à une fois 10 à négative deux barres pendant cinq à 10 minutes.

Lorsque toutes les bulles de pièges ont été enlevées, versez 20 grammes de la solution dégazée sur un moule maître en silicium sur une épaisseur de deux à trois millimètres et dégazez à nouveau. Lorsque toutes les bulles ont été enlevées, réticulez le PDMS à 80 degrés Celsius pendant une heure et utilisez un scalpel pour couper le tampon microstructuré PDMS parallèlement aux réseaux de microstructures visibles. Ensuite, épluchez le tampon du moule maître en silicium et placez le site de la microstructure du timbre sur une lame de verre avec les microstructures alignées sur le côté de la lame.

Pour préparer les cellules pour l’appareil, centrifugez 600 microlitres de la suspension cellulaire d’intérêt et ajoutez 200 microlitres du surnageant sur le tampon. Dégazer le surnageant sous vide pendant environ 40 minutes. Lorsque toutes les bulles ont été enlevées, remplacez le surnageant de la surface PDMS par 200 microlitres de la solution cellulaire remise en suspension pour une incubation de 15 minutes à température ambiante.

Pour charger les cellules dans les microstructures du timbre, utilisez une lame de verre maintenue à un angle de 30 à 50 degrés pour répartir les cellules à travers le timbre dans les deux sens, plusieurs fois si nécessaire. Lorsqu’un taux de remplissage élevé des microstructures a été atteint, utilisez une pipette pour retirer la suspension cellulaire et lavez les trois fois avec un millilitre de tampon acétate par lavage pour éliminer les cellules non piégées. Après le dernier lavage, utilisez le flux d’azote pour sécher le dos de l’échantillon et placez le tampon dans une boîte de Pétri.

Ajoutez ensuite deux millilitres de tampon acétate frais au plat. Pour la microscopie à force atomique des cellules, placez la boîte sur l’étage du microscope à force atomique et centrez l’étape à zéro à zéro. Lorsque l’étape a été centrée, déplacez la boîte dans le porte-boîte de Petri au microscope et alignez le bord du tampon de manière à ce qu’il soit perpendiculaire à l’axe y du porte-boîte de Petri.

Placez ensuite la tête de force du microscope atomique sur la scène, en prenant soin que les moteurs pas à pas soient suffisamment étendus pour éviter que la pointe ne s’écrase sur le tampon. Pour l’imagerie, utilisez les boutons du microscope pour centrer la pointe du microscope à force atomique sur le coin gauche des puits de micromètres de 4,5 par 4,5 au carré et sélectionnez le mode de cartographie de la force dans le logiciel du microscope. Pour définir une carte de force de 64 par 64 sur une zone de 100 par 100 micromètres, définissez le point de jeu relatif sur trois à cinq nano Newtons, la longueur Z sur quatre micromètres, le mouvement Z sur une durée constante, le temps d’extension à 0,01 seconde, le délai d’extension à zéro, le retard de rétraction à zéro, le mode de retard à force constante , le taux d’échantillonnage jusqu’à 2048 Hertz.

Décochez Z boucle fermée et vérifiez l’image carrée. Réglez l’accès rapide sur 100 micromètres, l’axe lent sur 100 micromètres, le décalage X sur zéro micromètre, le décalage Y sur zéro micromètre, l’angle de grille à zéro degré, les pixels à 64 par 64 et le rapport de pixels à un à un. Ensuite, ouvrez le logiciel d’automatisation.

Dans la fenêtre contextuelle, sélectionnez le chemin d’accès au fichier de script. Entrez la coordonnée W1 dans la ligne 239 de la variable P1 de la section de la zone d’entrées du script gyfon et la valeur de coordonnée W2 dans la ligne 241 de la variable P2. Attribuez la valeur de hauteur à la variable de hauteur ligne 245 du script et entrez la dimension du puits, qui peut être déterminée à partir de la conception des motifs de puits dans la ligne variable W-S 248.

Écrivez le chemin d’accès au répertoire de sauvegarde à la ligne 251 pour enregistrer les données à l’endroit souhaité et définissez la ligne de variable de surface totale 254 sur le désir à plusieurs extrémités des 100 micromètres. Ensuite, définissez la ligne de matrice des courbes de force et la colonne enregistrées par puits dans la ligne variable de balayages de nombre 257 et cliquez sur exécuter pour démarrer le programme. Pour analyser les données, utilisez le logiciel de code de studio vidéo pour ouvrir le script Python et exécuter le script Python des fichiers de copie pour organiser les fichiers de courbe de force dans un dossier.

Entrez le chemin d’accès au dossier général dans lequel les données seront stockées. pour analyser les courbes de force, ouvrez le logiciel de traitement de données du fabricant du microscope à force atomique. Dans le menu Fichier, sélectionnez lot de courbes de spectroscopie.

Ensuite, sélectionnez le fichier et le processus de chargement, puis sélectionnez le processus de rigidité. Sélectionnez la dernière étape du processus et cliquez sur conserver et appliquer à tous afin que toutes les courbes de force reçoivent le même traitement. Pour ouvrir le script R, chargez les fichiers contenant les informations extraites avec le logiciel de traitement des données dans le logiciel R studio.

Dans la fenêtre d’environnement, cliquez sur Importer le jeu de données et, à partir du lecteur de texte dans la fenêtre contextuelle, cliquez sur Parcourir pour localiser le fichier TSV à points. Une fois le fichier chargé, sélectionnez la région d’exécution du code et exécutez tout pour exécuter tout le code. Ici, des histogrammes typiques obtenus utilisant le protocole tel que démontré sont montrés.

Dans cette analyse, la répartition de rigidité a été enregistrée sur 957 cellules indigènes, Tandis que dans cette analyse, la rigidité de 574 cellules traitées caspofungin ont été mesurées. Sachez que l’utilisation de centaines de cellules permet d’observer une distribution bimodale des valeurs. Dans les échantillons plus petits, une distribution unique est généralement observée et peut entraîner un manque d’observation de l’hétérogénéité de la population.

Une comparaison des deux conditions met en évidence les effets de Caspofungin sur la réduction de la rigidité cellulaire. A révélé par la comparaison d’ANOVA des cellules natives et traitées, les deux conditions présentent des rigidités fortement, significativement différentes. Cette valeur a été atteinte en raison du grand nombre de cellules analysées, offrant une plus grande confiance dans les résultats obtenus.

L’ajout du surnageant au tampon PDMS avant de rincer à plusieurs reprises les cellules dans les puits jusqu’à ce que le tampon soit plein est essentiel au succès de l’analyse. Dans cette preuve de concept, des cellules albicans de Candida ont été analysées mais le protocole peut être appliqué à n’importe quel groupe de cellules de modèle, molécules, ou matériaux.