Name: Fabrication d’une nanomatrice biomimétique avec nanotubes de base Janus et fibronectine pour l’adhérence aux cellules souches (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-10T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Découvrez l'assemblage d'une nanomatrice biomimétique avec des nanotubes de base Janus et de la fibronectine pour favoriser l'adhérence des cellules souches mésenchymateuses humaines. Cette méthode offre un potentiel prometteur pour la réparation osseuse.

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Ces travaux sont soutenus financièrement par les NIH (Grants 1R01AR072027-01, 1R03AR069383-01), NSF Career Award (1653702) et l’Université du Connecticut.

1. Synthèse des JBNT
REMARQUE : Le monomère JBNT a été préparé tel qu’il a étépublié précédemment 11.
<ol><li>Synthèse du composé A1<ol>
<li>Préparer une solution contenant 8,50 g d’acide 2-cyanoacétique et 9,80 g d’éthylcarbamate dans 25 mL de toluène et 2,5 mL de N, N-diméthylformamide. Ajouter 4,90 mL de chlorure de phosphoryl dans le sens de la goutte. Chauffer ensuite le mélange à 70 °C et continuer à remuer pendant 1,5 h.</li>
		<li>Refroidir le mélange de réaction à température ambiante et verser 100 g d’eau glacée. Extraire la couche aqueuse avec de l’acétate éthylique (3 x 250 mL) et laver avec 100 mL de saumure. Séchez la couche organique sur du sulfate de sodium anhydre, filtrez et évaporez les substances volatiles sous vide pour obtenir un solide jaune pâle.</li>
		<li>Soumettez le solide jaune à la chromatographie de colonne flash de gel de silice (3% méthanol/dichloromethane) pour produire 15.61 g de composé A1 comme poudre blanche.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthèse du composé A2<ol>
<li>Mélanger 3,12 g de composé A1 et 2,75 g de carbonate de potassium dans 50 mL de N, N-diméthylformamide. Remuer à température ambiante pendant 2 h.</li>
		<li>Ajouter 2,6 mL de disulfide de carbone à la suspension de réaction. Continuer à remuer pendant 4 h.</li>
		<li>Ajouter l’éthanol absolu au mélange de réaction à 0 °C. Filtrer le jaune et laver avec de l’éther de déthyle. Sécher sous vide pendant la nuit pour produire 6,18 g de composé A2 comme solide jaune pâle.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthèse du composé A3<ol>
<li>Ajouter 2,7 mL d’iodure de méthyle dans 15 mL d’acétyltrile. En outre, préparer séparément une solution de composé A2 en ajoutant 6,18 g d’A2 à 80 mL d’eau / acétyltrile (7:3 ratio). Mélanger les deux solutions et remuer à température ambiante pendant 30 min.</li>
		<li>Chauffer le mélange de réaction à 95 °C et continuer à remuer pendant 3 h.</li>
		<li>Refroidir le mélange de réaction à température ambiante, puis évaporer les substances volatiles sous vide.</li>
		<li>Extraire les résidus 3x avec 100 mL d’acétate d’éthyle et laver avec de la saumure. Séchez la couche organique sur du sulfate de sodium anhydre, filtrez et évaporez les substances volatiles sous vide pour obtenir un solide jaune.</li>
		<li>Soumettez le solide jaune à la chromatographie de colonne flash de gel de silice (30% acétate d’éthyle/hexanes) pour donner 4.52 g du composé A3 comme solide jaune clair.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthèse du composé A4<ol>
<li>Préparer la solution d’allylamine en ajoutant 925 μL d’allylamine dans 20 mL d’éthanol. Ajoutez cette solution dropwise à la solution du composé A3, préparé en ajoutant 3,14 g d’A3 dans 75 mL d’éthanol absolu, plus de 30 min. Ensuite, chauffer le mélange de réaction au reflux pendant 16 h.</li>
		<li>Refroidir le mélange de réaction à température ambiante et évaporer les substances volatiles pour donner un solide jaune.</li>
		<li>Soumettez le solide jaune à la chromatographie de colonne flash de gel de silice (50% acétate d’éthyle/hexanes à 2% méthanol/dichloromethane) pour produire 1,80 g d’A4 composé comme cristal blanc.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthèse du composé A5<ol>
<li>Ajouter 2,05 g d’hydrochlorure de guanidinium et 7,8 mL d’éthoxide de sodium (21 wt % en éthanol) dans 14 mL d’éthanol absolu. Chauffer le mélange à 45 °C pendant 15 min.</li>
		<li>Filtrer le matériau insoluble et ajouter le filtrate directement dans la solution du composé A4, préparé en ajoutant 2,70 g d’A4 dans 40 mL d’éthanol absolu. Chauffer le mélange de réaction au reflux pendant 16 h.</li>
		<li>Filtrer le précipité pour obtenir 2,65 g de composé A5 comme un solide blanc éteint.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthèse du composé A6<ol>
<li>Ajouter 24,9 mL de triethylamine lentement au mélange de boue obtenu en ajoutant 2,11 g de composé A5 et 1,10 g de 4-Dimethylaminopyridine dans 120 mL de tétrahydrofuran sur 1 min. Remuer à température ambiante pendant 2 min.</li>
		<li>Ajouter 20,7 mL de di-tert-butyl dicarbonate dropwise au mélange de réaction et continuer à remuer à température ambiante pendant 40 h.</li>
		<li>Ajouter 20 mL d’eau pour étancher la réaction. Évaporer les volatiles sous vide.</li>
		<li>Extraire les résidus visqueux rouges avec 500 mL d’acétate d’éthyle. Ensuite, lavez-le avec 250 mL d’eau, 75 mL d’acide citrique à 10 %, 2x avec 200 mL d’eau, 200 mL de bicarbonate de sodium saturé et 200 mL de saumure. Séchez la couche organique sur du sulfate de sodium anhydre, filtrez et évaporez les substances volatiles sous vide pour donner un solide rouge/orange.</li>
		<li>Soumettez la chromatographie de colonne flash de gel de silice (0-20% acétate d’éthyle/hexanes) pour produire 3.87 g de composé A6 comme mousse blanche.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthèse du composé A7<ol>
<li>Ajouter l’oxyde N-méthylmorpholine N (50 wt.% dans l’eau, 1,64 mL) dans le sens de la goutte à la solution du composé A6 (2,93 g) dans l’acétone/eau (8:1, 58,5 mL) et remuer à température ambiante pendant 5 min.</li>
		<li>Ajouter le tétraoxyde d’osmium (solution 4% aqueuse) dans le sens de la goutte au mélange sur une période de 3 min et continuer à remuer à température ambiante pendant 24 h.</li>
		<li>Étanchez la réaction avec du sulfite de sodium aqueux de 1,0 M jusqu’à ce que la solution devient incolore. Retirer les substances volatiles sous vide pour obtenir une boue blanche dans l’eau. Extraire les résidus avec 350 mL de dichloromethane, puis laver avec 150 mL d’eau suivie d’un lavage avec 150 mL de saumure.</li>
		<li>Séchez la couche organique sur du sulfate de sodium anhydre, filtrez et évaporez les substances volatiles sous vide pour produire 2,45 g de composé A7 comme solide blanc.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthèse du composé A8<ol>
<li>Ajouter 760 g de paréide de sodium au mélange de 1,36 g de composé A7 dans 35 mL de dichlorométhane/eau (6:1, 35 mL) et remuer à température ambiante pendant 42 h.</li>
		<li>Filtrer le matériau insoluble et concentrer le filtrate sous vide. Extraire les résidus qui en résultent avec 250 mL de dichloromethane, puis laver avec 100 mL d’eau et 100 mL de saumure. Séchez la couche organique sur le sulfate de sodium anhydre, filtrez et évaporez les substances volatiles sous vide pour donner au produit brut.</li>
		<li>Soumettez le produit brut à la chromatographie de colonne flash de gel de silice (5-40% acétate d’éthyle/hexanes, puis 5% méthanol/dichloromethane) pour produire 1.08 g de composé A8.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthèse du composé A9<ol>
<li>Préparer une solution de 830 mg de composé A8 dans 15 mL de 1,2-dichloroéthane. Ajouter la solution de dropwise au mélange de 6-benzyloxycarbonylamino-2-L-amino-hexanoic acide trimethylsilyl ethyl ester (649,5 mg) et N,N-diisopropylethylamine (591 μL) en 24 mL de 1,2-dichloroéthane sur 3 min et remuer à température ambiante pendant 15 min.</li>
		<li>Ajouter 360,3 mg de triacetoxyborohydride de sodium à la solution et continuer à remuer à température ambiante pendant 24 h.</li>
		<li>Étancher le mélange de réaction avec 6 mL d’eau. Extraire le mélange de réaction 3x avec 200 mL de dichloromethane et laver avec 200 mL d’acide citrique à 10% dans l’eau, 2x avec 200 mL d’eau, 200 mL de bicarbonate de sodium saturé, et 200 mL de saumure dans cet ordre. Séchez la couche organique sur du sulfate de sodium anhydre, filtrez et évaporez les substances volatiles sous vide pour obtenir le produit brut.</li>
		<li>Soumettez le produit brut à la chromatographie de colonne flash de gel de silice (5-30% acétate d’éthyle/hexanes) pour produire 885 mg composé A9.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthèse du monomère JBNT<ol>
<li>Dissoudre 0,54 g de composé A9 (0,54 g) dans 10 mL de solution d’acide trifluoroacétique/thioanisole à 94 % et remuer à température ambiante pendant 72 h.</li>
		<li>Ajouter l’éther de déthyle (80 mL) au mélange de réaction et centrifugeuser le précipité vers le bas. Verser l’acide trifluoroacétique clair contenant du supernatant et laver le précipité blanc avec de l’éther de diéthyle et du méthanol pour produire 168,6 mg brut de monomère JBNT(Dossier supplémentaire 1).</li>
		<li>Purifiez le monomère brut JBNT par une chromatographie liquide haute performance (HPLC) avec une colonne de phase inverse. Le programme d’isolement est énuméré ci-dessous : Solvant A : 100 % eau; solvant B: 100% acétyltrile; solvant C : solution d’eau pH=1 HCl; débit : 3 mL/min (voir le tableau 1).</li>
		<li>Recueillir le plus grand pic à environ 7,2 min.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Fabrication pour JBNT/FN
<ol><li>Ajouter 80 μL de solution aqueuse JBNT de 1 mg/mL à 40 μL de solution aqueuse FN de 1 mg/mL et pipette à plusieurs reprises.</li>
	<li>Vérifiez la présence d’une suspension solide blanche après le pipetage pendant environ 10 s. REMARQUE : Une vidéo a été tournée pour capturer le processus d’auto-assemblage de NM (Fichier supplémentaire 2).</li>
</ol>3. Observation de spécimens lyophilisés
REMARQUE : Cette étape est effectuée pour montrer la structure de l’échafaudage de NM fabriqué à partir de JBNTs et FN.
<ol><li>Préparer les solutions FN, JBNT et FN/JBNT NM pour l’observation des matériaux lyophilisés. Diluer 10 μL de 100 μg/mL de FN avec 40 μL d’eau distillée pour faire une solution de 20 μg/mL de FN.</li>
	<li>Préparer une solution de 100 mg/mL de JBNTs en diluant 5 μL de 1 mg/mL de JBNTs dans 45 μL d’eau DI.</li>
	<li>Mélanger 10 μL de 100 μg/mL FN et 5 μL de 1 mg/mL de JBNTs dans 35 μL d’eau DI pour former la solution NM.</li>
	<li>Enduire trois puits de microplaques rondes rondes de 96 puits avec la solution FN, JBNT et NM, respectivement. Chaque puits reçoit 50 μL de la solution.</li>
	<li>Effectuez la lyophilisation, comme décrit ci-dessous, pour visualiser la structure de l’échafaudage du NM.<ol>
<li>Congeler la plaque à -80 °C pendant la nuit.</li>
		<li>Allumez l’instrument lyophilisé et la pompe à vide.</li>
		<li>Appuyez sur le bouton de refroidissement pour réduire la température du système à -50 °C.</li>
		<li>Mettez la plaque congelée dans l’instrument lyophilisé et fermez toutes les ouvertures des instruments.</li>
		<li>Cliquez sur le bouton de démarrage pour réduire la pression du système à 0,9 mbar.</li>
		<li>Après 4 h, appuyez sur le bouton aération et ouvrez la vanne pour augmenter la pression du système sur la pression atmosphérique.</li>
		<li>Sortez la plaque de l’instrument lyophilisé.</li>
		<li>Utilisez un microscope pour observer le FN, les JBNT et le NM auto-assemblé qui en résulte. Prenez plusieurs photos avec un appareil photo pour les matériaux.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Mesure des spectres d’absorption
REMARQUE : Utilisez le changement de spectre pour les FN et les JBNT pour présenter le JBNT/FN NM12 auto-assemblé.
<ol><li>Mélanger 30 μL de 100 μg/mL FN avec 15 μL d’eau distillée et 5 μL de 1 mg/mL de JBNTs pour préparer la solution JBNT/FN NM. Suspension solide blanche peut être vu après pipetting la solution à plusieurs reprises. REMARQUE : Les concentrations finales de JBNTs et de FN dans la solution sont respectivement de 100 μg/mL et de 60 μg/mL. Les solutions JBNT et FN à la même concentration que celle utilisée dans la solution NM ont également été préparées comme solutions de contrôle.</li>
	<li>Diluer 5 μL de 1 mg/mL de JBNTs avec 45 μL d’eau distillée pour préparer la solution de contrôle JBNT.</li>
	<li>Diluer 30 μL de 100 μg/mL FN avec 20 μL d’eau distillée pour préparer la solution de contrôle des FN.</li>
	<li>Mesurer les spectres d’absorption uv-vis des solutions FN, JBNT et JBNT/FN NM avec le spectrophotomètre (voir tableau des matériaux)pour caractériser l’assemblage de NM.<ol>
<li>Cliquez sur le bouton UV-Vis. Nettoyez la surface d’essai du spectrophotomètre et laissez tomber 2 μL d’eau distillée dessus. Mesurez-le comme blanc de 190-850 nm.</li>
		<li>Nettoyez la surface d’essai du spectrophotomètre et déposez 2 μL de solution FN dessus. Mesurer les spectres d’absorption UV-Vis de la solution FN de 190 nm à 850 nm.</li>
		<li>Nettoyez la surface d’essai du spectrophotomètre et déposez 2 μL de solution JBNT dessus. Mesurer les spectres d’absorption de la solution JBNT de 190 nm à 850 nm.</li>
		<li>Nettoyez la surface d’essai du spectrophotomètre et déposez 2 μL de solution JBNT/FN NM dessus. Mesurer les spectres d’absorption de la solution JBNT/FN NM de 190 nm à 850 nm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Préparation de JBNT/FN NM pour la microscopie électronique de transmission (TEM)
<ol><li>Nettoyez plusieurs grilles avant de les colorer négativement avec un nettoyeur plasma de base (voir tableau des matériaux).</li>
	<li>Effectuez la coloration négative pour les spécimens suivant deux processus différents.<ol>
<li>Déposer 3 μL de 1 mg/mL de solution aqueuse JBNTs et 3 μL de solution JBNT/FN NM sur les grilles séparées et la laisser pendant 2 minutes. Rincez ensuite chaque grille avec 100 μL de solution d’acétate d’uranyle (UA) de 0,5 %. Égoutter l’excès de solution avec du papier filtre et sécher à l’air les grilles.</li>
		<li>Mélangez 9 μL de solution JBNT/FN NM avec 3 μL de solution UA à 2,0 % et pipette à plusieurs reprises. Pipette la solution mixte sur les grilles et le garder sur les grilles pendant 2 min. Utilisez un papier filtre pour enlever la solution mixte des grilles et sécher les grilles à température ambiante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enfin, caractérisez le spécimen pour JBNTs, JBNT/FN NM taché de l’étape 5.2.1, et JBNT/FN NM taché avec l’étape 5.2.2 avec le TEM.</li>
</ol>6. Analyse de la fonction biologique in vitro
<ol><li>Ajouter 200 μL de contrôles négatifs (NC, PBS), JBNTs, FN et les solutions JBNT/FN NM dans un puits d’une diapositive de 8 puits, respectivement.</li>
	<li>Congelez le verre de couverture 8 bien chambé avec l’instrument lyophilisé pour enduire les matériaux au fond des puits. Le protocole de séchage au gel est le même que l’étape 3.5.</li>
	<li>Ajoutez ensuite 10 000 cellules/puits hMSCs (Passage 3) dans les puits et incubez-les pendant 24 h à 37 °C avec 5 % de CO2.</li>
	<li>Après l’incubation, pipette le milieu de culture cellulaire des puits et rincer la culture avec 1x solution PBS.</li>
	<li>Ajouter 100 μL de la solution fixative à chaque puits avec des cellules et laisser pendant 5 min. Rincer délicatement les cellules avec 1x PBS deux fois.</li>
	<li>Diluer 1% Triton-X 100 à 0,1%. Ajouter 100 μL de 0,1% Triton-X 100 à chaque puits avec des cellules et laisser pendant 10 min. Rincer délicatement les cellules avec 1x PBS deux fois.</li>
	<li>Diluer la rhodamine phalloidine à 1,65 μM. Ajouter 100 μL de rhodamine phalloidine à chaque puits avec des cellules et incuber le verre de couverture chambé à l’abri de la lumière à température ambiante pendant 30 min. Rincer délicatement les cellules avec 1x PBS deux fois.</li>
	<li>Capturez les images cellulaires à l’aide d’un microscope fluorescent.</li>
	<li>Comptez les numéros de cellule sur les images fluorescentes pour chaque groupe. Calculer la densité d’adhérence cellulaire en moyenne de trois zones aléatoires dans chaque puits.</li>
	<li>Présenter toutes les données comme moyen ± écart type (DD). Effectuer des analyses statistiques à l’aide d’un t-test à une queue, suivi de l’analyse de la variance (ANOVA) avec p<0,05, qui est considéré comme statistiquement significatif.</li>
</ol>

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<li>Do, A. V., Khorsand, B., Geary, S. M., Salem, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Printing+of+scaffolds+for+tissue+regeneration+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">3D Printing of scaffolds for tissue regeneration applications.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (12), 1742-1762 (2015).</li>
<li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structurally+and+functionally+optimized+silk-fibroin-gelatin+scaffold+using+3D+printing+to+repair+cartilage+injury+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Material%22%5BJournal%5D)">Structurally and functionally optimized silk-fibroin-gelatin scaffold using 3D printing to repair cartilage injury in vitro and in vivo.</a> Advanced Material. 29, 1701089(2017).</li>
<li>Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+inflammatory+activation+by+self-assembling+Rosette+nanotubes+in+human+Calu-3+pulmonary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Low inflammatory activation by self-assembling Rosette nanotubes in human Calu-3 pulmonary epithelial cells.</a> Small. 4 (6), 817-823 (2008).</li>
<li>Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rosette+nanotubes+show+low+acute+pulmonary+toxicity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Rosette nanotubes show low acute pulmonary toxicity in vivo.</a> International Journal of Nanomedicine. 3 (3), 373-383 (2008).</li>
</ol>

Le Dr Yupeng Chen est cofondateur de NanoDe Therapeutics, Inc.

Dans cette étude, nous avons développé un NM biomimétique auto-assemblé, qui a été formé avec des JBNTs inspirés de l’ADN et fn. Lors de la préparation de la solution JBNT, la poudre lyophilisée JBNT devrait être dissoute dans l’eau au lieu de PBS parce que PBS provoquera l’agglomération de JBNTs, ce qui inhibe leur assemblage. En outre, le NM devrait également être assemblé dans l’eau si nous voulons observer les structures nano-fibriles du NM, parce que le sel dans PBS se regroupera avec des fibres NM, ce qui peut rédu...

Les cellules souches mésenchymales humaines (HMSCs) ont montré le potentiel d’auto-renouvellement et d’auto-différenciation le long de différentes lignées mésenchymales, ce qui contribue à la régénération et à l’entretien destissus 1. Basé sur le potentiel de différenciation, hMSCs sont considérés comme candidats pour des dommages mésenchymal de tissu et thérapie hématopoieticde désordre 2. HMSCs ont montré la capacité de favoriser la guérison des plaies en augmentant la réparation des tissus, l’angiogenèse, et la réduction de l’inflammation3. Toutefois, sans l’aide biochimique ou biomatériaux, l’efficacité pour les HMC d’atteindre un tissu cible et de fonctionner à l’endroit désiré est faible4. Bien que divers échafaudages d’ingénierie aient été utilisés pour attirer les HMSC à adhérer aux lésions, certains sites tels que la rupture de plaque de croissance, au milieu d’un os long, ne sont pas facilement accessibles par les échafaudages préfabriqués conventionnels, qui peuvent ne pas s’adapter parfaitement dans un emplacement blessé irrégulièrement formé.
Ici, nous avons développé un nanomatériau biomimétique qui peut s’auto-assembler in situ et être injecté dans une zone cible difficile à atteindre. Le bio-échafaudage injectable NM est composé de nanotubes de base Janus (JBNTs) et de fibronectine (FN). JBNTs, également connu sous le nom nanotubes rosette (RNTs), sont dérivés de paires de base d’ADN, en particulier la thymine et l’adénine,ici 5,6,7. Comme on le voit dans la figure 1, les nanotubes sont formés lorsque six molécules des paires de base d’ADN dérivées s’auto-assemblent par liaisons hydrogène pour former unplan 6. Six molécules sont ensuite empilées les unes sur les autres dans un plan via une forte interaction pi-empilage7, qui peut être jusqu’à 200-300 μm de longueur. Les JBNTs sont conçus pour imiter morphologiquement les fibres de collagène afin que FN réagisse avec eux.
Le FN est une glycoprotéine adhésive à poids moléculaire élevé, que l’on retrouve dans la matrice extracellulaire (ECM)9. Ceux-ci peuvent jouer un rôle de médiateur dans l’attachement des cellules souches à d’autres composants de l’ECM, en particulier lecollagène 10. Nous avons conçu des JBNTs pour imiter morphologiquement les fibres de collagène afin que FN puisse réagir avec eux pour former NM en quelques secondes par liaison noncovalente. Par conséquent, NM est un bio-échafaudage prometteur à injecter dans un site de fracture osseuse qui ne pouvait pas être accessible par les échafaudages fabriqués de façon conventionnelle. Ici, le NM injectable présente une excellente capacité à améliorer l’ancrage hMSC in vitro, présentant leur potentiel à servir d’échafaudage pour la régénération des tissus.

<table><tbody><tr><td>1,2-dichloroéthane</td><td>Alfa Aesar</td><td>39121</td><td></td></tr><tr><td>Acide 2-cyanoacétique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C88505</td><td></td></tr><tr><td>4-Diméthylaminopyridine</td><td>TCI America</td><td>D1450</td><td></td></tr><tr><td>8 puits Couverture à chambre</td><td>Thermo Fisher</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>Plaque à 96 puits</td><td>Corning</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>éthanol</td> <td>absoluThermo Fisher</td><td>BP2818500</td><td></td></tr><tr><td>acétone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>acétonitrile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34851</td><td></td></tr><tr><td>allylamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>145831</td><td></td></tr><tr><td>Basic Nettoyant Plasma</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC32G</td><td></td></tr><tr><td>Acide citrique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251275</td><td></td></tr><tr><td>concentré acide chlorhydrique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Eau désionisée</td><td>Thermo Fisher</td><td>15230147</td><td></td></tr><tr><td>dichlorométhane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270997</td><td></td></tr><tr><td>éther diéthylique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296082</td><td></td></tr><tr><td>dicarbonate de di-tert-butyle</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>361941</td><td></td></tr><tr><td>acétate d’éthyle</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>319902</td><td></td></tr><tr><td>éthylcarbamate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U2500</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectine</td><td>Thermo Fisher</td><td>PHE0023</td><td></td></tr><tr><td>solution fixatrice (formaldéhyde à 4 % préparée dans du PBS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>R37814</td><td></td></tr><tr><td>chlorhydrate de guanidinium</td><td>Alfa Aesar</td><td>A13543</td><td></td></tr><tr><td>hexanes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>227064</td><td></td></tr><tr><td>Humain cellules souches mésenchymateuses</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td><td></td></tr><tr><td>méthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>iodure de méthyle</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>289566</td><td></td></tr><tr><td>N,N-diisopropyléthylamine</td><td>Alfa Aesar</td><td>A17114</td><td></td></tr><tr><td>N,N-diméthylformamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>227056</td><td></td></tr><tr><td>N-méthylmorpholine N-oxyde</td><td>Alfa Aesar</td><td>A19802</td><td></td></tr><tr><td>Tétraoxyde d’osmium</td><td>Alfa Aesar</td><td>45385</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>solution tampon de phosphate</td><td>Thermo Fisher</td><td>20012050</td><td></td></tr><tr><td>chlorure de phosphoryle</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201170</td><td></td></tr><tr><td>carbonate de potassium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>347825</td><td></td></tr><tr><td>colonne en phase inverse</td><td>Thermo Fisher</td><td>25305-154630</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine Phalloïdine</td><td>Thermo Fisher</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>gel de silice</td><td>TCI America</td><td>S0821</td><td></td></tr><tr><td>bicarbonate</td><td>de sodium Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>éthoxyde de sodium</td><td>Alfa Aesar</td><td>L13083</td><td></td></tr><tr><td>périodide de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71859</td><td></td></tr><tr><td>sulfate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239313</td><td></td></tr><tr><td>sulfite de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0505</td><td></td></tr><tr><td>triacétoxyborohydrure de sodium</td><td>Alfa Aesar</td><td>B22060</td><td></td></tr><tr><td>spectrophotomètre(NanoDrop One/Onec UV-Vis)</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>Croissance de cellules souches BulletKit</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td></td></tr><tr><td>tétrahydrofurane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>401757</td><td></td></tr><tr><td>thioanisole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T28002</td><td></td></tr><tr><td>toluène</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179418</td><td></td></tr><tr><td>triéthylamine</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12646</td><td></td></tr><tr><td>acide trifluoroacétique</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12198</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher</td><td>HFH10</td><td></td></tr><tr><td>Solution trypsine-EDTA</td><td>Thermo Fisher</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

fabrication d’une nanomatrice biomimétique avec nanotubes de base janus et fibronectine pour l’adhérence aux cellules souches

Fabrication of a Biomimetic Nano-Matrix with Janus Base Nanotubes and Fibronectin for Stem Cell Adhesion

Un NM biomimétique a été développé pour servir d’échafaudage biologique d’ingénierie tissulaire, qui peut améliorer l’ancrage des cellules souches. Le NM biomimétique est formé à partir de JBNTs et FN par auto-assemblage dans une solution aqueuse. Les JBNT mesurent de 200 à 300 μm de longueur avec des canaux creux hydrophobes intérieurs et des surfaces hydrophiliques extérieures. Les JBNT sont facturés positivement et les NF sont facturés négativement. Par conséquent, lorsqu’ils sont injectés dans une solution aqueuse neutre, ils sont collés entre eux par liaison non rentable pour former les faisceaux NM. Le processus d’auto-assemblage est terminé en quelques secondes sans aucun initiateur chimique, source de chaleur ou lumière UV. Lorsque le pH de la solution NM est inférieur au point isoélectrique des FN (pI 5.5-6.0), les faisceaux NM s’auto-libèrent en raison de la présence d’un FN chargé positivement.
NM est connu pour imiter la matrice extracellulaire (ECM) morphologiquement et, par conséquent, peut être utilisé comme un échafaudage injectable, qui fournit une excellente plate-forme pour améliorer l’adhérence hMSC. L’analyse de la densité cellulaire et les expériences d’imagerie par fluorescence ont indiqué que les MR augmentaient considérablement l’ancrage des HMC par rapport au contrôle négatif.

Nos études ont découvert que la formation du NM des JBNT et du FN est rapide, ce qui s’est produit en 10 secondes. Comme le montre la figure 2,la floccule blanche a été obtenue lorsque la solution JBNT a été mélangée à la solution FN et pipetted à plusieurs reprises. Le processus de formation de NM est complètement biomimétique. Aucun stimulus externe n’est nécessaire. Le processus de fabrication est beaucoup plus facile que celui de certains biomatériaux émergents, qui est basé sur la lumiè...

L’objectif de ce protocole est de montrer l’assemblage d’une nanomatrix biomimétique (NM) avec des nanotubes de base Janus (JBNTs) et de la fibronectine (FN). Lorsqu’ils sont co-cultivés avec des cellules souches mésenchymales humaines (HMSCs), les MR présentent une excellente bioactivité en encourageant l’adhérence hMSCs.

Fabrication d’une nanomatrice biomimétique avec nanotubes de base Janus et fibronectine pour l’adhérence aux cellules souches

A biomimetic NM was developed to serve as a tissue-engineering biological scaffold, which can enhance stem cell anchorage. The biomimetic NM is formed ...

Nous avons développé une nano-matrice biomimétique très prometteuse pour servir d’échafaudage d’ingénierie tissulaire. Ce protocole montre comment assembler la nano-matrice à partir de nanotubes de base Janus synthétisés dans mon laboratoire, ainsi que la protéine fibronectine. Cette nano-matrice peut s’auto-assembler en quelques secondes sans utiliser d’aide supplémentaire.Lorsqu’elle est co-cultivée avec des cellules souches mésenchymateuses humaines, la nano-matrice a montré une excellente bioactivité pour encourager l’adhésion cellulaire. La nano-matrice imite morphologiquement la matrice extracellulaire. Par conséquent, il a le potentiel de servir d’échafaudage injectable pour réparer les fractures osseuses en favorisant l’adhésion et la fonction cellulaires à l’endroit cible.Commencez par fabriquer la nano-matrice. Ajoutez 80 microlitres de nanotubes de base Janus d’un milligramme par millilitre à 40 microlitres de fibronectine d’un milligramme par millilitre, et pipetez le mélange doucement et lentement plusieurs fois. Après 10 secondes, inspectez visuellement le tube pour détecter la présence d’une suspension solide blanche.Ensuite, préparez des solutions de fibronectine, de JBNT et de nano-matrice de fibronectine/JBNT pour l’observation des matériaux lyophilisés selon les instructions du manuscrit. Enduire trois puits d’une microplaque transparente à fond rond de 96 puits avec des solutions, en ajoutant 50 microlitres à chaque puits. Congelez l’assiette à moins 80 degrés Celsius pendant la nuit.Le lendemain, allumez l’instrument lyophilisé et la pompe à vide, puis appuyez sur le bouton de refroidissement pour réduire la température du système à moins 50 degrés Celsius. Mettez la plaque congelée dans l’instrument et fermez toutes les ouvertures. Cliquez sur le bouton de démarrage pour réduire la pression du système à 0,9 millibar.Après quatre heures, appuyez sur le bouton d’aération et ouvrez la vanne pour augmenter la pression du système à la pression atmosphérique. Ensuite, retirez la plaque de l’instrument lyophilisé. Préparez la solution de nanomatrice JBNT/fibronectine comme décrit dans le manuscrit du texte, et diluez les solutions JBNT et fibronectine avec de l’eau distillée pour obtenir des solutions témoins.Mesurer les spectres d’absorption des solutions à l’aide du spectrophotomètre pour caractériser l’assemblage des nano-matrices. Cliquez sur le bouton UV-vis. Ensuite, nettoyez la surface de test du spectrophotomètre et déposez deux microlitres d’eau distillée dessus.Mesurez l’eau à blanc de 190 à 850 nanomètres. Pour chaque échantillon, nettoyez la surface d’essai et déposez-y deux microlitres de solution. Ensuite, mesurez les spectres d’absorption UV-vis de 190 à 850 nanomètres.Ajoutez 200 microlitres de contrôles négatifs, de JBNT, de fibronectine et les solutions nano-matricielles dans les puits d’une lame à huit puits chambrés. Lyophiliser le verre de couverture à huit compartiments avec l’instrument lyophilisé pour enduire les matériaux au fond des puits. Ensuite, ajoutez 10 000 cellules souches mésenchymateuses humaines dans chaque puits du verre de couverture et incubez-le pendant 24 heures à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.Après l’incubation, retirez le milieu de culture cellulaire des puits et rincez-les avec du PBS. Ajoutez 100 microlitres de solution fixatrice dans chaque puits et laissez-le pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, rincez doucement les cellules avec du PBS deux fois et ajoutez 100 microlitres de 0,1 % Triton X-100 dans chaque puits.Après 10 minutes, répétez les rinçages avec du PBS. Ajoutez 100 microlitres de rhodamine phalloïdine dans chaque puits et incubez le verre de couverture à chambre pendant 30 minutes, en le protégeant de la lumière. Rincez les cellules deux fois avec du PBS et imagez-les avec un microscope fluorescent.La formation de nano-matrices est rapide et complètement biomimétique. Le flocule blanc était visible 10 secondes après que la solution de JBNT ait été mélangée à la solution de fibronectine. Des images de caméra de la fibronectine, des JBNT et de la nano-matrice ont été capturées et analysées.Aucune fibre longue n’a été observée dans le groupe de la fibronectine, ce qui indique que la structure de l’échafaudage ne peut pas se former sans JBNT. Les JBNT apparaissent comme des fibres longues et minces. Lorsqu’elle est réticulée avec de la fibronectine, la fibre nano-matricielle peut atteindre plusieurs centimètres de longueur.L’assemblage de la nano-matrice a également été confirmé par l’obtention de spectres UV-vis. Les deux pics d’absorption des JBNT diminuent seuls après la formation de la nanomatrice. La microscopie électronique à transmission a été utilisée pour caractériser la morphologie des JBNT et des nano-matrices.Les JBNT sont des tubes minces de diamètres uniformes. Lorsqu’ils sont mélangés à la fibronectine, ils forment une longue nano-matrice de fibromes via des interactions de charge. Lorsque le pH est inférieur au point isoélectrique de la fibronectine, la nano-matrice s’auto-libère en raison de la fibronectine chargée positivement.L’effet de la nano-matrice JBNT/fibronectine sur l’adhésion cellulaire a également été exploré. Étant donné que les nano-matrices sont conçues pour imiter morphologiquement la matrice extracellulaire, elles fournissent un échafaudage et augmentent l’adhésion cellulaire. La microscopie à fluorescence a confirmé que l’incubation avec les nano-matrices augmentait l’adhésion cellulaire.Dans la procédure suivante, la migration cellulaire, la différenciation et la fonction à long terme peuvent être montrées pour explorer davantage l’effet de la nano-matrice sur la croissance et les fonctions des cellules souches mésenchymateuses humaines.

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JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

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Fabrication d’une nanomatrice biomimétique avec nanotubes de base Janus et fibronectine pour l’adhérence aux cellules souches

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