Double injection directe de sang dans la Cisterna Magna comme modèle d’hémorragie subarachnoïde

L’objectif global de cette présente vidéo est d’expliquer le protocole d’une double injection directe de sang dans la magna cisterna comme modèle d’hémorragie sous-arachnoïdienne. La physiologie de l’hémorragie sous-arachnoïdienne est souvent due à une rupture d’un anévrisme. Et nous faisons d’abord l’extravasation du sang dans le compartiment entre le cerveau et le tissu qui couvre le cerveau.

Ce compartiment est l’espace sous-arachnoïdien. L’hémorragie sous-arachnoïdienne représente jusqu’à 7 % de tous les cas de grève. La mortalité varie entre 30 et 50% dans les études basées sur la population et les survivants d’hémorragie sous-arachnoïdienne éprouvent généralement des séquelles cognitives comme déficits de mémoire, asthénie, ou désordres d’humeur.

La principale cause dans la prévalence élevée de mauvais résultats est ce qui est ischémie cérébrale. Les études ont fait un lien entre l’occurrence de l’ischémie dans la vasoconstriction des grandes artères cérébrales, appelée vasospasme microscopique qui peut être détectée dans une majorité de patients entre le quatrième et le quinzième jour après le premier événement de ballonnement. En raison de l’inefficacité des options thérapeutiques actuelles, il y a un besoin médical évident pour une meilleure compréhension des événements pathologiques.

L’hémorragie sous-arachnoïdienne qui l’accompagne et de nouvelles cibles thérapeutiques devraient être testées, mais cela nécessite des modèles animaux variés et standardisés. La rupture de l’anévrisme intercrânien principalement responsable de l’hémorragie sous-arachnoïdienne chez l’homme est probablement difficile à faire des modèles précliniques et humains. Chez les animaux, les principales difficultés résident dans l’incidence de contrôle de l’hémorragie et de la distribution du sang, mais des études récentes se concentrent sur le développement de modèles plus redicifs de modèles d’hémorragie sous-arachnoïdienne.

Ici représentent un modèle normalisé de souris de deux injections consécutives de sang artérielle autologue de nos deux jours dans la magna cisterna. Les principaux avantages de ce modèle sont de maîtriser reproductiblement une intervention chirurgicale non invasive, d’adapter la qualité et la quantité du sang injecté, et de renforcer l’événement saignant sans augmenter considérablement la pression intracrânienne. Avant le début de la chirurgie, vous devez mettre un autre grand nombre de capillaires en verre en utilisant un puller micropipette.

La pipette d’injection doit présenter un diamètre intérieur de 0,86 millimètre et un diamètre extérieur de 0,5 millimètre. Préparer le liquide céphalo-rachidien cérébral artificiel pour l’état factice, comme indiqué dans le protocole écrit. Vous devez réaliser ce liquide céphalo-rachidien artificiel oxygéné avec un appareil filtrant de 0,22 micron.

La première étape de notre modèle d’hémorragie sous-arachnoïdienne consiste en l’isolement de l’artère carotide le long de la trachée et la collecte du maximum de sang de la ponction de l’artère carotide. Après anesthésie par isoflurane, vérifiez l’absence de réflexes en serrant un ou deux membres postérieurs pour permettre le réglage de la procédure expérimentale. Codez une seringue d’un millimètre avec Eprin à l’aide d’une aiguille de calibre 26.

Cela permettra d’éviter la coagulation du sang au cours des prochaines étapes. Pesez chaque souris avec précision à l’aide d’un solde électronique. Dans l’étude actuelle, les souris auraient un poids corporel dans la gamme de 20 à 25 grammes juste avant la chirurgie.

Comme expliqué précédemment, anesthésie induite de la souris opérée, puis raser le cou et l’espace entre chaque oreille au moyen d’une tondeuse électrique adaptée. Vérifiez que la souris dort et que la tête de la souris est bien bloquée. Injecter sous-cutanément 100 microlitres de buprénorphine à 0,1 milligramme par kilo avec une aiguille de calibre 26 dans le bas du dos pour éviter la douleur après le réveil.

Empêchez les yeux secs à l’aide d’un gel liquide protecteur et maintenez une température intraductrice de 37 degrés à l’aide d’une couverture électrique autor réglementée. Avant de traiter la zone rasée avec une solution antiseptique, tous les instruments touchant le tissu ont été stérilisés et manipulés aseptiquement. Le premier jour, couper une incision d’un centimètre de long dans le cou postérieur, suivie de la séparation des muscles le long de la ligne médiane, pour accéder à la magna cisterna.

Couper le bout de la pipette en verre vide avec de minces ciseaux. Ensuite, adaptez-vous à une seringue reliée à un connecteur flexible en silicium. Puis transférer 60 microlitres de sang ou de liquide céphalo-rachidien cérébral artificiel dans un tube de 0,5 millilitre à l’aide d’une micropipette de précision Aspirez dans la pipette en verre, les 60 microlitres de sang pour l’état d’hémorragie sous-arachnoïdienne ou 60 microlitres de liquide rachidien cérébral artificiel pour la condition fictive.

Pour l’injection, insérez la pipette sur le cadre stéréotaxique en utilisant, par exemple, notre anneau ou un et lentement approcher la pointe pipette à la membrane à l’interface avec la magna cisterna. Insérez lentement la pointe de pipette à travers la membrane atlanto-occipital dans la magna cisterna à l’aide d’un micromanipulateur du cadre stéréotaxique. Connectez la pipette à la seringue précédemment remplie, prête pour l’induction sous pression.

Injectez par pression à un faible taux d’environ 10 microlitres par minute pour éviter l’hypertension intracrânienne aiguë. Pendant l’injection, surveillez attentivement la fréquence respiratoire et la température rectale. À la fin de l’injection, retirez soigneusement la pipette à l’aide du micromanipulateur et prenez soin visuellement qu’il n’y a pas de fuite pendant le retrait.

Atteindre l’homéostasie et effectuer deux sutures avec tressé fil de suture non absorbable. Immédiatement après la chirurgie, isoler et positionner la souris dans le décubitus déclin et couvrir avec une couverture de survie dans une boîte ouverte pour la durée de la récupération. Après 24 heures, induire une anesthésie à nouveau, installer la souris sur le cadre stéréotaxique comme la veille et enlever avec soin les sutures avec des micro-ciseaux.

Préparer comme avant l’aseptique de la membrane atlanto-occipitale, en appliquant sur la zone rasée et la solution aseptique avec une tige de coton. Injecter, comme la veille, 30 microlitres de sang ou de liquide céphalo-rachidien cérébral artificiel à basse vitesse. Comme nous l’avons déjà mentionné, surveillez la fréquence respiratoire et la température rectale.

À la fin de l’injection, enlever soigneusement la pipette et contrôler l’absence de fuite de sang pendant le sevrage. Atteindre l’homéostasie et effectuer deux sutures avec un fil de suture absorbable tressé. Du premier jour après la chirurgie au jour du sacrifice, le poids corporel doit être évalué quotidiennement comme un indicateur sensible pour le bien-être général.

Il a montré un gain de poids corporel réduit significatif dans l’hémorragie sous-arachnoïdienne, comparée aux animaux factices, suggérant un processus durable de rétablissement d’activité et des événements pathologiques prolongés, hémorragie post-subarachnoïde. Pourquoi la mortalité n’est-elle pas en parfait état? La mortalité est proche de 30% au septième jour dans l’état d’hémorragie sous-arachnoïdienne, avec la plupart des animaux meurent le jour ou le quatrième après chirurgie.

Parmi les critères d’évaluation humains, une perte de poids significative supérieure de 15% du poids initial est noté. Une posture voûtée, des mouvements lents, des blessures, des vocalisations anormales ou une agression significative sont également des signes que l’animal souffre. Si l’un de ces signes ou une combinaison de signes apparaît, le suivi de l’animal est renforcé dans les heures qui suivent son apparition.

Si l’état de l’animal s’aggrave dans l’heure qui suit ou ne s’améliore pas dans les 48 heures, on considérera qu’un niveau de souffrance intolérable est atteint et que le meurtre est effectué. Dans cet exemple au premier jour de la chirurgie, il peut être observé à partir d’un cerveau échantillon, caillots sanguins le long des grandes artères du polygone Willis dans le sujet de l’hémorragie sous-arachnoïdienne. Au cinquième jour après la chirurgie et avant le sacrifice, l’injection intervasculaire d’encre indienne permet la détection du vasospasme macroscopique correspondant à la vasoconstriction des grandes artères cerebellar, coloration des tranches de cerveau avec l’hématoxyline et l’éosine permet la mesure du vasospasme cérébral.

Ici, comme illustré sur cette micrographie photo, vous pouvez observer comme un vasospasme de l’artère basilaire. Dans ce modèle de détournement de l’injection directe de sang dans la magna cisterna, nous avons récemment démontré vasospasme cérébral de grandes artères cérébrales, dépôt fibril vasculaire cérébral, et l’apoptose cellulaire, accompagnée de fonctions sensorielles, motrices et cognitives altérées chez la souris. Ainsi, il rend ce modèle validé et caractérisé pour des événements à court terme et de longue durée, hémorragie post-sous-arachnoïdienne.

Il devrait être idéalement approprié pour l’identification prospective de nouvelles cibles et pour des études sur des stratégies thérapeutiques efficaces contre les complications associées à l’hémorragie sous-arachnoïdienne.