Quantification de l’apport en macronutriments dans un écran neuronal thermogénétique à l’aide de larves de drosophiles

Notre protocole permet d’identifier des populations neuronales larvaires codant des choix nutritionnels liés au contrôle des apports de deux macronutriments majeurs, les protéines et les glucides. La simplicité et le débit relativement élevé de notre méthode permettent de quantifier l’apport alimentaire pour plusieurs génotypes exposés à différentes conditions nutritionnelles. Pour croiser génétiquement les lignées parentales, installez des cages de collecte d’embryons de 60 millimètres avec des plaques de régime d’élevage L3 complétées par une pâte de levure active.

Transférez les femelles vierges adultes TripA1 et les mâles Janelia GAL4 âgés de cinq à huit jours dans les cages de collecte d’embryons et laissez l’accouplement se produire pendant 24 à 48 heures à 25 degrés Celsius avec 60 % d’humidité et un cycle d’obscurité de 12, 12 lumière. Après la période d’accouplement, transférez les mouches adultes accouplées dans des assiettes d’élevage L3 fraîches et laissez la ponte se produire pendant trois à quatre heures à 25 degrés Celsius. Assurez-vous que toutes les plaques sont étiquetées avec le génotype et la date de ponte.

Lorsque la période de ponte est terminée, retirez les plaques des cages et estimez le nombre d’œufs par boîte en comptant le nombre d’embryons dans un quart de la boîte. Maintenez la densité larvaire à un maximum de 200 embryons par assiette et recouvrez les assiettes de couvercles en plastique. Incuber les plaques d’élevage L3 à 18 degrés Celsius, 60 % d’humidité et un cycle d’obscurité de 12, 12 lumières pendant neuf jours.

Après l’incubation, prélever trois groupes de 10 L3 de chacun des génotypes à tester, ainsi qu’un groupe de 10 L3 pour le contrôle des aliments sans colorant. Utilisez la pince numéro cinq ou la pince poids plume pour effectuer la collecte des larves aussi doucement que possible. Transférez les larves collectées dans des bateaux en plastique contenant un millilitre d’eau.

Installez un incubateur à 30 degrés Celsius et maintenez les niveaux d’humidité élevés en ajoutant un plateau rempli d’eau pour éviter la déshydratation des larves pendant le test. Équilibrez la température des plaques d’essai en les réchauffant à 30 degrés Celsius avant de commencer. Assurez-vous que toutes les plaques sont étiquetées avec le génotype et le rapport protéines/glucides de l’alimentation.

Électrocutez les larves expérimentales pendant deux minutes en transférant directement les bateaux en plastique contenant les animaux dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius. Réglez le nombre requis de minuteries pendant une heure, puis vidangez soigneusement l’eau des bateaux en plastique et transférez les groupes L3 des bateaux au centre des plaques d’actif. Couvrez les plaques et démarrez la minuterie.

Laissez les larves se nourrir pendant une heure à 30 degrés Celsius dans l’obscurité. Arrêtez le test d’alimentation en transférant les plaques dans un bain de glace. Préparez deux microtubes d’un millilitre pour chaque groupe L3 testé, contenant suffisamment de billes de verre de 0,5 millimètre pour remplir la partie inférieure du microtube et 300 microlitres de méthanol glacé.

Utilisez une glacière de paillasse pour garder les microtubes froids. Récupérez soigneusement les groupes L3 des plaques de test d’alimentation et transférez-les sur les couvercles des plaques avec un peu d’eau. Rincez les larves pour enlever les débris alimentaires de leur corps, en prenant soin d’éviter toute blessure.

Transférez les larves dans les microtubes préparés et lysez-les avec un lyseur tissulaire pour extraire le colorant alimentaire des intestins. Transférez les extraits dans des microtubes propres de 1,5 millilitre en inversant directement les deux microtubes de millilitre sur les nouveaux tubes. Faites-le doucement pour que la plupart des billes de verre restent au fond du tube de deux millilitres.

Nettoyez les débris cellulaires en centrifugeant les extraits à une vitesse maximale et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes, puis transférez les surnageants dans des tubes propres de 1,5 millilitre. Pour effectuer une quantification calorimétrique de la consommation alimentaire, préparez des solutions étalons de colorant bleu en les diluant en série une à deux dans du méthanol. Transférez 100 microlitres d’échantillons expérimentaux, d’étalons et de blancs dans les puits d’une microplaque de 96 puits et mesurez l’absorbance à 600 nanomètres.

Ce protocole a été utilisé pour quantifier les quantités relatives de macronutriments consommés pour les animaux sous activation thermogénétique de populations neuronales spécifiques dans le système nerveux larvaire. L’activation de populations distinctes de neurones a considérablement affecté l’équilibre des macronutriments chez les larves du troisième stade. Le schéma d’alimentation observé pour la ligne témoin, ici indiqué en gris, montre une diminution attendue de l’apport alimentaire dans les régimes à rapport protéines/glucides plus élevés, démontrant l’efficacité de la méthode.

Les cinq classes phénotypiques qui ont été établies pour les animaux de laboratoire étaient manger beaucoup et compenser la dilution des protéines en mangeant trop, manger beaucoup, mais ne pas compenser, manger peu, mais compenser, manger peu et ne pas compenser, et manger de manière aberrante. Pour chacune de ces classes phénotypiques et génotypes, les profils de GFP dans le système nerveux central des larves du troisième stade sont présentés. Lors de la mise en œuvre de ce protocole, il est important de générer des larves de troisième stade synchronisées au développement précoce afin de minimiser la variation associée au comportement de l’animal.

Selon ce protocole, le radio-étiquetage des aliments permettrait de confirmer et de disséquer davantage les résultats trouvés à l’aide de ces méthodes.