Hydrogels d’Alginate et microbioréacteurs hydrophobes protéolytically dégradés pour l’encapsulation des oocytes porcins

Ce protocole d’encapsulation des ovocytes porcins permet de maintenir l’organisation sphérique des COC. Ceci empêche leur aplatissement et la perturbation conséquente des jonctions d’écart entre l’ovocyte et les cellules folliculaires environnantes. Les principaux avantages des deux protocoles décrits sont qui sont conviviaux et permettent un contrôle efficace de la survie des ovocytes et des cellules chimio.

Les deux systèmes de culture sont des outils précieux pour la recherche fondamentale en biologie de la reproduction, et peuvent avoir une pertinence clinique pour l’amélioration du traitement de l’infertilité. Ils peuvent également être appliqués pour développer de nouvelles méthodes de biotechnologie et pour l’amélioration du bétail. Après le rinçage des ovaires, transférez-les dans un bécher rempli de HM moyen et conservez-les dans un incubateur à 38 degrés Celsius lors de toutes les manipulations subséquentes.

Aspirer le liquide folliculaire des grands follicules porcins et le centrifuger à 100 fois G pendant 10 minutes à température ambiante. Filtrez ensuite le supernatant à l’aide d’une seringue stérile fixée à un filtre à pores membranaires de 0,2 micromètre, et enclenchez-le geler à 80 degrés Celsius négatifs. Pour isoler les COC des follicules de taille moyenne, transférez deux à trois ovaires dans une boîte de Pétri stérile de 10 centimètres remplie de HM. Coupez doucement la surface des follicules ovariens saillants avec une lame chirurgicale stérile numéro 15, ce qui fera couler le liquide folliculaire et les COC dans la boîte de Pétri.

Aspirer le contenu folliculaire avec une aiguille de calibre 28 attachée à une seringue jetable, et le transférer dans une autre boîte de Pétri. Pour préparer les boîtes de FiV Petri, ajouter un millilitre de HM aux puits centraux, et placer trois à quatre gouttes de HM dans les anneaux extérieurs. Ensuite, utilisez une micropipette en polycarbonate pour déplacer les COC intacts vers des gouttes de HM dans les anneaux extérieurs, et rincez-les brièvement trois à quatre fois.

Une fois terminés, transférez-les individuellement dans le puits central. Conserver les plaques de FIV dans l’incubateur. Préparez des solutions thrombin et fibrinogen décrites dans le manuscrit du texte.

Le jour de l’intervention, décongeler lentement la solution fibrinogen sur la glace et l’amener à température ambiante juste avant utilisation. Mélanger la solution 0,5% alginate et la solution fibrinogen à un rapport un pour un pour un volume final de deux millilitres et vortex doucement le mélange. Réparer les chambres d’incubation en appliquant de fines bandes de film de paraffine sur des diapositives de microscope en verre.

Pipette 7,5 gouttes de microlitres du mélange FA sur la glissière en verre recouverte de film de paraffine avec des espaceurs séparateurs, plaçant huit à 10 gouttes disposées en deux rangées. Utilisez une micropipette pour transférer trois à cinq COC au centre de la chute FA, ainsi qu’un volume minimum de milieu de maturation. Ajoutez 7,5 microlitres de solution thrombine au-dessus de chaque goutte FA pour la couvrir.

Il n’est pas nécessaire de les mélanger parce que le gel se forme presque instantanément. Couvrir la chambre d’incubation d’une glissière en verre préparée précédemment, puis retourner la chambre à l’envers et la placer dans une boîte petri de 100 millimètres tapissée de papier filtre humide. Mettez la boîte de Pétri dans l’incubateur de 5% de dioxyde de carbone à 38 degrés Celsius pendant cinq à sept minutes.

Après l’incubation, transférer chaque capsule FA dans un puits d’une plaque de 96 puits contenant 100 microlitres de milieu de maturation. Tous les deux jours, remplacer la moitié du milieu par un milieu de maturation frais pré-équilibré. Image COC utilise un microscope à lumière inversée à 10x grossissement.

Après avoir culture des COC pendant quatre jours, retirer le milieu de maturation des puits et ajouter 100 microlitres de 10 unités internationales par lysate d’algénate millilitre dans le DMEM. Laisser la plaque de culture dans l’incubateur pendant 25 à 30 minutes. Retirer les COC des capsules dissoutes.

Lavez-les dans DMEM plusieurs fois, puis transférez-les à l’anneau intérieur d’un plat de FIV contenant PBS. Faire un lit de cinq grammes de poudre de FEP dans une boîte de Pétri de 30 millimètres. Distribuer une gouttelette unique de milieu de maturation contenant de trois à cinq COC sur la poudre fep.

Faites pivoter doucement la plaque dans un mouvement circulaire pour vous assurer que les particules recouvrent complètement la surface de la goutte liquide et forment des billes liquides, ou LMs. Préparez plusieurs boîtes de Pétri fiv de 60 millimètres, et ajoutez trois à quatre millilitres d’eau stérile aux anneaux extérieurs pour créer une chambre d’humidité. Prenez le LM formé avec une pipette de 1000 microlitres et placez-le dans le puits central.

Incuber les billes pendant quatre jours à 38 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone de cinq pour cent. Pour changer le milieu, appliquez 30 microlitres de milieu de maturation sur chaque LM, ce qui le fera se propager. Lorsque le contenu du marbre se dissout, transférer les COC libérés du bioré réacteur à une goutte de milieu de maturation frais dans la boîte de Pétri.

Après trois à quatre lavages en milieu de maturation, transférer les COC, ainsi que 30 microlitres de milieu frais, sur le lit en poudre FEP. Faites pivoter doucement la plaque dans un mouvement circulaire pour s’assurer que les particules de poudre couvrent complètement la surface de la goutte de liquide et forment un nouveau LM.Then, transférez le LM à la boîte de Pétri de FIV. Les deux systèmes de maturation in vitro ont produit des COC avec des cellules granulosis qui ont été étroitement adhérés les uns aux autres et des couches intactes de cellules de cumulus.

L’analyse de viabilité du COC a confirmé que des conditions de croissance optimales ont été obtenues dans les deux systèmes d’encapsulation. Dans les deux groupes, seulement des emplacements élevés d’ovocytes de viabilité ont été observés. Les ovocytes ont été imaged avec la microscopie électronique de transmission.

Les mitochondries ont été réparties uniformément et ont eu une forme shell-like. Seuls quelques-uns d’entre eux ont été allongés et leur regroupement a été observé sporadiquement. Le réticulum endoplasmique a été associé aux mitochondries ou libre dans le cytoplasme d’ovocyte.

Des gouttelettes liquides sont apparues sous forme de petites structures rondes foncées, et l’appareil Golgi a vu le jour avec des citernes dilatées. Il est important d’être précis et prudent lors du transfert des capsules FA de la chambre d’incubation dans les assiettes de culture et lors de la cueillette et le transfert du format LM dans la boîte de Pétri FIV.