Name: Préparation du pli vocal du rat pour les analyses neuromusculaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-15T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Découvrez la préparation des plis vocaux du rat pour l'analyse histochimique des structures neuromusculaires. Cette méthode utilise la cryodécoupe avec repérage laryngé pour identifier précisément les muscles intrinsèques et étudier les adaptations liées au développement, au vieillissement et aux maladies.

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Cette recherche a été soutenue par les subventions F31DC017053-01A1 (Lenell, PI) et K23DC014517 (Johnson, PI) du National Institute on Deafness and other Communication Disorders des National Institutes of Health.

Cette étude a été réalisée en conformité avec le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de la Faculté de médecine de l’Université de New York.
1. Disséquer le larynx du rat
<ol><li>Euthanasier le rat selon le protocole approuvé par l’institution. Raser le cou ventral de la mandibule au manubrium et écouvillonner avec de l’alcool pour éviter la contamination de la fourrure dans les échantillons de tissus.</li>
	<li>Sous une lunette de dissection avec un grossissement de 10x, excisez tout le larynx en créant une incision du cou médiane avec un scalpel jusqu’à ce que la trachée soit exposée.</li>
	<li>Séparez les muscles laryngés extrinsèques ventraux à la ligne médiane pour exposer le larynx à l’aide d’une pince et de ciseaux disséquants ou d’un scalpel.</li>
	<li>Coupez la trachée caudale au troisième anneau trachéal et faites une incision rostrale à l’os hyoïde pour exciser tout le larynx à l’aide de ciseaux disséquants.</li>
	<li>Retirez les tissus laryngés extrinsèques (œsophage, glande thyroïde et muscles laryngés extrinsèques) du larynx à l’aide d’outils de microdissection (pinces à épiler, épingles et microscisseurs) sous grossissement.</li>
	<li>Avec les microcisseurs, coupez le larynx en deux entre les aryténoïdes en utilisant la ligne médiane entre les muscles cricoaryténoïdes postérieurs comme point de repère. Épingler les parois latérales du larynx pour exposer les plis vocaux, puis couper en deux par voie ventrale la ligne médiane du cartilage thyroïdien entre la commissure antérieure des plis vocaux avec des microscisseurs (Figure 1). REMARQUE : cette étape peut être facultative ; il peut être sauté pour garder le larynx entier. La bisection des larynges permet plusieurs techniques d’immunocoloration en utilisant séparément les côtés droit et gauche du même larynx.</li>
	<li>Rincez chaque hémi-larynx dans une solution tamponnée au phosphate (PBS) pendant environ 10 s et séchez délicatement avec un essuie-glace pour réduire la formation de cristaux de glace pendant la congélation.</li>
</ol>2. Fixer et/ou congeler le tissu laryngé
REMARQUE: La fixation peut ne pas être idéale pour tous les protocoles de coloration immunologique. Souvent, les tissus laryngés sont surgelés frais immédiatement après la dissection. Sautez l’étape 2.1 pour congeler le tissu laryngé sans fixation.
<ol><li>Pour fixer les hémi-larynges, placez les tissus dans un tube de centrifugeuse rempli de formaldéhyde à 4% dans du PBS pendant 1 h à température ambiante sur un agitateur orbital à 70 tr / min. Transférer les tissus dans un tube de centrifugeuse propre et rincer 3x pendant 20 min dans PBS. Transférer ensuite dans un tube de centrifugeuse propre et immerger dans une solution de saccharose à 20 % / 5 % de glycérol (~18 h ou jusqu’à ce que le tissu coule) à 4 °C. ATTENTION : Le formaldéhyde est dangereux et doit être utilisé dans une hotte avec l’équipement de protection individuelle approprié.</li>
	<li>Placez tous les hémi-larynges dans une position uniforme dans un cryo-moule rempli de composé de température de coupe optimale (OCT). Pour un hémilarynx, placez le tissu avec la surface médiale du pli vocal face au bas du cryomoulage et l’aspect longitudinal du pli vocal parallèle au bord inférieur de l’ouverture du cryomoulage. Pour les larynges entiers, placez le tissu avec les cricoaryténoïdes postérieurs face au fond du cryomoulage et l’aspect longitudinal du pli vocal parallèlement au bord inférieur de l’ouverture du cryomoulage. REMARQUE: Une orientation laryngée cohérente dans le composé OCT est essentielle pour la cryosection du pli vocal du rat. Une fois que l’hemilarynx est incrusté et congelé, il doit être décongelé pour changer d’orientation, introduisant ainsi des risques de lésions tissulaires dues à de multiples cycles de décongélation.</li>
	<li>Tissus surgelés à l’aide d’isopentane (2-méthylbutane) réfrigéré dans un bécher en acier entouré d’azote liquide. REMARQUE: L’isopentane atteint une température optimale pour la congélation des tissus lorsque des précipités blancs commencent à se former sur les côtés et le fond du bécher13. L’isopentane est utilisé parce qu’il a une conductivité thermique plus élevée que l’azote liquide, ce qui aide à prévenir la fissuration du bloc tissulaire lors d’une congélation rapide. Pour une description plus détaillée de la congélation des tissus en vente libre, reportez-vous à Kumar et al.13.</li>
	<li>Enveloppez chaque moule dans une feuille prélabellisée et placez-la dans un sac de congélation individuel pour éviter la déshydratation et conservez-la immédiatement sur de la glace carbonique jusqu’à ce qu’elle soit transférée pour être entreposée dans un congélateur à -80 °C.</li>
</ol>3. Cryosection hemilarynx dans le plan de section transversale
<ol><li>Réglez la température de la chambre dans le cryostat à -20 °C, ce qui se situe au milieu de la plage de température (15−25 °C) recommandée pour le sectionnement des tissus musculaires par le manuel du fabricant.</li>
	<li>Réglez l’épaisseur de la section du cryostat sur des sections de 10 μm d’épaisseur. REMARQUE: Pour l’analyse en coupe transversale des fibres musculaires, des sections de 10 μm d’épaisseur sont optimales pour permettre une coloration complète et une intensité d’imagerie robuste des fibres musculaires marquées pour l’analyse du typage des fibres14,15,16. Certains protocoles peuvent nécessiter une épaisseur de section différente en fonction des cibles neuromusculaires.</li>
	<li>Transférez les tissus dans la chambre du cryostat, ajoutez une couche uniforme de composé OCT sur le disque de l’échantillon de cryostat (mandrin) et placez le bloc de tissu incorporé au-dessus du composé OCT sur le disque de l’échantillon. Pour obtenir des coupes transversales du pli vocal pour l’analyse des fibres musculaires thyroaryténoïdes (TA), fixez l’échantillon au mandrin de sorte que le cartilage thyroïdien ventral fasse face à la lame du cryostat et que le cartilage aryténoïde fasse face au disque de l’échantillon. REMARQUE: Il est essentiel de noter que ces points de repère ne sont pas visibles à ce stade, car le composé OCT devient blanc et opaque lorsqu’il est gelé. Ce manque de visibilité est la raison pour laquelle il est essentiel de noter l’orientation de l’hémilarynx pendant la phase de congélation du flash.</li>
	<li>Couper le composé OCT en avançant la tête de l’échantillon de 100 μm jusqu’à ce que la partie ventrale du cartilage thyroïdien apparaisse.</li>
	<li>Ensuite, coupez et suivez des sections de 30 μm depuis l’apparition du cartilage thyroïdien jusqu’à ce que la lamina propria, les muscles TA médiaux et le muscle TA latéral soient exposés. REMARQUE: Les repères laryngés doivent être suivis et notés dès l’apparition du cartilage thyroïdien tous les 100 μm pour s’assurer que l’angle de sectionnement n’est pas oblique. La figure 2 représente les deux ensembles de repères laryngés dans le plan de coupe transversale à un grossissement de 10x.</li>
	<li>Une fois que le muscle TA cible est atteint, collectez des sections sur des lames chargées positivement à 10 μm.</li>
	<li>Conservez les sections dans du PBS à 4 °C pour retenir l’humidité jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être tachées. REMARQUE: Les tissus fixes peuvent être stockés dans le PBS jusqu’à une semaine en fonction de la cible IHC, tandis que les tissus non fixés doivent être immédiatement traités.</li>
</ol>4. Cryosection hemilarynx dans le plan longitudinal
<ol><li>Avec la chambre de cryostat à nouveau réglée à -20 °C, modifiez l’épaisseur de la section à 30 μm. REMARQUE: Pour l’analyse NMJ, une épaisseur de tissu comprise entre 30 et 60 μm peut être utilisée pour capturer plusieurs NMJ complets dans les muscles laryngés sans fragmentation de la terminaison nerveuse ou de la plaque d’extrémité motrice11,12,17.</li>
	<li>Pour obtenir des coupes longitudinales du pli vocal pour l’analyse NMJ du muscle TA, fixez les échantillons au mandrin de sorte que l’épiglotte soit orientée vers la lame du cryostat et que la lumière trachéale soit orientée vers le bas vers le disque de l’échantillon.</li>
	<li>Coupez le composé OCT en avançant la tête de l’échantillon de 100 μm jusqu’à ce que le cartilage thyroïdien apparaisse.</li>
	<li>Couper et suivre des sections de 30 μm depuis l’apparition de la thyroïde jusqu’à ce que la lamina propria et les divisions médiales et latérales du muscle TA soient exposées. REMARQUE: Cinq ensembles de repères laryngés dans le plan longitudinal sont recommandés pour suivre la progression de la profondeur des tissus vers le muscle TA cible. La figure 3 représente les repères laryngés dans le plan longitudinal à un grossissement de 10x.</li>
	<li>Une fois le muscle TA cible atteint, collectez des sections sur des lames chargées positivement à 30 μm.</li>
	<li>Conservez les sections dans du PBS à 4 °C pour retenir l’humidité jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être tachées.</li>
</ol>

<ol><li>Connor, N. P., Suzuki, T., Lee, K., Sewall, G. K., Heisey, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+junction+changes+in+aged+rat+thyroarytenoid+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Otology%2C+Rhinology+and+Laryngology%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular junction changes in aged rat thyroarytenoid muscle.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (7), Pt 1 579-586 (2002).</li>
<li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-Related+Alterations+in+Myosin+Heavy+Chaing+Isoforms+in+Rat+Intrinsic+Laryngeal+Muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Otology%2C+Rhinology+and+Laryngology%22%5BJournal%5D)">Age-Related Alterations in Myosin Heavy Chaing Isoforms in Rat Intrinsic Laryngeal Muscles.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (11), 962(2002).</li>
<li>Johnson, A. M., Grant, L. M., Schallert, T., Ciucci, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+Rat+50-kHz+Ultrasonic+Vocalizations+During+Dopamine+Denervation+and+Aging%3A+Relevance+to+Neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Changes in Rat 50-kHz Ultrasonic Vocalizations During Dopamine Denervation and Aging: Relevance to Neurodegeneration.</a> Current Neuropharmacology. 13 (2), 211-219 (2015).</li>
<li>Wright, J. M., Gourdon, J. C., Clarke, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multiple+call+categories+within+the+rich+repertoire+of+adult+rat+50-kHz+ultrasonic+vocalizations%3A+effects+of+amphetamine+and+social+context%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Identification of multiple call categories within the rich repertoire of adult rat 50-kHz ultrasonic vocalizations: effects of amphetamine and social context.</a> Psychopharmacology. 211 (1), 1-13 (2010).</li>
<li>Bowers, J. M., Perez-Pouchoulen, M., Edwards, N. S., McCarthy, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxp2+mediates+sex+differences+in+ultrasonic+vocalization+by+rat+pups+and+directs+order+of+maternal+retrieval%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Foxp2 mediates sex differences in ultrasonic vocalization by rat pups and directs order of maternal retrieval.</a> Journal of Neuroscience. 33 (8), 3276-3283 (2013).</li>
<li>Basken, J. N., Connor, N. P., Ciucci, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+aging+on+ultrasonic+vocalizations+and+laryngeal+sensorimotor+neurons+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Effect of aging on ultrasonic vocalizations and laryngeal sensorimotor neurons in rats.</a> Experimental Brain Research. 219 (3), 351-361 (2012).</li>
<li>Ciucci, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+dopamine+synaptic+activity%3A+degradation+of+50-kHz+ultrasonic+vocalization+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reduction of dopamine synaptic activity: degradation of 50-kHz ultrasonic vocalization in rats.</a> Behavioral Neuroscience. 123 (2), 328-336 (2009).</li>
<li>Ciucci, M. R., Vinney, L., Wahoske, E. J., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+translational+approach+to+vocalization+deficits+and+neural+recovery+after+behavioral+treatment+in+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Communication+Disorders%22%5BJournal%5D)">A translational approach to vocalization deficits and neural recovery after behavioral treatment in Parkinson disease.</a> Journal of Communication Disorders. 43 (4), 319-326 (2010).</li>
<li>Nagai, H., Ota, F., Konopacki, R., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discoordination+of+laryngeal+and+respiratory+movements+in+aged+rats%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Discoordination of laryngeal and respiratory movements in aged rats.</a> American Journal of Otolaryngology. 26 (6), 377-382 (2005).</li>
<li>Ma, S. T., Maier, E. Y., Ahrens, A. M., Schallert, T., Duvauchelle, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+intravenous+cocaine+experience%3A+development+and+escalation+of+pre-drug+anticipatory+50-kHz+ultrasonic+vocalizations+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Repeated intravenous cocaine experience: development and escalation of pre-drug anticipatory 50-kHz ultrasonic vocalizations in rats.</a> Behavioural Brain Research. 212 (1), 109-114 (2010).</li>
<li>Inagi, K., Schultz, E., Ford, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+anatomic+study+of+the+rat+larynx%3A+establishing+the+rat+model+for+neuromuscular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngology+and+Head+and+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">An anatomic study of the rat larynx: establishing the rat model for neuromuscular function.</a> Otolaryngology and Head and Neck Surgery. 118 (1), 74-81 (1998).</li>
<li>Lenell, C., Newkirk, B., Johnson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laryngeal+Neuromuscular+Response+to+Short-+and+Long-Term+Vocalization+Training+in+Young+Male+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Speech%2C+Language%2C+and+Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Laryngeal Neuromuscular Response to Short- and Long-Term Vocalization Training in Young Male Rats.</a> Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 62 (2), 247-256 (2019).</li>
<li>Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do%27s+and+don%27ts+in+the+preparation+of+muscle+cryosections+for+histological+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52793(2015).</li>
<li>McMullen, C. A., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+morphological+evidence+of+age-related+denervation+in+rat+laryngeal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Journals+of+Gerontology.+Series+A%3A+Biological+Sciences+and+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Functional and morphological evidence of age-related denervation in rat laryngeal muscles.</a> Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 64 (4), 435-442 (2009).</li>
<li>McMullen, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+stimulation-induced+changes+in+the+rodent+thyroarytenoid+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Speech%2C+Language%2C+and+Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Chronic stimulation-induced changes in the rodent thyroarytenoid muscle.</a> Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 54 (3), 845-853 (2011).</li>
<li>Lenell, C., Johnson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+dimorphism+in+laryngeal+muscle+fibers+and+ultrasonic+vocalizations+in+the+adult+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Sexual dimorphism in laryngeal muscle fibers and ultrasonic vocalizations in the adult rat.</a> Laryngoscope. 127 (8), 270-276 (2017).</li>
<li>Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vocal+training+mitigates+age-related+changes+within+the+vocal+mechanism+in+old+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journals+of+Gerontology.+Series+A%3A+Biological+Sciences+and+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanism in old rats.</a> Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 68 (12), 1458-1468 (2013).</li>
<li>Feng, X., Zhang, T., Ralston, E., Ludlow, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+neuromuscular+junctions+of+laryngeal+and+limb+muscles+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Differences in neuromuscular junctions of laryngeal and limb muscles in rats.</a> Laryngoscope. 122 (5), 1093-1098 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La préparation des plis vocaux des rats pour l’analyse neuromusculaire peut présenter divers défis. Non seulement les muscles laryngés sont petits et entourés de cartilage, ce qui rend difficile l’extraction directe du muscle cible, mais une grande variabilité a également été observée entre les animaux en profondeur des repères anatomiques laryngés. Pour le muscle, le protocole du plan de coupe transversale, des sections complètes du pli vocal sont apparues entre 21 et 85 sections (10 μm par section) après l’apparition i...

Le larynx du rat est un modèle bien établi pour étudier les adaptations laryngées neuromusculaires structurelles et fonctionnelles au développement, au vieillissement, à la maladie et aux agents pharmacologiques1,2,3,4,5. La cohérence des méthodes histologiques est essentielle à cette ligne de travail, car il existe de multiples subtilités impliquées dans la préparation et l’analyse musculaires ainsi que des défis associés à la taille, à la forme et à la topographie des muscles laryngés encapsulés dans les cartilages laryngés1,6,7,8,9,10,11 . En raison de la petite taille des muscles laryngés intrinsèques du rat, l’intégration, la congélation et la cryosection systématiques sont essentielles pour obtenir des résultats cohérents et précis. Par exemple, lors de la section du pli vocal du rat dans le plan coronal, les jonctions neuromusculaires (NMJ) de quatre des muscles laryngés intrinsèques sont situées à moins de 1,8 mm de profondeur tissulaire11. Par conséquent, une surveillance précise de l’anatomie du muscle laryngé pendant la cryosection est impérative pour identifier avec précision la ou les sections d’intérêt et éviter la sursection des tissus. La sursection du muscle cible peut entraîner une identification inexacte du nombre et de la topographie des NMJ11 ou peut entraîner une réduction globale de la taille de l’échantillon si le muscle cible est écarté en raison d’une confusion d’orientation de repère12. Au fur et à mesure que de nouveaux modèles pour l’étude du muscle laryngé et de leurs adaptations respectives sont développés, des procédures opératoires normalisées sont essentielles pour garantir que les résultats sont précis, fiables et reproductibles dans toutes les études.
L’objectif de cet article est de détailler la préparation du pli vocal du rat pour une analyse longitudinale et transversale optimale. Des méthodes détaillées utilisées régulièrement dans notre laboratoire sont décrites pour identifier les repères musculaires cibles lors de la cryosection. Bien que des méthodes similaires soient utilisées dans plusieurs laboratoires, des détails plus détaillés sont fournis ici que dans la littérature pour assurer une réplication fiable et précise lorsqu’elle est mise en œuvre par des chercheurs novices. L’objectif de ce tutoriel est de fournir une méthodologie standard pour l’évaluation immunohistochimique (IHC) du pli vocal du rat afin d’améliorer la cohérence entre les laboratoires et les investigations.

<table><tbody><tr><td>2-Méthylbutane Certifié</td><td>Fisher Chemical</td><td>35514</td><td></td></tr><tr><td>Feuille d’aluminium</td><td>Fisherbrand</td><td>1213101</td><td></td></tr><tr><td>Pinces cryogéniques SS</td><td>Thermo Scientific</td><td>11679123</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM3050</td><td></td></tr><tr><td>Lames de cryostat</td><td>C.L. Sturkey D554X50</td><td>22-210-045</td><td></td></tr><tr><td>Moules de base jetables 15mm x 15mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>41-741</td><td></td></tr><tr><td>Coussinets jetables</td><td>Medline</td><td>23-666-062</td><td></td></tr><tr><td>Kit de dissection</td><td>Thermo Scientific</td><td>9996969</td><td></td></tr><tr><td>DPBS - Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline</td><td>Gibco</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>Section Congelée Medium</td><td>Fisher Healthcare</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>Seau à glace</td><td>Bel-Art</td><td></td><td></td>11999054</tr><tr><td>Chambre d’humidité</td><td>Immunostain Ted Pella Inc</td><td>NC9425474</td><td></td></tr><tr><td>Porte-aiguilles</td><td>Assi</td><td>ASSI. B148</td><td></td></tr><tr><td>Éponges non tissées, 4 plis</td><td>Quick Medical</td><td>9023</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur orbital</td><td>Troemner</td><td>02-217-987</td><td></td></tr><tr><td>Stylo Pap</td> Paraformaldéhyde<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 16 % p/v aq. soln., sans méthanol</td><td>Alfa Aesar</td><td>50-00-0</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation haut de gamme</td><td>Fisherbrand</td><td>5408129</td><td></td></tr><tr><td>Stockage d’échantillons Sacs</td><td>Fisherbrand</td><td>19240093</td><td></td></tr><tr><td>Acier inoxydable gradué mesure 32 oz/100 mL</td><td>Polar Ware</td><td>114231B</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Lames de microscope</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Essuie-glace de travail</td><td>Kimberly-Clark Professional&trade ; 34155</td><td>06666A</td><td></td></tr><tr><td>Minuterie</td><td>Fisherbrand</td><td>2261840</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Pattern Ciseaux</td><td>Assi</td><td>ASSI. </td><td></td>SAS15RV</tr><tr><td>REMARQUE : Pour toutes les fournitures, voici des exemples d’équipements à acheter. Le modèle exact n’est pas nécessaire pour compléter nos méthodes.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

préparation du pli vocal du rat pour les analyses neuromusculaires

Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses

Le but de ce tutoriel est de décrire la préparation du pli vocal du rat pour l’étude neuromusculaire histochimique. Ce protocole décrit les procédures de dissection laryngée chez le rat, de congélation éclair et de cryosection des plis vocaux. Cette étude décrit comment cryosectionner les plis vocaux dans les plans longitudinal et transversal. Une nouveauté de ce protocole est le suivi laryngé pendant la cryosection qui assure une identification précise des muscles laryngés intrinsèques et réduit le risque de perte de tissu. Les figures démontrent la cryosection progressive dans les deux plans. Vingt-neuf hémi-larynges de rats ont été cryosectionnés et suivis depuis l’émergence du cartilage thyroïdien jusqu’à l’apparition de la première section qui comprenait le pli vocal complet. Le pli vocal complet a été visualisé pour tous les animaux des deux plans. Il y avait une grande variabilité dans la distance entre l’apparition du cartilage thyroïdien et l’apparition du pli vocal complet dans les deux plans. Le poids n’était pas corrélé à la profondeur des repères laryngés, ce qui suggère que la variabilité individuelle et d’autres facteurs liés à la préparation des tissus peuvent être responsables de la grande variabilité de l’apparence des points de repère pendant la section. Cette étude détaille une méthodologie et présente des données morphologiques pour préparer le pli vocal du rat à l’investigation neuromusculaire histochimique. En raison de la grande variabilité individuelle, les repères laryngés doivent être suivis de près pendant la cryosection pour éviter la sursection des tissus et la perte de tissus. L’utilisation d’une méthodologie cohérente, y compris une préparation adéquate des tissus et la connaissance des points de repère dans le larynx du rat, aidera à obtenir des résultats cohérents dans toutes les études et aidera les nouveaux chercheurs intéressés à utiliser le pli vocal du rat comme modèle pour étudier les mécanismes neuromusculaires laryngés.

Les résultats représentatifs faisaient partie d’une étude en cours sur les effets de l’exercice vocal sur le système neuromusculaire laryngé. Vingt-neuf rats mâles Fischer 344/bruns de Norvège (12 âgés de 9 mois, 17 âgés de 24 mois) ont été pesés et euthanasiés par inhalation de CO2 suivie d’une thoracotomie bilatérale.
Les procédures ont suivi le protocole décrit pour étiqueter les NMJ et la taille des fibres des muscles ta latéraux et médiaux. La distance entre les repères laryngé...

Ce protocole décrit les méthodes utilisées pour préparer les plis vocaux des rats pour l’étude neuromusculaire histochimique.

Préparation du pli vocal du rat pour les analyses neuromusculaires

The purpose of this tutorial is to describe the preparation of the rat vocal fold for histochemical neuromuscular study. This protocol outlines procedures ...

Ce protocole facilite la préparation du rat et de la corde vocale pour une analyse longitudinale et transversale optimale. Le protocole utilise le suivi laryngé pendant la cryosection pour assurer une identification précise des muscles laryngés intrinsèques et pour réduire le risque de perte de tissu. Le larynx est un modèle bien établi pour l’étude des adaptations neuromusculaires laryngées structurelles et fonctionnelles en réponse au développement, au vieillissement, à la maladie et aux agents pharmacologiques.Bien que cette démonstration se concentre sur le muscle thyroaryténoïdien de la corde vocale, la méthodologie est également applicable à d’autres muscles laryngés intrinsèques. Pour la dissection du larynx du rat, rasez le cou ventral de la mandibule au manubrium et tamponnez la zone exposée avec de l’alcool pour éviter la contamination de la fourrure des échantillons de tissus. Placez le rat sous un microscope de dissection avec un grossissement de 10 fois et utilisez un scalpel pour faire une incision médiane du cou jusqu’à ce que la trachée soit exposée.À l’aide d’une pince et d’un instrument pointu, séparez les muscles laryngés extrinsèques ventraux sur la ligne médian

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Une technique est décrite pour quantifier la réponse physiologique au in vivo des neurones de mammifères pendant le mouvement et de corréler la physiologie du neurone avec une morphologie neuronale, le phénotype neurochimique et microcircuits synaptique.

Physiologiques, caractérisation morphologique et neurochimiques des neurones modulée par le Mouvement

La méthodologie de synthèse vocale pour la fabrication de modèles pli est décrite. Les modèles sont de taille humaine et à imiter la structure multi-couches des plis vocal humain. Les résultats montrent que les modèles d'auto-osciller à des pressions comparables à la pression du poumon et de démontrer induites par l'écoulement des réponses vibratoires qui sont similaires à celles des cordes vocales humaines.

Synthétique, Multi-Layer, auto-oscillation de fabrication Vocal Modèle Fold

Source : Andreatta, R. D. et. al., La perfusion sous-cutanée de neurotrophine 4 à l’aide de pompes osmotiques ou d’une injection musculaire directe améliore les muscles laryngés vieillissants du rat. J. Vis. Exp. (2017)Cette vidéo démontre l’infusion de neurotrophine 4 (NTF4) dans un modèle de rat âgé pour restaurer la fonction musculaire laryngée affectée par la dénervation liée au vieillissement et la réduction des jonctions neuromusculaires. NTF4 déclenche la régénération nerveuse et...

Perfusion de neurotrophine 4 pour la régénération du nerf laryngé chez un rat âgé

Cellules olfactives engainantes (OECO) sont des cellules de la crête neurale qui permettent la croissance des neurones olfactifs primaires. Cette propriété spécifique peut être utilisé pour la transplantation cellulaire. Nous présentons ici un modèle de transplantation cellulaire basé sur l'utilisation de la COE dans un modèle de lésion du nerf laryngé.

La transplantation de cellules olfactives engainantes à évaluer la récupération fonctionnelle après des nerfs périphériques blessures

L'insuffisance respiratoire est la principale cause de décès suite à une blessure de la moelle épinière cervicale. Avoir un modèle animal pré-clinique reproductible, quantifiable et fiable de l'insuffisance respiratoire provoquée par une blessure cervicale partielle aidera à comprendre la neuroplasticité respiratoire et non respiratoire ultérieure et permettra de tester des stratégies de réparation putatifs.

Un modèle murin de la moelle épinière cervicale blessures à étude post-lésionnelle respiratoire neuroplasticité

Ici, nous présentons un protocole pour décrire l'utilisation de la neurotrophine 4 (NTF4) systémique et directement pour remodeler les muscles laryngés du rat.

L&#39;infusion de neurotrophine sous-cutanée sous-cutanée à l&#39;aide de pompes osmotiques ou d&#39;injection directe par voie musculaire améliore le vieillissement des muscles du larynx du rat

Nous décrivons une intervention chirurgicale dans un modèle de rat anesthésié pour déterminer le tonus musculaire et les propriétés viscoélastiques de la langue. La procédure implique une stimulation spécifique des nerfs hypogloss et l'application de courbes de force / déformation passives de Lissajous au muscle.

Évaluation in vivo des propriétés mécaniques et viscoélastiques de la langue de rat

Ce protocole décrit une approche de laryngoscopie transorale en série pour les souris et les rats qui permet une imagerie vidéo en gros plan et sans obstruction du larynx pendant la respiration et la déglutition à l’aide d’un régime anesthésique optimisé et de techniques de manipulation endoscopique finement ajustées.

Laryngoscopie murine mini-invasive pour l’imagerie en gros plan du mouvement du larynx pendant la respiration et la déglutition

Dans cette étude, nous présentons une méthode in vivo d’estimation du nombre et de la taille de l’unité motrice afin de quantifier la connectivité de l’unité motrice à diaphragme de rat. Une approche étape par étape de ces techniques est décrite.

Évaluation des mesures de résultats de la connectivité des unités motrices du diaphragme du rat en tant que biomarqueurs quantitatifs de la dégénérescence et de la compensation des motoneurones phréniques

Les vocalisations ultrasoniques de rat et souris de laboratoire (USV) sont utiles pour étudier les fonctions vocales et neuronales. Ce protocole décrit un paradigme nourriture-récompense qui provoque de manière fiable des USV appétitifs sans confusion liée à l’accouplement. Il détaille le conditionnement animal, la présentation des stimulus, l’enregistrement et l’analyse acoustique, fournissant une méthode reproductible pour étudier la fonction affective-motivationnelle et sensorimo-motrice...

Déclenchement anticipé de vocalisations ultrasoniques appétitives chez les rats et souris de laboratoire

Découvrez la préparation des plis vocaux du rat pour l'analyse histochimique des structures neuromusculaires. Cette méthode utilise la cryodécoupe avec repérage laryngé pour identifier précisément les muscles intrinsèques et étudier les adaptations liées au développement, au vieillissement et aux maladies.

Préparation du pli vocal du rat pour les analyses neuromusculaires

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