Un modèle d’épileptogenèse dans les cultures de tranches organotypiques cortex rhinal-hippocampe

L’épilepsie est une maladie neurologique répandue. Les tranches organotypiques rhinales de cortex-hippocampe dépeignent l’évolution épileptique-comme des événements qui ressemblent à l’épilepsie in vivo et peuvent donc être employées comme modèle ex vivo de l’épileptogenèse. Ce système est en effet un excellent outil pour suivre la dynamique et la progression de l’épileptogenèse, ainsi que pour dépister les cibles thérapeutiques potentielles de cette pathologie cérébrale.

Démontrer les procédures avec moi sera mes étudiants Francisco Meda et Mafalda Carvalho. Pour récolter le cerveau d’un jour postnatal six à sept chiots Sprague-Dawley, lavez d’abord la tête trois fois dans cinq millilitres de SGBD. En travaillant dans une armoire de biosécurité, insérez fermement des pinces pointues dans les orbites pour maintenir la tête en place et utilisez de fines ciseaux à pointe pour couper le cuir chevelu le long de la ligne médiane du foramen vertébral aux lobes frontaux.

Coupez le crâne de la même manière et le long de la fissure transversale cérébrale et utilisez de longues pinces incurvées pour séparer les morceaux du crâne. Utilisez une spatule pour jeter les bulbes olfactifs et transférer la face dorsale du cerveau vers le haut dans une plaque de 60 millimètres contenant cinq millilitres de SGBD froid. Insérez une pince fine dans le cervelet et insérez la spatule le long de la ligne médiane pour ouvrir soigneusement l’hémisphère.

Utilisez une pince courte incurvée pour enlever soigneusement l’excès de tissu qui recouvre l’hippocampe sans toucher la structure de l’hippocampe, puis coupez sous chaque hippocampe. Transférer un hémisphère à la fois côté de l’hippocampe vers le haut et parallèlement les uns aux autres sur un morceau de papier filtre. Placez le papier filtre sur un hachoir à mouchoir avec les hémisphères perpendiculaires à la lame et coupez les hémisphères en tranches de 350 microns.

Transférer le tissu tranché dans une nouvelle boîte de Petri contenant cinq millilitres de GBSS froid et utiliser des électrodes à pointe ronde pour séparer soigneusement les tranches en ne gardant que les échantillons avec un cortex rhinal et un hippocampe structurellement intacts. Les zones DG et CA doivent être parfaitement définies ainsi que les régions du cortex entorhinal et perirhinal. Utilisez une spatule et une électrode à pointe ronde pour placer jusqu’à quatre tranches intactes sur des inserts individuels dans le nombre approprié de puits d’une plaque de six puits contenant 1,1 millilitres de milieu de culture par puits.

Utilisez une pipette P20 pour éliminer tout excès de milieu de dissection autour de chaque tranche. Placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire. Changez le support tous les deux à trois jours.

Utilisez une pince pour soulever l’insert. Aspirez le support à partir du puits correspondant et re placez l’insert en place. Utilisez une pipette P1000 pour ajouter un millilitre de milieu frais de 37 degrés Celsius à chaque puits.

Préparer la configuration électrophysiologique en circuit fermé. Vérifiez que le débit de la chambre de type interface est réglé sur deux millilitres par minute et ouvrez la vanne carburateur-bœuf. Vérifiez le niveau d’eau dans le système et placez un morceau de papier filtre dans la chambre d’enregistrement de l’interface pour drainer tout excès de milieu.

Placez un morceau de papier de nettoyage de lentille sous le cadre pour fournir du support à la tranche et allumez le régulateur de température, les amplificateurs et les micro manipulateurs. Utilisez une seringue pour charger une électrode en verre avec du liquide céphalorachidien artificiel fraîchement préparé. Placez l’électrode de verre dans l’électrode de réception et attendez que la température dans la chambre d’interface se stabilise à 37 degrés Celsius.

En travaillant dans une armoire de biosécurité, placez l’insert dans une plaque de 60 millimètres avec une goutte de milieu. Utilisez une lame tranchante pour couper une tranche de l’insert et placez la tranche dans la chambre d’interface avec l’hippocampe en bas à droite, puis placez l’électrode réceptrice dans la couche de cellules pyramidales CA3, lancez le protocole d’acquisition continue et enregistrez la tranche pendant 30 minutes. Pour effectuer le test d’absorption de l’iodure de propidium, travaillez dans une armoire de biosécurité.

Soulevez l’insert du puits et ajoutez l’iodure de propidium en milieu à une concentration finale de deux micromolaires par puits. Agitez lentement la plaque avant de replacer l’insert dans le puits, en prenant soin qu’il n’y ait pas de bulles sous les tranches. Lorsque toutes les tranches ont été traitées, retournez la plaque à l’incubateur de culture cellulaire.

Pour l’immunomarquage des tranches, à la fin de l’incubation de l’iodure de propidium, aspirer le milieu du bas de chaque puits et ajouter un millilitre de paraformaldéhyde à 4% au haut et au bas de chaque insert. Après une heure à température ambiante, lavez les tranches deux fois pendant 10 minutes et un millilitre de PBS par lavage et utilisez un stylo hydrophobe pour dessiner deux rectangles sur des lames de microscope. Utilisez une lame tranchante pour couper les tranches des inserts et placer une tranche dans chaque rectangle.

Ajouter une solution bloquante de perméabilisation sur chaque tranche pour une incubation de trois heures à température ambiante. À la fin de l’incubation, ajoutez les anticorps primaires d’intérêt à chaque tranche pour une incubation de quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, lavez les tranches avec pbs-tween trois fois pendant 10 minutes par lavage et incuber les tranches avec les anticorps secondaires appropriés pendant quatre heures à température ambiante.

Ensuite, lavez les tranches comme démontré et ajoutez 50 microlitres de solution de Hoechst à chaque tranche pour une incubation de 20 minutes à température ambiante. Après l’incubation de Hoechst, lavez à nouveau les tranches et ajoutez 50 microlitres de support de montage à chacune d’elles, puis placez une lamelle sur les tranches et scellez avec du vernis à ongles. Après avoir permis aux lames de sécher pendant 24 heures à température ambiante, visualisez l’absorption d’immunomarquage et d’iodure de propidium par microscopie confocale.

Les tranches organotypiques rhinales de cortex-hippocampe dépeignent l’activité interictal et ictal-comme mélangée à sept jours in vitro. À 14 jours in vitro, l’activité spontanée est caractérisée par des décharges ictales, qui évoluent vers une activité ictal écrasante à 21 jours in vitro avec des événements ictal durant plus d’une minute. La prise d’iodure de propidium et immunohistochemistry contre le marqueur neuronal NeuN a indiqué une certaine mort neuronale en tranches in vitro de sept jours qui est considérablement augmentée à 14 jours in vitro dans tous les secteurs du hippocampe.

À sept jours in vitro, les microglies ramifiées avec une faible expression cd68 sont plus abondantes que la microglie réactive cd68 positive Iba1. Considérant qu’à 14 jours in vitro, dans tous les secteurs de l’hippocampe, les microglies amiboïdes M1 positives CD68 positives Iba1 dépassent la microglie avec une faible expression CD68. À 14 jours in vitro, quelques cellules positives cd68 positives d’Iba1 avec un aspect d’hyper ramification peuvent être identifiées, suggérant la possibilité d’un phénotype anti-inflammatoire de microglie M2.

À sept jours in vitro, l’expression de CD3 est à peine détectable, tandis que dans les tranches in vitro de 14 jours, on peut observer des astrocytes positifs cd3 positifs à la protéine acide fibrillaire glial hypertrophique, suggérant une activation progressive des astrocytes A1. Préparez les tranches de cortex rhinal-hippocampe avec un soin extrême. Assurez-vous d’enlever l’excès de tissu au-dessus de l’hippocampe, car il peut compromettre l’intégrité des tranches pendant le tranchage.

Le déficit structurel aura un impact négatif sur la viabilité des tranches. En plus des approches démontrées, une pléthore d’essais tels que l’analyse western blot, la PCR en temps réel et elisa peuvent être appliqués à ce système pour répondre à des questions spécifiques concernant l’épileptogenèse.