Name: Un modèle murine d’une blessure de brûlure reconstruite avec une greffe de peau allogénique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: Découvrez la création d'un modèle murin de brûlure totale avec greffe de peau allogénique. Cette méthode permet d'étudier la cicatrisation des plaies et l'intégration des greffes cutanées en conditions contrôlées.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par La Direction Générale de L’Armement, l’Agence de l’Innovation de Défense et l’École Polytechnique. Nous remercions notre collègue Yann Plantier de l’École Polytechnique qui a fourni un aperçu et une expertise qui ont grandement contribué à la production du dossier vidéo. Les auteurs remercient M. Benoit Peuteman et Mme Charlotte Auriau de l’INSERM Lavoisier (SEIVIL) US 33, Hôpital Paul Brousse, Villejuif pour leur expertise en matière de bien-être et de soins des animaux fournies dans le cadre de ce projet.

Toutes les expériences ont été approuvées par le ministère Français de l’Enseignement supérieur et de la Recherche (numéro d’étude : 122162017111616517670v2 et DAP180012). Toutes les souris ont été logées à leur arrivée dans des cages en plastique et ont eu droit à une période d’acclimatation de 7 jours avant l’étude. La salle des animaux a été maintenue à un cycle clair/foncé de 12/12 h (lumières allumées à 07:00). De la nourriture et de l’eau du robinet ont été fournis ad libitum. Les souris BALB/c et SKH1-Hrhr ont été nourries à un régime traditionnel à base de blé et de soja. La litière de sciure de scie a été fournie avec du matériel de nidification.
1. Préparation de l’équipement
<ol><li>Préparer un dispositif de combustion pour la procédure et le régler à 80 °C à l’aide du contrôleur de température (Figure 1A). Vérifiez la température du modèle en laiton (figure 1B,C)à l’aide de la caméra thermique infrarouge.</li>
	<li>Assurez-vous que le manomètre numérique fonctionne correctement.</li>
	<li>Couvrir la scène d’un drapé chirurgical et ajuster la hauteur de la table (figure 1A).</li>
</ol>2. Soins préopératoires et intraopératoires des animaux
<ol><li>Acquérir des souris BALB/c et SKH1-Hrhr, âgées de 6 à 8 semaines.</li>
	<li>Ajouter la suspension de paracétamol à 3 mg/mL à l’eau potable et fournir 12 heures avant et jusqu’à 72 heures après la procédure.</li>
	<li>À l’aide d’une seringue de 1 mL et d’une aiguille de 26 G, administrer de la buprénorphine sous-cutanéement à 0,05 μg/g 30 min avant la procédure et toutes les 6 heures pendant les 72 premières heures suivant la procédure.</li>
	<li>À l’aide d’une seringue de 1 mL et d’une aiguille de 26 G, administrer la lidocaïne au dorsum de la souris et 2-3 mm distal à la zone de la brûlure. Injecter de la lidocaïne à 0,05 μg/g sous-cutanéement 15 min avant l’induction de la plaie brûlée.</li>
	<li>Anesthétiser les souris à l’aide d’une injection intrapéritonéale de xylazine à 10 mg/kg et de kétamine 100 mg/kg. Utilisez une seringue de 1 mL et une aiguille de 26 G pour administrer l’injection.</li>
	<li>Étape critique : Placez la souris anesthésiée sur un tampon chauffé et gardez la souris au chaud pour prévenir l’hypothermie pendant les 30 premières minutes après l’induction de l’anesthésie et pendant au moins 15 minutes après la récupération de l’anesthésie. En plus de la garniture chauffée, d’autres modalités, y compris les lampes thermiques,les liquides chauds circulants ou de l’air, et les réservoirs de chaleur pré-réchauffés peuvent être utilisés pour réguler la température corporelle.</li>
	<li>Appliquer du gel de lubrification sur les yeux de la souris pour prévenir la déshydratation de la cornée.</li>
	<li>Utilisez le réflexe de retrait de pincement d’orteil pour évaluer la profondeur de l’anesthésie.</li>
	<li>À l’aide d’une seringue de 1 mL et d’une aiguille de 26 G, administrer 200 μL de solution de ringer lactated complétée par 5 % de dextrose. Administrer le remplacement du liquide sous-cutanéement immédiatement après l’induction de l’anesthésie et 6 heures après la procédure pour prévenir la déshydratation.</li>
</ol>3. Induction de brûlure de brûlure d’épaisseur complète
<ol><li>Raser la souris anesthésiée avec les coupe-cheveux.</li>
	<li>Appliquer la crème de dépilation sur la surface dorsale de la souris pendant 1 minute. Essuyez la crème à l’aide de gaze stérile et nettoyez la zone avec un morceau de gaze humide. Éponger la peau avec un peu de gaze jusqu’à ce qu’elle soit sèche.</li>
	<li>Placez la souris sur la scène recouverte d’un drapé chirurgical et déplacez la scène vers le haut plus près du modèle de laiton préchauffé.</li>
	<li>Appliquer le modèle circulaire en laiton à l’arrière de la souris (80 °C pour 20 s) en utilisant une pression constante de 0,15 N (figure 2).</li>
	<li>
Étape critique : Immédiatement après l’induction de brûlure, placez l’animal anesthésié sur le tampon chauffé pour prévenir l’hypothermie et garder la souris au chaud pendant et après la procédure. Une fois récupéré de l’anesthésie, retourner la souris dans la cage.</li>
	<li>
Étape critique : Fournir un régime en purée sur le plancher de la cage pendant les 72 premières heures après l’intervention chirurgicale. Les souris sont parfois réticentes à atteindre jusqu’à un tube sipper pour boire de l’eau après une blessure de brûlure.</li>
</ol>4. Récolte de la greffe de donneur
<ol><li>Faire une incision longitudinale avec un scalpel dans la partie supérieure de la queue de la souris donneuse et enlever doucement la peau à l’aide de forceps chirurgicaux.</li>
	<li>Placer la peau de la queue dans une boîte de Pétri stérile remplie de 10 mL de solution saline stérile de 0,9%. Utilisez une règle pour mesurer les greffes individuelles et couper la peau de la queue en morceaux, chacun mesurant 15 mm, à l’aide d’un scalpel.</li>
	<li>Une fois préparées, conservez les greffes de peau dans une solution saline de 0,9 % à 4 °C pendant jusqu’à 2 heures.</li>
</ol>5. Excision chirurgicale et greffe de peau
<ol><li>Vingt-quatre heures après l’induction de brûlure, préparer la souris pour l’anesthésie par inhalation d’isoflurane. Placez la souris dans la chambre d’induction et induisez l’anesthésie à l’aide de 5% d’isoflurane dans 100% d’oxygène à un débit de 4 L/min. Pour maintenir l’anesthésie pendant la chirurgie, utilisez 2% d’isoflurane à 2 L/min.</li>
	<li>Placez un drapé chirurgical sur la souris et découpez une fenêtre pour exposer le champ chirurgical. En utilisant la technique aseptique, écouvillonner la plaie d’abord avec de l’iode povidone, puis avec 70% d’alcool.</li>
	<li>Prenez doucement le tissu brûlé avec une paire de pinces chirurgicales et excisez tous les tissus nécrotiques et non viables avec des ciseaux chirurgicaux stériles et des pinces à épiler. Retirez la couche de panniculus carnosus de l’hypoderme pour créer un lit de destinataire stable.</li>
	<li>Placez la greffe de peau sur le lit de blessure fraîchement préparé. Tirez doucement la peau environnante vers la greffe de peau à l’aide de pinces chirurgicales. Appliquer un peu d’adhésif chirurgical pour attacher la greffe au lit de la plaie et presser doucement pour aligner les bords de la peau. Étape critique : La taille du lit de blessure doit être légèrement plus grande que la taille de la greffe de peau pour assurer l’engreffement réussi.</li>
	<li>Permettre à la souris de se remettre de l’anesthésie. Étape critique: Placez la souris sur un pavé chauffant. Gardez la souris au chaud pendant et après la procédure pour prévenir l’hypothermie.</li>
	<li>Appliquer un pansement inerte de gaze de paraffine et un pansement secondaire adhésif sur la plaie greffée.</li>
	<li>Placez la souris dans une cage individuelle. Étape critique : Fournir un régime en purée sur le plancher de la cage pendant les 72 premières heures après l’intervention chirurgicale et surveiller quotidiennement.</li>
	<li>Fournir des jouets et enrichir l’environnement.</li>
</ol>6. Imagerie numérique et collecte des plaies post mortem
<ol><li>Photographiez les blessures à l’aide d’un appareil photo numérique en plaçant une règle à côté de la plaie (figure 3).</li>
	<li>À la fin de l’expérience, euthanasier les animaux par l’exposition au dioxyde de carbone et à la dislocation cervicale. Étape critique: L’action de traction excessive de la peau pendant la dislocation cervicale peut endommager la greffe.</li>
	<li>À l’autopsie, excise chirurgicalement les blessures dorsales de brûlure au fascia à l’aide de ciseaux. Blessures en deux. Fixer la moitié dans 10% de formaline tamponnée et le processus pour l’histologie et l’immunohistochimie. Congeler rapidement l’autre moitié dans l’azote liquide pour l’extraction de l’ARN et la quantitation des protéines et le conserver à -80 °C.</li>
</ol>7. Histologie de peau, immunohistorique et visualisation de collagène
<ol><li>Incorporer des échantillons de peau dans la paraffine, couper à 4 sections de μm et placer sur des lames chargées positivement.</li>
	<li>Utilisez des diapositives tachées d’hématoxyline et d’éosine pour évaluer le taux de rééthelialisation (% de la plaie d’origine). La zone de la plaie recouverte de néo-épiderme peut être exprimée en pourcentage de la plaie entière (figure 4). Utilisez une application de microscope numérique et un logiciel ImageJ pour effectuer l’analyse microscopique des sections.</li>
	<li>Utiliser des sections histologiques (4 μm d’épaisseur) préparées à partir de tissus fixes et de paraffine et les soumettre à l’immunohistochimie.</li>
	<li>Pour évaluer l’expression du collagène I et de la fibronectine chez les plaies, appliquer des anticorps primaires et incuber pendant 1 h. La détection peut être effectuée par des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort spécifiques à l’espèce (HRP) ou à la phosphatase alcaline (AP).</li>
	<li>Réagissez les sections avec : (i) HRP,3,3'-diaminobenzidine (DAB) ou (ii) AP, Bond Polymer Affine Red (Table of Materials), qui donne une couleur rouge vif (Figure 5). Numérisez les sections à l’aide d’un instrument et analysez avec l’application de microscope numérique et ImageJ.</li>
	<li>Pour permettre l’évaluation histologique du dépôt de collagène, effectuer la coloration trichrome sur les sections histologiques à l’aide d’un kit commercial.</li>
	<li>Pour la visualisation des fibres de collagène, utilisez la microscopie multiphoton et la technique de deuxième génération harmonique (Figure 5). Utilisez un microscope multiphoton pour l’imagerie tissulaire comme précédemment décrit20. Utilisez un laser Ti:Sapphire avec une longueur d’onde centrale à 810 nm comme source laser pour générer des signaux de fluorescence excités deuxième harmonique et à deux photons (TPEF).</li>
	<li>Utilisez un faisceau laser équipé d’un objectif 25x/0.95 W pour collecter et exciter la deuxième génération harmonique (SHG) et TPEF. Détecter les signaux tels que décrits précédemment21 par les détecteurs pmt NDD. Utilisez un logiciel pour le contrôle de balayage laser et l’acquisition d’images.</li>
</ol>

<ol><li>Shakir, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indications+and+Limitations+of+Bilayer+Wound+Matrix-Based+Lower+Extremity+Reconstruction%3A+A+Multidisciplinary+Case-Control+Study+of+191+Wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Indications and Limitations of Bilayer Wound Matrix-Based Lower Extremity Reconstruction: A Multidisciplinary Case-Control Study of 191 Wounds.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. , (2019).</li>
<li>Greenhalgh, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+Burns%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Management of Burns.</a> New England Journal of Medicine. 380 (24), 2349-2359 (2019).</li>
<li>Bosse, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+outcomes+of+reconstruction+or+amputation+after+leg-threatening+injuries%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">An analysis of outcomes of reconstruction or amputation after leg-threatening injuries.</a> New England Journal of Medicine. 347 (24), 1924-1931 (2002).</li>
<li>Braza, M. E., Fahrenkopf, M. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBraza%2C+ME+%22StatPearls%22">StatPearls</a>. , (2019).</li>
<li>Duchesne, C., Banzet, S., Lataillade, J. J., Rousseau, A., Frescaline, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+atmospheric+plasma+modulates+endothelial+nitric+oxide+synthase+signalling+and+enhances+burn+wound+neovascularisation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Cold atmospheric plasma modulates endothelial nitric oxide synthase signalling and enhances burn wound neovascularisation.</a> Journal of Pathology. 249 (3), 368-380 (2019).</li>
<li>Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+repair+and+regeneration%3A+mechanisms%2C+signaling%2C+and+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation.</a> Science Translational Medicine. 6 (265), 266(2014).</li>
<li>Pakyari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+Expression+of+Indoleamine+2%2C3%2C+Dioxygenase+Prolongs+Allogenic+Skin+Graft+Take+in+a+Mouse+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Local Expression of Indoleamine 2,3, Dioxygenase Prolongs Allogenic Skin Graft Take in a Mouse Model.</a> Advances in Wound Care. 8 (2), New Rochelle. 58-70 (2019).</li>
<li>Pakyari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+skin+grafting+in+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">A new method for skin grafting in murine model.</a> Wound Repair and Regeneration. 24 (4), 695-704 (2016).</li>
<li>McFarland, H. I., Rosenberg, A. S. Skin allograft rejection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMcFarland%2C+HI+%22Current+Protocols+in+Immunology%22">Current Protocols in Immunology</a>. , Chapter 4, Unit 4 4 (2009).</li>
<li>Cristobal, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+Growth+Hormone+Therapy+for+Pressure+Ulcer+Healing+on+a+Human+Skin+Mouse+Model%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Local Growth Hormone Therapy for Pressure Ulcer Healing on a Human Skin Mouse Model.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), (2019).</li>
<li>Melican, K., Aubey, F., Dumenil, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+mouse+model+to+study+bacterial+infections+targeting+the+microvasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Humanized mouse model to study bacterial infections targeting the microvasculature.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).</li>
<li>Racki, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOD-scid+IL2rgamma%28null%29+mouse+model+of+human+skin+transplantation+and+allograft+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">NOD-scid IL2rgamma(null) mouse model of human skin transplantation and allograft rejection.</a> Transplantation. 89 (5), 527-536 (2010).</li>
<li>Larsen, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+and+maturation+of+Langerhans+cells+in+skin+transplants+and+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Migration and maturation of Langerhans cells in skin transplants and explants.</a> Journal of Experimental Medicine. 172 (5), 1483-1493 (1990).</li>
<li>Leonard, D. A., Kurtz, J. M., Cetrulo, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+composite+allotransplantation%3A+towards+tolerance+and+the+importance+of+skin-specific+immunobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Organ+Transplantationt%22%5BJournal%5D)">Vascularized composite allotransplantation: towards tolerance and the importance of skin-specific immunobiology.</a> Current Opinion in Organ Transplantationt. 18 (6), 645-651 (2013).</li>
<li>Stoikes, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+evaluation+of+fixation+properties+of+fibrin+glue+for+ventral+incisional+hernia+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Hernia%3A+The+Journal+of+Hernias+and+Abdominal+Wall+Surgery%22%5BJournal%5D)">Biomechanical evaluation of fixation properties of fibrin glue for ventral incisional hernia repair.</a> Hernia: The Journal of Hernias and Abdominal Wall Surgery. 19 (1), 161-166 (2015).</li>
<li>Foster, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+safety+of+a+fibrin+sealant+for+adherence+of+autologous+skin+grafts+to+burn+wounds%3A+results+of+a+phase+3+clinical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Burn+Care+%26+Research%22%5BJournal%5D)">Efficacy and safety of a fibrin sealant for adherence of autologous skin grafts to burn wounds: results of a phase 3 clinical study.</a> Journal of Burn Care & Research. 29 (2), 293-303 (2008).</li>
<li>Caro, A. C., Hankenson, F. C., Marx, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+thermoregulatory+devices+used+during+anesthesia+of+C57BL%2F6+mice+and+correlations+between+body+temperature+and+physiologic+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Comparison of thermoregulatory devices used during anesthesia of C57BL/6 mice and correlations between body temperature and physiologic parameters.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (5), 577-583 (2013).</li>
<li>Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+Techniques+Made+Simple%3A+Animal+Models+of+Wound+Healing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Research Techniques Made Simple: Animal Models of Wound Healing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).</li>
<li>Wang, X., Ge, J., Tredget, E. E., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+excisional+wound+splinting+model%2C+including+applications+for+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The mouse excisional wound splinting model, including applications for stem cell transplantation.</a> Nature Protocols. 8 (2), 302-309 (2013).</li>
<li>Ruzehaji, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pan+PPAR+agonist+IVA337+is+effective+in+prevention+and+treatment+of+experimental+skin+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Rheumatic+Diseases%22%5BJournal%5D)">Pan PPAR agonist IVA337 is effective in prevention and treatment of experimental skin fibrosis.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (12), 2175-2183 (2016).</li>
<li>Ruzehaji, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+effect+of+genetic+background+and+gender+in+a+mouse+model+of+bleomycin-induced+skin+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Combined effect of genetic background and gender in a mouse model of bleomycin-induced skin fibrosis.</a> Arthritis Research & Therapy. 17, 145(2015).</li>
<li>Singer, A. J., Burn Boyce, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+Healing+and+Tissue+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Burn+Care+%26+Research%22%5BJournal%5D)">Wound Healing and Tissue Engineering.</a> Journal of Burn Care & Research. 38 (3), 605-613 (2017).</li>
<li>Shakespeare, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burn+wound+healing+and+skin+substitutes%5BTitle%5D)+AND+%22Burns%22%5BJournal%5D)">Burn wound healing and skin substitutes.</a> Burns. 27 (5), 517-522 (2001).</li>
<li>Sun, B. K., Siprashvili, Z., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+skin+grafting+and+treatment+of+cutaneous+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Advances in skin grafting and treatment of cutaneous wounds.</a> Science. 346 (6212), 941-945 (2014).</li>
<li>Miller, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Staphylococcus+aureus+reporter+strain+with+click+beetle+red+luciferase+for+enhanced+in+vivo+imaging+of+experimental+bacteremia+and+mixed+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Development of a Staphylococcus aureus reporter strain with click beetle red luciferase for enhanced in vivo imaging of experimental bacteremia and mixed infections.</a> Scientific Reports. 9 (1), 16663(2019).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Selon la classification d’épaisseur des brûlures23, les brûlures d’épaisseur complète sont caractérisées par une implication évidente de toute l’épaisseur de la peau et d’une partie du tissu sous-cutané. Ce type de blessure ne peut guérir que par contraction ou avec la greffe de peau2. Une limite inhérente à la méthode décrite dans cet article est que seules les greffes de pleine épaisseur, par opposition aux greffes d’épaisseur fendue, qui sont souvent utilisées dans le cadre clinique, ont été récoltées à partir de la queue d’une souris. Cela était dû à la difficulté technique, car la peau de la souris est trop mince pour obtenir des greffes d’épaisseur fendue. Il faut souligner que les greffes de pleine épaisseur nécessitent un lit de plaie bien vascularisé, tandis que les greffes de peau d’épaisseur fendue sont capables de survivre aux sites de donneur avec moins de vascularité24. Des études antérieures ont montré qu’une brûlure induite à l’arrière de la souris était associée à une formation robuste de nouvelle vascularisation5. Ceci suggère qu’une zone bien vascularisée, telle que le dorsum de la souris, pourrait être considérée comme le point de repère anatomique pour l’induction des blessures de brûlure.
La profondeur des plaies brûlées est un facteur important à considérer. La profondeur de la brûlure doit être cohérente entre les souris individuelles. La reproductibilité de la profondeur de la plaie de brûlure dépend de la température du gabarit en laiton, de la pression et de la durée de l’exposition à la chaleur. La profondeur de la brûlure doit être vérifiée histologiquement. Il est important de garder à l’esprit que la pression excessive ou l’exposition prolongée de la peau au modèle de laiton préchauffé peut blesser le tissu sous-jacent. Le tissu entourant la colonne vertébrale, y compris les composants du système nerveux central et périphérique, est sensible à la chaleur et, s’il est endommagé, il peut entraîner une paralysie de la jambe arrière.
Bien qu’aucune mortalité postopératoire n’ait été directement associée à la procédure chirurgicale, un petit nombre de souris SKH1-Hrhr glabres, qui sont particulièrement sensibles au froid, ont développé l’hypothermie et n’ont pas réussi à récupérer après l’anesthésie générale. Par conséquent, la chaleur supplémentaire doit être fournie pendant tous les événements esthétiques et une surveillance constante est nécessaire pendant que la souris est anesthésiée.
La méthode décrite dans cette étude n’a pas été associée à l’infection chirurgicale de site. Cependant, la technique aseptique doit être employée pour empêcher le transfert des micro-organismes dans la blessure chirurgicale pendant la période périopératoire. L’inoculation de la plaie avec des micro-organismes bioluminescents ou fluorescents peut être incorporée dans la procédure. Cette technique peut être utile dans l’étude des organismes infectieux et de leur pathogénie25. Par exemple, l’addition exogène ou l’injection de bactéries bioluminescentes, peut permettre la surveillance de la charge microbienne à l’aide de l’imagerie animale entière in vivo25. Étant donné que les cheveux de souris sont connus pour interférer avec la fluorescence animale entière in vivo et l’imagerie de bioluminescence, les souris SKH1-Hrhr glabres sont des hôtes idéaux pour les études impliquant des reporters fluorescents ou bioluminescents.
Les échantillons de tissus de plaies peuvent être prélevés à différents moments et traités pour l’analyse histologique et immunohistochimique. Les protéines et l’ARN peuvent être isolés de la biopsie de la peau et les techniques de biologie moléculaire peuvent être utilisées pour évaluer l’expression des molécules clés impliquées dans la cicatrisation des plaies.
Dans la présente étude, nous avons décrit un modèle expérimental de cicatrisation des plaies de brûlures et d’engreffement allogénique de la peau. Cette procédure peut être modifiée et servir de modèle pour les études précliniques.

Le débridement chirurgical et la greffe de peau sont des pratiques cliniques courantes utilisées dans la gestion des blessures chroniques1, brûlures2, et des blessures aiguës telles que les blessures traumatiques3. La greffe de peau se réfère à la procédure chirurgicale, qui implique l’enlèvement de la peau saine d’une partie du corps et le transférer à une autre. Les greffes de donneurs remplacent le tissu perdu et fournissent un échafaudage structurel pour la migration et la croissance cellulaires. Après l’intégration dans le site récepteur, les greffes de peau remplacent la barrière cutanée perdue en offrant une protection contre l’invasion microbienne, les effets nocifs de l’environnement externe et la perte excessive d’humidité4. L’intégration réussie de greffe de peau dépend de plusieurs facteurs. Ceux-ci incluent des réponses immunitaires adéquates en présence d’infections microbiennes et la résolution opportune de l’inflammation, l’angiogenèse robuste au site de blessure et l’établissement des anastomoses vasculaires entre le lit de destinataire et la greffe de donneur5. Comme la greffe commence à se dégrader, les cellules cutanées résidentes doivent être remplacées par des cellules capables de produire une nouvelle matrice extracellulaire. Dans le même temps, les kératinocytes épidermiques doivent ramper au-dessus de la matrice nouvellement produite pour former le néo-épiderme et ré-épithélialiser la blessure. Il est donc évident que la migration efficace des cellules du lit receveur vers la greffe du donneur est un autre facteur déterminant qui influence l’incorporation réussie de greffe. Compte tenu du grand nombre de facteurs impliqués dans la cicatrisation des plaies6, qui peut être impossible à contrôler dans les essais humains en raison de limitations éthiques, des modèles de greffe de peau expérimentale préclinique sont nécessaires. Le développement de modèles précliniques de la cicatrisation des plaies brûlées et de la greffe de peau associée sera important pour la compréhension des mécanismes complexes impliqués dans la réparation des tissus cutanés et essentiels pour l’essai de nouveaux agents thérapeutiques. Les modèles in vitro de la cicatrisation des plaies sont incapables d’imiter avec précision la complexité du tissu cutané. Les modèles animaux in vivo sont un outil d’investigation indispensable pour comprendre les mécanismes impliqués dans la réparation des tissus.
Plusieurs méthodes de la technique de greffe de peau ont été développées chez les rongeurs pour imiter l’excision chirurgicale et la reconstruction de blessure de brûlure7,8,9. Cependant, la plupart des procédures précédemment décrites n’ont pas réussi à induire une blessure thermique de brûlure avant la greffe de peau. Au lieu de la blessure de brûlure, une blessure excisionnelle pleine épaisseur a été induite, qui a ensuite été reconstruite avec une allogreffe de peau pleine épaisseur7. Divers repères anatomiques tels que l’oreille, la queue et le dos ont été utilisés pour la récolte de la peau du donneur chez les rongeurs7,8. Différentes techniques de fixation et de stabilisation de greffe ont été rapportées, y compris une « technique sans suture »9, des sutures7 et de la colle chirurgicale10,11,12.
Le but de cette étude était de développer un modèle murin d’une blessure de brûlure d’épaisseur complète qui récapitulerait l’approche d’étalon-or actuelle dans le traitement de brûlure, qui implique l’excision non viable de tissu et la greffe de peau. Une brûlure thermique a été induite sur la surface dorsale d’une souris à l’aide d’un modèle en laiton préchauffé. L’eschar de brûlure a été excisé et remplacé par une greffe d’épaisseur complète récoltée à partir de la queue d’une souris de donneur. Ce modèle expérimental présente trois avantages clés. Tout d’abord, plus d’une blessure de brûlure peut être induite sur le dos de la souris bénéficiaire, et quatre greffes de peau de donneur peuvent être récoltées à partir d’une seule queue de la souris de donneur. Cela signifie que plusieurs traitements expérimentaux et témoins peuvent potentiellement être comparés à l’aide des mêmes animaux receveurs et donneurs. Selon la voie d’administration souhaitée, le traitement témoin peut inclure l’administration locale ou systémique du véhicule ou le contrôle placebo (p. ex., application topique de pommade, sous-cutanée, intrapéitoneal ou injection intraveineuse de solution). Deuxièmement, le moment du traitement et le point final de l’expérience peuvent être contrôlés. Troisièmement, ce modèle dépend de la reconstruction des plaies à l’aide de greffes pleine épaisseur récoltées à partir de la queue, qui sont connus pour avoir une plus grande probabilité d’incorporation réussie dans le site du donneur par rapport à la peau récoltée à partir du dos13. Cela peut être dû au nombre inférieur de cellules épidermiques de Langerhans, qui jouent un rôle clé dans l’immunobiologie cutanée, et sont associés au rejet de greffe de peau14.
Le modèle proposé de cicatrisation des plaies et d’intégration des greffes pourrait bien être appliqué aux souris transgéniques et knock-out. L’utilisation de souris génétiquement modifiées aidera à élucider les rôles que certains gènes peuvent jouer lors de la réparation des plaies. L’application exogène des préparations topiques de blessure ou de l’administration sous-cutanée des anticorps thérapeutiques au site de la blessure peut également être considérée.
En raison de difficultés techniques, les greffes de peau d’épaisseur fendue composées de l’épiderme et d’une partie du derme sont difficiles à obtenir chez les souris. Les greffes de peau de pleine épaisseur se composant de l’épiderme et du derme de pleine épaisseur sont connues pour exiger un lit de blessure bien vascularisé pour l’intégration réussie. L’incapacité de récolter des greffes de peau d’épaisseur fractionnée chez les souris peut être considérée comme une limitation de ce modèle. La fixation de la greffe de peau au lit de blessure de destinataire a été réalisée par l’application de la colle adhésive chirurgicale, qui est associée à moins de trauma et de dégradation rapide par rapport à d’autres moyens de fixation de tissu15. Des études antérieures ont montré que la suture est associée à une fixation plus forte des tissus que la colle chirurgicale à 24 h après la procédure chirurgicale15, qui peut être considéré comme un inconvénient de la procédure. Cependant, à des délais ultérieurs, la force biomécanique des plaies traitées avec un adhésif chirurgical devient comparable aux sutures15 et mieux que la fixation de base16. Après la fixation des tissus avec la colle chirurgicale, les blessures doivent être recouvertes d’un pansement. Bien que les blessures sur la surface dorsale de la souris soient difficiles à atteindre pour l’animal, l’habillage de blessure, d’autre part, est facile à manipuler et à enlever pour l’animal. Des changements fréquents d’habillage de blessure peuvent être justifiés.
L’hypothermie induite par l’anesthésie chez les petits rongeurs est un phénomène bien documenté17. L’hypothermie est un effet secondaire de cette procédure, qui provoque des complications, et compromet potentiellement la santé animale et la qualité des données. Par conséquent, cette méthode justifie la mise en œuvre de stratégies de gestion de la température, surtout si des SKH1-Hrhr glabres sont utilisées.
La limitation la plus importante de l’utilisation de souris pour imiter la fermeture des plaies humaines est la différence entre l’anatomie de la peau et la physiologie. Les blessures de souris guérissent principalement par contraction, tandis que les blessures humaines guérissent par la formation de tissu de granulation et la rééthelisation18. Pour tenir compte de cet écart, le modèle actuel peut être modifié et utilisé en combinaison avec un anneau d’attelle étroitement collé autour de la plaie pour prévenir la contraction de la peau19. Compte tenu de certains avantages et inconvénients de ce protocole in vivo, ce modèle pourrait servir d’outil pour étudier certains processus impliqués dans la cicatrisation des plaies qui sont impossibles à étudier in vitro.

<table><tbody><tr><td>1 ml syringue</td><td>Terumo</td><td>SS + 01T1</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille 26 G</td><td>Terumo Agani</td><td>NN-2613R</td><td>1/2'' - 0,45 X 12mm</td></tr><tr><td>96X21 mm Boîte de Pétri</td><td>Dutscher</td><td>193199</td><td></td></tr><tr><td>Animal Balance de pesage</td><td>Kern EMB</td><td>5.2K5</td><td></td></tr><tr><td>BALB/c souris</td><td>Janvier labs</td><td>BALB/cAnNRj</td><td>6 semaines</td></tr><tr><td>Tampons en mousse de biopsie 30.2X25.4X2mm</td><td>Simport</td><td>M476-1</td><td></td></tr><tr><td>Bond polymer Refine Red</td><td>Leica Biosystems</td><td>DS9390</td><td></td></tr><tr><td>Bloc de laiton</td><td>BVG</td><td>conçu sur mesure</td><td>Circulaire 10 mm de diamètre</td></tr><tr><td>Buprénorphine (BUPRECARE)</td><td>Axience</td><td>FR/V/6328396 3/2011</td><td>administré par voie sous-cutanée à une dose de 0,05 &mu ; g/ g</td></tr><tr><td>Appareil de combustion Kausistar 400</td><td>Tra&ccedil ; aMatrix</td><td>34010</td><td></td></tr><tr><td>CaseViewer</td><td>3DHISTECH Ltd.</td><td></td><td>3Dhistech, Budapest, Hongrie</td></tr><tr><td>Collagène I anticorps</td><td>Abcam</td><td>ab34710</td><td>Concentration recommandée 1:50 ; 1:200</td></tr><tr><td>D-(+)- glucose (Dextrose)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G-8769-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>DAB</td><td>Leica Biosystems</td><td>AR9432</td><td></td></tr><tr><td>Appareil photo numérique</td><td>NIKON</td><td>D3400</td><td>objectif : SIGMA 18-250mm F3.5-6.3 DC MACRO C45</td></tr><tr><td>Crème épilante</td><td>Veet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scalpels jetables</td><td>Swann Morton</td><td>6601</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>PAN biotech</td><td>P04-36300</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol absolu</td><td>VWR chemicals</td><td>20821.310</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps contre la fibronectine</td><td>Abcam</td><td>ab23750</td><td>Dilution recommandée 1:1000</td></tr><tr><td>Filtre 0.22um</td><td>Sartorius</td><td>16532</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux fins</td><td>F.S.T.</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Pince Dumont</td><td>F.S.T.</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Tondeuse</td><td>à cheveux AESCULAP</td><td>B00VAQ4KUY (ISIS)</td><td></td></tr><tr><td>Coussin chauffant</td><td>Petelevage</td><td>120070</td><td></td></tr><tr><td>Isofluorane</td><td>Piramal healthcare</td><td>FR/V/03248850/2011</td><td></td></tr><tr><td>Kétamine</td><td>Imalgene</td><td>FR/V/0167433 4/1992</td><td>Anesthésique chirurgical, administré par voie intrapéritonéale à la dose de 100mg/kg</td></tr><tr><td>Lactated Ringers solution</td><td>Flee-Flex</td><td>1506443</td><td></td></tr><tr><td>Lamina scanner de lames multi-étiquettes</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>logiciel LAS Leica</td><td></td><td></td><td>version 2.7.3</td></tr><tr><td>Leica Bond III</td><td>Leica Biosystem</td><td>1757</td><td></td></tr><tr><td>Pansement Leukosilk</td><td>BSN medical</td><td>72669-01</td><td></td></tr><tr><td>Lidocaïne</td><td>Aguettant</td><td>N01BB02</td><td>analgésique local, administré par voie sous-cutanée à une dose de 0,05 &mu ; g/ g</td></tr><tr><td>Manomètre</td><td>Kern</td><td>HDB-5K5</td><td></td></tr><tr><td>Masson Trichrome Kit de coloration</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT15-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Cassettes de biopsie Micromesh</td><td>Simport</td><td>M507</td><td></td></tr><tr><td>Support inversé multiphoton Microscope Leica SP5</td><td>Microsystèmes Leica</td><td>DM500</td><td>Scanner 8000Hz NDD Détecteurs PMT</td></tr><tr><td>Pansement non adhérent Adaptic</td><td>Systagenix</td><td>A6222</td><td>12,7 cm X 22,9 cm</td></tr><tr><td>Ocrygel</td><td>Tvm France</td><td>###Paracetamol</td><td></td></tr> <tr><td>300mg</td><td>Dolliprane</td><td>Liquiz</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldheyde 4 %</td> <td>Produits chimiques VWR</td><td>1169945</td><td></td></tr><tr><td>Povidone-iode</td><td>MEDA pharma</td><td>D08AG02</td><td>dilué à 1:2</td></tr><tr><td>SKH1-Hrhr souris</td><td>Charles river</td><td>686SKH1-HR</td><td>6 semaines</td></tr><tr><td>Lames</td><td>Thermoscientifique</td><td>AGAA000080</td><td></td></tr><tr><td>Adhésif chirurgical</td><td>BSN medical</td><td>9927</td><td></td></tr><tr><td>Gaze stérile</td><td>Hartmann</td><td>418545/9</td><td>10 X 10 cm</td></tr><tr><td>Eau stérile</td><td>Versylene Fresenius</td><td>B230521</td><td></td></tr><tr><td>Champ chirurgical</td><td>Hartmann</td><td>2775161</td><td></td></tr><tr><td>Ti :Sapphire ChameleonUltra</td><td>Coherent</td><td>DS 16-02-16 F</td><td>Caméra thermique 690-1040 nm</td></tr><tr><td>Testo</td><td></td><td>Testo 868</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine (Rompum 2 %)</td><td>Bayer</td><td>FR/V/ 8146715 2/1980</td><td>Anesthésique chirurgical, administré par voie intrapéritonéale à la dose de 10 mg/kg</td></tr></tbody></table>

un modèle murine d’une blessure de brûlure reconstruite avec une greffe de peau allogénique

A Murine Model of a Burn Wound Reconstructed with an Allogeneic Skin Graft

Les blessures superficielles triviales guérissent sans complications par l’intention primaire. Les blessures profondes, telles que les brûlures d’épaisseur complète, guérissent par intention secondaire et nécessitent le débridement chirurgical et la greffe de peau. L’intégration réussie de la greffe de donneur dans un lit de blessure de destinataire dépend du recrutement opportun des cellules immunitaires, de la réponse angiogénique robuste et de la nouvelle formation extracellulaire de matrice. Le développement de nouveaux agents thérapeutiques, qui ciblent certains processus clés impliqués dans la cicatrisation des plaies, sont entravés par l’absence de modèles précliniques fiables avec une évaluation objective optimisée de la fermeture des plaies. Ici, nous décrivons un modèle peu coûteux et reproductible de la blessure expérimentale de brûlure de pleine épaisseur reconstruite avec une greffe de peau allogénique. La blessure est induite sur la surface dorsale des souris de type sauvage consanguine anesthésiées des arrière-plans BALB/C et SKH1-Hrhr. La brûlure est produite à l’aide d’un modèle en laiton mesurant 10 mm de diamètre, qui est préchauffé à 80 °C et livré à une pression constante pendant 20 s. L’eschar de brûlure est excisé 24 heures après la blessure et remplacé par une greffe d’épaisseur complète récoltée à partir de la queue d’une souris donneur génétiquement similaire. Aucun équipement spécialisé n’est nécessaire pour la procédure et les techniques chirurgicales sont simples à suivre. La méthode peut être implémentée et reproduite sans effort dans la plupart des milieux de recherche. Certaines limitations sont associées au modèle. En raison de difficultés techniques, la récolte de greffes de peau d’épaisseur fendue plus minces n’est pas possible. La méthode chirurgicale que nous décrivons ici permet la reconstruction des plaies de brûlure utilisant des greffes de peau pleine épaisseur. Il peut être utilisé pour effectuer des tests thérapeutiques précliniques.

Les résultats démontrent que le protocole développé est une méthode simple, qui permet l’induction d’une blessure de brûlure d’épaisseur complète chez les souris. Les brûlures sont induites à l’aide d’un modèle en laiton préchauffé (Figure 1A-C). La zone brûlée apparaît comme une blessure circulaire avec un eschar blanc et une zone hyperémique. La taille de la brûlure est légèrement plus grande à 24 heures après la brûlure à la suite du phénomène bien décrit connu sous le nom de progression des brûlures, qui est peut-être due à l’inflammation aiguë22. Après l’excision, les brûlures sont reconstruites à l’aide d’une greffe de peau allogénique (figure 3). Le jour 7 après la blessure de brûlure, les blessures deviennent vascularisées5, qui est une indication de l’engreffement réussi. Les kératinocytes épidermiques migrent de la peau adjacente de destinataire dans l’effort pour fermer la blessure et combler l’écart entre les deux bords des blessures. L’analyse microscopique de la section tachée de H et E des blessures a révélé que la longueur du néo-épiderme devient significativement plus longue le jour 7 après brûlure par rapport au jour 3 après brûlure (Figure 4B). Avant d’effectuer une grande étude, il est fortement recommandé que les chercheurs réalisent une étude pilote, qui permet l’exploration d’une nouvelle intervention, l’évaluation de la faisabilité, l’identification des modifications à la méthode pour assurer la reproductibilité. Les effets statistiquement significatifs sont difficiles à détecter dans les échantillons plus petits, alors que l’augmentation de la taille de l’échantillon est un moyen d’accroître la puissance statistique d’un test. Par exemple, pour détecter une différence statistiquement significative (p &lt; 0,05) dans le taux de réé epithélialisation des plaies (figure 4)entre les groupes, la taille de l’échantillon devrait se trouver entre six et huit souris par groupe. Toutes les expériences doivent être répétées au moins deux fois. Comme les cellules productrices de matrice, telles que les fibroblastes, migrent du tissu receveur dans la greffe, les composants clés de la matrice extracellulaire, y compris le collagène I et la fibronectine deviennent fortement exprimés dans la matrice nouvellement formée (Figure 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61339/61339fig01.jpg"> Figure 1 : Configuration de l’appareil en feu. (A) Placement et mise en place du dispositif de combustion. Le dispositif de combustion est connecté au contrôleur de température et est fixé au monomètre numérique pour permettre la surveillance de la pression. Le dispositif de combustion est suspendu au-dessus d’une scène réglable – surface plane sur laquelle les souris sont placées pour l’induction de la brûlure. (B-C) Une image de gros plan du modèle en laiton utilisé pour induire des brûlures de blessure. (C) Le diamètre du modèle en laiton est de 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61339/61339fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61339/61339fig02.jpg"> Figure 2 : Illustration schématique des différentes étapes requises pour reproduire le modèle expérimental décrit dans cet article. Il y a trois étapes principales de la procédure : (i) l’induction de la plaie de brûlure à l’aide d’un modèle de laiton préchauffé; ii) l’excision chirurgicale du tissu nécrotique non viable à 24 heures après la brûlure; (iii) reconstruction chirurgicale de blessure utilisant une greffe de peau allogénique pleine épaisseur récoltée à partir d’une souris de donneur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61339/61339fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61339/61339fig03.jpg"> Figure 3 : Vue macroscopique des blessures reconstruites de brûlure de souris. Images numériques représentatives des blessures de brûlure reconstruites avec des greffes de peau allogéniques les jours 0, 1, 3 et 7 après des dommages de brûlure. La règle sur les images est en millimètres. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61339/61339fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61339/61339fig04.jpg"> Figure 4 : Aspect microscopique des blessures à 3 et 7 jours après brûlure. Sections tachées de H&amp;E de blessures 3 et 7 jours après les brûlures. La longueur du néo-épiderme (ligne pointillée) est significativement augmentée dans (A) jour 3 blessures par rapport à (B) jour 7 blessures. Dans (A) et (B), la barre d’échelle est de 100 μm. (C) Représentation graphique du pourcentage de réé epithélialisation de la plaie. Ceci a été évalué en mesurant la longueur du néo-épiderme au jour 3 et 7 de blessure post-brûlure et exprimé en pourcentage de la longueur entière de blessure. Les résultats représentent la moyenne ± S.E.M. (n = 6 souris dans le groupe du jour 3; n = 6 souris dans le groupe du jour 7, *p &lt; 0,05; T-test de l’étudiant). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61339/61339fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61339/61339fig05.jpg"> Figure 5 : Évaluation de la matrice extracellulaire et de la visualisation du collagène I. Images représentatives de l’analyse immunohistorique le jour 7 blessures de souris tachées pour (A) collagène et (B) fibronectine. Notez la coloration rouge intense dans les cellules I-positives en forme de fuseau allongé. Notez la coloration brune dans les cellules fibronectine-positives dans le derme des blessures de jour 7. Barre d’échelle = 50 μm dans toutes les images. Dans (A) et (B), e dénote l’épiderme et d dénote derme. (C) Visualisation des fibres de collagène et évaluation histologique du dépôt de collagène. (D) Représentant TPEF/SHG image de collagène du jour 7 blessures de souris. L’acquisition simultanée de TPEF/SHG à l’aide de polarisation circulaire et de signaux SHG a été traitée de manière sélective afin d’obtenir une distribution binaire de SHG après l’application d’un seuil. Les images TPEF (vertes) et SHG (blanc) étaient pseudo-colorées et superposées. Barre d’échelle = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61339/61339fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Le but de cette étude était de développer un modèle murin de la cicatrisation des brûlures. Une brûlure thermique a été induite sur la peau dorsale des souris à l’aide d’un modèle de laiton préchauffé. Le tissu brûlé a été débrided et recouvert d’une greffe de peau récoltée à partir de la queue d’une souris de donneur génétiquement similaire.

Un modèle murine d’une blessure de brûlure reconstruite avec une greffe de peau allogénique

Trivial superficial wounds heal without complications by primary intention. Deep wounds, such as full thickness burns, heal by secondary intention and ...

L’objectif global de cette procédure est de créer un modèle murin reproductible de la plaie de brûlure pleine épaisseur reconstruite avec une greffe allergique de peau. La peau est divisée en deux composants l’épiderme et le derme. Sous le derme se trouve la graisse sous-cutanée, qui recouvre les os, les tendons ou les fascias.La classification de l’épaisseur des brûlures est souvent utilisée pour définir l’étendue de la profondeur des brûlures. Les brûlures superficielles n’impliquent que l’épiderme, les brûlures partielles superficielles d’épaisseur impliquent l’épiderme et seulement le pilori ou le derme supérieur. Les brûlures profondes d’épaisseur partielle dermique impliquent l’épiderme et le derme, le derme réticulaire contenant des vaisseaux sanguins, des follicules pileux, de l’huile et des glandes sudoripares.Les brûlures d’épaisseur complète sont caractérisées par la participation évidente de toute l’épaisseur de la peau et peut-être du tissu sous-cutané. Ce type de plaie ne peut guérir que par contraction ou par greffe de peau. L’objectif global de cette procédure était de créer une plaie de brûlure pleine épaisseur et reconstruite avec une greffe de peau pleine épaisseur.Ceci a été réalisé en mettant un bloc circulaire de laiton préchauffé à 80 degrés Celsius et appliqué sur la peau de bouche pour la durée de 20 secondes. Le tissu nécrotique a été chirurgicalement excisé 24 heures après la blessure de brûlure. Des greffes de peau pleine épaisseur récoltées à partir de la queue d’une souris donneuse ont été déposées sur les brûlures excisées.Les greffes seront ensuite sécurisées par un adhésif chirurgical. Les animaux donneurs et receveurs proviennent de la même souche consanguie de souris. Les souris biopsies sont utilisées au cours de l’étude.Cependant, aussi souche de souris peuvent également être utilisés. Cela inclut les souris glaores immunocompétentes, qui sont particulièrement utiles dans les études de cicatrisation des plaies. Comme épilation et inflammation associée un clochard a fait et la repousse des cheveux n’interfère pas avec l’analyse d’image numérique, lorsque les mesures de la zone et d’autres types d’évaluation microscopique des plaies.Cela est particulièrement vrai dans les modèles d’infection, où notre suspension du bio-organisme et des bactéries est appliquée à ce votre visage de la plaie et le signal bio-organisme est mesurée pour indiquer le taux de croissance bactérienne. Le dispositif de brûlage thermique se compose d’un bloc circulaire en laiton sur mesure mesurant 10 millimètres de diamètre préchauffé à 80 degrés Celsius. La température du bloc de laiton est vérifiée à l’aide d’une caméra thermique infrarouge.Pour créer une plaie de brûlure pleine épaisseur, le bloc de laiton est appliqué pendant 20 secondes en utilisant une pression constante de 0,15 Newtons qui est surveillé par manomètre numérique. L’analgésie multimodale est la meilleure pratique pour la gestion de la douleur dans les procédures invasives de recherche sur les animaux. Le régime d’administration idéal de l’analgésie comprend une administration analgésique préventive ou pré-procédurale.Le paracétamol à trois milligrammes par repas a été ajouté à l’eau potable et fourni 12 heures avant et pendant 72 heures après l’intervention. Buprénorphine à 0,05 microgramme par gramme a été administré sous-cutanée 30 minutes avant la procédure et toutes les six heures pendant les 72 premières heures après la procédure. La lidocaïne à cinq milligrammes par kilogramme a été administrée sous-cutanée autour du dorsum de chaque souris 15 minutes avant l’intervention, un volume total de 200 microlitres de solution de sonneries lactées à 5% dextrose a été injecté sous-cutané avant l’intervention, et six heures après la procédure pour prévenir la déshydratation.Les souris étaient nisertide utilisant une injection intraperitoneal de Xylazine à 10 milligrammes par kilogramme, et kétamine à 100 milligrammes par kilogramme. La profondeur anesthésique peut être évaluée au moyen d’une pincée d’un avant. L’anesthésie abolit le réflexe de clignotement, empêchant le rafraîchissement du film de déchirure nécessaire pour le maintien de l’hydratation cornéenne et l’œil continuellement exposé à l’air devient rapidement déshydraté, un lubrifiant a été appliqué sur les yeux pour maintenir l’hydratation de la cornée.Le dorsum de chaque souris est coupé et la crème depilating est appliquée pendant une minute pour enlever les cheveux. L’animal nisertide est positionné couché sur une table plate et la brûlure thermique est créée en appliquant un bloc de laiton circulaire préchauffé à 80 degrés Celsius pour une durée de 20 secondes. La souris, est placée de nouveau sur le coussin chauffant pour la garder au chaud et prévenir l’hypothermie, un effet secondaire fréquent des agents anesthésiques.Une fois récupérée de l’anesthésie, la souris peut être placée dans une cage individuelle. 24 heures après l’induction d’une brûlure. Le tissu nécrotique excite chirurgicalement.Quatre greffes de peau malades sont récoltées à partir de la queue de souris donneur euthanasier. Bien que d’autres côtés de sorte qu’il ya sous la queue peut également être en utilisant le modèle de souris. Ainsi, le degré de réponse humaine peut varier en fonction de l’origine de la greffe de peau du donneur.Par exemple, la peau de l’oreille et du dos n’ont plus en vente par rapport à la peau de la queue et provoquent une réponse humaine plus robuste, ce qui peut conduire au rejet de greffe. L’épaisseur des greffes de peau peut également être prise en compte car elle peut jouer un rôle déterminant dans l’engraftment réussi de la greffe de peau prendre. La peau sûre telle que celle du dos a une plus grande probabilité d’échec due aux exigences métaboliques plus élevées du tissu.Par conséquent, le succès rapporté de l’engraftment allergénique de greffe de peau pour la peau arrière est inférieur au succès rapporté pour la greffe de peau de queue. L’anesthésie a été induite par inhalation de 5% d’Isoflurane dans 100% d’oxygène à un débit de quatre litres par minute, suivie par le maintien de l’anesthésie en utilisant 2%Isoflurane à deux litres par minute pour l’entretien pendant la chirurgie. La buprénorphine a été administrée à l’initiation de la procédure pour fournir l’analgésie postopératoire.Les brûlures ont été préppées avec povidone-iode, suivie de 70% d’alcool. La brûlure nécrotique est excisée avec des ciseaux pour enlever le défaut circulaire de peau pleine épaisseur, la couche panniculus carnosus de l’hypoderme est enlevée pour créer un lit stable de destinataire de greffe de peau quelques auteurs suggèrent de préserver la couche panniculus de carnosus de l’hypoderme car il est censé être nécessaire pour la revascularisation de la greffe. Toutefois, dans ce cas, la mobilité de cette couche et les forces de cisaillement potentielles qui en résultent entre la greffe et le lit du receveur peuvent devenir problématiques.L’enlèvement de la couche panniculus de carnosus n’a pas eu d’impact défavorable sur le succès de la procédure de greffe. Les greffons de pleine épaisseur sont récoltés à partir de la queue de souris donneur euthanasié. La queue est incisée longitudinal, ce qui permet à la peau d’être séparée du tissu mou sous-jacent.La peau de la queue est ensuite étalée sur une boîte de Pétri remplie de solution saline stérile et normale et coupée en plaques circulaires à l’aide d’une règle. Les greffons sont ensuite transférés dans une boîte de Pétri avec une gaze stérile trempée dans la solution saline normale et gardé les quatre degrés jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être greffés. Les greffons sont ensuite fixés au lit du receveur avec de la colle chirurgicale.Les écarts entre la greffe de peau du donneur et le lit de plaie du receveur sont doucement pressés pour aligner les bords de la peau. Les plaies sont habillées dans de la gaze inerte de paraffine et un pansement secondaire adhésif. Des photographies numériques, des blessures greffées ont été prises à un, trois et sept jours après brûlure.À l’autopsie les brûlures dorsales ont été chirurgicalement excisées au fascia, les blessures ont été coupées en deux avec une moitié fixée dans la formaline tamponnée de 10%, et traitées pour l’histologie et l’immunohistochimie. Les greffes de peau fournissent un système d’échafaudage pour la migration cellulaire. L’intégration réussie de greffe dépend des fibroblastes efficaces et de la migration de kératinocyte de l’offre destinataire dans la greffe de donneur qui est lentement dégradée et remplacée par des cellules capables de produire la matrice extracellulaire.La section histologique des blessures de masse a été soumise à la coloration d’hématoxyline et d’éosine. Les images représentatives des sections tachées d’hématoxyline et d’éosine des blessures, ont montré que la longueur de l’épiderme proche mis en évidence en jaune est sensiblement augmentée le jour sept, comparé au jour trois après blessure de brûlure. Pour estimer le taux de rééthélisation, la zone de la plaie qui a été couverte d’épiderme proche a été exprimée en pourcentage de la plaie entière.La matrice extracellulaire est le composant non cellulaire de la peau, qui fournit un échafaudage pour les composants cellulaires. La matrice extracellulaire est composée de protéines fibreux, comme le collagène et la fibronectine. Ces molécules augmentent la maturité des blessures et maintiennent l’intégrité structurale de l’immunohistochimie semiquantitative de peau pour le type de collagène un, et les taches histologiques telles que mason’s trichrome peuvent être employées pour aider l’intégrité extracellulaire de matrice du micrographe de photo.Des méthodes plus sophistiquées telles que la microscopie de deuxième génération harmonique sont apparues comme un outil puissant pour l’analyse quantitative de la structure du collagène. La greffe de peau murine fournit un excellent modèle préclinique potentiel pour étudier l’intégration des graphiques dans le côté destinataire. Cette étude démontre une méthode fiable pour effectuer avec succès des greffes de peau dans un modèle de souris ainsi que l’évaluation histologique des plaies curatives.

a-murine-model-burn-wound-reconstructed-with-an-allogeneic-skin

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

La transplantation allogénique de la peau est un modèle standard d'analyse des réponses des cellules T à l'hôte antigènes du donneur MHC-disparates. Cette vidéo-article fournit un tutoriel visuelle de chaque étape à effectuer une greffe BALB/c--&gt; C57BL / 6 peau.

Transplantation de peau murine

Dans ce rapport, nous décrivons la peau en trois dimensions de reconstruire le modèle qui imite la peau humaine dans l'architecture et la composition. La physiologie des mélanocytes, la progression du mélanome et le destin des cellules souches dermiques ont été étudiés en utilisant la peau de reconstruire le modèle. Le modèle est également utile comme outil pour l'évaluation préclinique de médicaments.

La peau Three-Dimensional Human Reconstruire Modèle: un outil pour étudier la peau normale et la progression du mélanome

Cette vidéo montre une méthode de greffe de peau humaine sur une souris immunodéficiente avec une réponse neutrophile supprimée. La méthode consiste à appliquer de la peau humaine d'épaisseur fendue sur le lit de greffe de la souris, à le sceller et à le recouvrir pour la récupération. Finalement, la peau humaine adhère à la peau de la souris, établissant la vascularisation et la circulation, ce qui permet une xénogreffe de peau réussie.

Une technique de greffe de peau humaine dans un modèle murin

Un modèle murin de la cicatrisation cutanée qui peut être utilisé pour évaluer les composés thérapeutiques dans des contextes physiologiques et physiopathologiques.

Modèle murin de la cicatrisation

Murine transplantation pleine épaisseur peau est un modèle bien établi pour étudier le rejet dans un cadre de allo. Ici, nous vous proposons un tutoriel de chaque étape impliquée dans la réalisation d'une / c BALB -&gt; C57BL / 6 de pleine épaisseur greffe de peau.

Murine Transplantation de peau pleine épaisseur

L’allogreffe composite vascularisée offre des bienfaits qui altèrent la vie aux receveurs de greffe, mais les causes biologiques du rejet du greffon et de la vasculopathie demeurent mal comprises. Le modèle chirurgical des rongeurs présenté ici offre un modèle de transplantation reproductible, cliniquement pertinent, permettant aux chercheurs d’évaluer les événements de rejet et les stratégies thérapeutiques potentielles pour prévenir leur apparition.

Modèle de Rabat Ostéomyocutané Hétérootopique modifié dans le rat pour la recherche d’allotransplantation composite vascularisée translationnelle

Ici, deux modèles murins de guérison de blessure sont décrits, l’un conçu pour évaluer les réponses cellulaires et de guérison de blessure de cytokine et l’autre pour quantifier le taux de fermeture de blessure. Ces méthodes peuvent être utilisées avec des modèles complexes de maladies telles que le diabète pour déterminer les mécanismes de divers aspects de la mauvaise cicatrisation des plaies.

Évaluation de la guérison aigue des plaies à l’aide de l’implantation d’éponge d’alcool polyvinyl subcutanée et des modèles excisionaux de blessure de peau de queue.

Ce protocole décrit comment générer des blessures excisionnelles bilatérales et pleine épaisseur chez la souris et comment surveiller, récolter et préparer les plaies pour l’analyse morphométrique. On y trouve une description détaillée de la façon d’utiliser les sections histologiques périodiques pour définir, quantifier et détecter avec précision les défauts morphométriques.

Modèle de cicatrisation des plaies excisional murine et analyse histologique des plaies morphométriques

Le présent protocole décrit comment greffer de la peau humaine sur des souris non obèses diabétiques (NOD)-SCID à récepteur de la chaîne gamma (NSG) diabétiques (NOD). Une description détaillée de la préparation de la peau humaine pour la transplantation, de la préparation des souris pour la transplantation, de la transplantation de la peau humaine d’épaisseur fendue et de la procédure de récupération post-transplantation est incluse dans le rapport.

Modèle de peau de xénogreffe pour manipuler les réponses immunitaires humaines in vivo

Ce protocole décrit un modèle reproductible de brûlure multi-profondeur chez un miniporc du Yucatan.

Un modèle de brûlure porcine pour étudier le processus de cicatrisation dans plusieurs brûlures profondes

Un protocole simplifié est présenté pour établir un modèle de cicatrisation des brûlures chez la souris à l’aide d’un appareil de chauffage numérique. Les sites expérimentaux en forme d’échiquier créés sur la peau facilitent une analyse fonctionnelle plus poussée pour le test de cicatrisation des plaies.

Modèle de cicatrisation des brûlures en forme d’échiquier de souris basé sur un dispositif de chauffage numérique

Découvrez la création d'un modèle murin de brûlure totale avec greffe de peau allogénique. Cette méthode permet d'étudier la cicatrisation des plaies et l'intégration des greffes cutanées en conditions contrôlées.

Un modèle murine d’une blessure de brûlure reconstruite avec une greffe de peau allogénique

Explorer plus de vidéos