Multiplexage automatisé de l’échantillon à l’aide de l’étiquetage isotopique combiné des précurseurs et du marquage isobarique (cPILOT)

Grâce à notre protocole automatisé cPILOT, il est plus facile pour les chercheurs d’analyser les échantillons d’une manière à haut débit. C’est important parce qu’il nous permet d’obtenir des informations biologiques sur les maladies ou les différentes conditions beaucoup plus rapidement. Le principal avantage de cette technique est qu’elle aide à traiter plusieurs échantillons en parallèle, réduisant ainsi les erreurs actionnables tout en utilisant des échantillons à haut débit.

Notre laboratoire s’intéresse aux applications liées au vieillissement et à la maladie d’Alzheimer. Cependant, cette technique peut également être utilisée pour étudier n’importe quelle maladie ou défi pour où il ya des tissus biologiques impliqués. Commencez par allumer l’appareil à pression positive, le dispositif de chauffage et de refroidissement et les pompes à vide.

Connectez tous les accessoires avec le gestionnaire liquide, qui affichera une lumière bleue une fois connecté à l’ordinateur et prêt à fonctionner. Aliquot 300 microlitres du foie homogénéiser dans un tube de 500 microlitres et le placer sur une plaque de puits de deux millilitres de profondeur. Stockez l’échantillon à quatre degrés Celsius jusqu’au début du protocole.

Ouvrez la méthode dans le logiciel et placez les conseils et les logiciels de laboratoire requis dans leurs positions. Ensuite, recoupez avec la disposition du deck final et cliquez sur Suivant pour continuer le protocole. Chargez 230 pointes de microlitres et aspirez 90 microlitres de huit urée molaire du réservoir.

Ensuite, distribuez-le pour ramer l’une des plaques noires de puits de deux millilitres de profondeur. Déchargez les pointes de TL1 et répétez cette étape jusqu’à ce que l’urée ait été ajoutée à tous les puits. Après avoir ajouté le tampon de dénaturation, utilisez 90 conseils de microlitres pour transférer 10 microlitres d’homogénéité du foie de souris à la plaque de puits profonde.

Déchargez les pointes, puis chargez une rangée de 90 pointes de microlitres et aspirez trois microlitres de TNT de la plaque de réaccente un. Distribuez la TNT aux rangées une et deux de la plaque de puits profonde. Sceller la plaque d’échantillon avec du papier d’aluminium et l’incuber à 37 degrés Celsius pendant 600 secondes tout en tournant à 300 rPM.

Après l’incubation, chargez une rangée de 90 pointes de microlitres, aspirez six microlitres d’IAM de la plaque de réaccente une à la rangée trois, et distribuez-la pour ramer l’une des plaques d’échantillon. Sceller la plaque de l’échantillon et l’incuber à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes tout en tournant à 300 RPM sur le dispositif de refroidissement. Ensuite, déséclairez la plaque d’échantillon et chargez une rangée de 90 pointes de microlitres.

Aspirer cinq microlitres de cystine de la plaque de réaccente un à la rangée deux et le distribuer aux rangées un et deux de la plaque d’échantillon. Incuber la plaque à température ambiante pendant 30 minutes. Après l’incubation, effectuer une secousse à temps de 1800 RPM pendant 30 minutes.

Ajouter ensuite 800 microlitres de tampon Tris de 20 millimolaires avec chlorure de calcium de 10 millimlaires à chaque puits de la plaque d’échantillonnage pour diluer la concentration d’urée à deux molaires. Ajouter 20 microlitres de trypsine à la première rangée d’une plaque de puits 96 et placer la plaque à un endroit déterminé sur le pont. Après avoir ajouté la trypsine à la plaque échantillonnée, scellez-la et incubez-la pendant 15 heures à 37 degrés Celsius et 600 rPM sur le dispositif de chauffage et de refroidissement.

Arrêtez la digestion en aspirant 150 microlitres d’acide 5% formic de la rangée trois de la plaque acide formique et en la distribuant à la plaque d’échantillon aux rangées une et deux. Procéder à desalt les peptides. Utilisez 1070 pointes de microlitres pour aspirer 600 microlitres d’acétylonitrile.

Ensuite, distribuez-le dans les rangées une et deux de l’extraction de phase solide, ou plaque SPE, pour activer C-18. Ensuite, chargez l’échantillon digéré à la plaque SPE en deux passages. Chargez deux rangées de pointes, aspirez 534 microlitres des échantillons digérés et distribuez-les aux rangées une et deux de la plaque SPE.

Appliquez une pression sur la plaque et répétez cette étape jusqu’à ce que tous les échantillons soient chargés. Nettoyez les peptides en les lavant avec de l’eau et diluez les peptides avec 60 à 40 acétyltrile dans 0,1% d’acide formique. Placez ensuite la plaque sur une plaque de collecte pour épuuter les peptides à l’aide de l’appareil à pression positive.

Tirez vers le bas le flow-through et configurer les conseils requis et labware dans le logiciel, recouper avec la disposition du pont, et cliquez sur Suivant pour continuer le protocole de diméthylation. Reconstituer les peptides dans 1% d’acide acétique. Pour effectuer l’étiquetage de la diméthylation, chargez 90 pointes de microlitres et aspirez 16 microlitres de formaldéhyde léger millimolaire de la deuxième rangée de plaque de réavenant deux.

Distribuez-le pour ramer l’une des plaques d’échantillon, puis déchargez les pointes. Chargez une rangée de 90 pointes de microlitres et aspirez 16 microlitres de formaldéhyde lourd de 60 millimlaires de la rangée trois de la plaque de reagent deux. Distribuez-le rangée deux de la plaque d’échantillon et déchargez les bouts.

Chargez deux rangées de 90 pointes de microlitre et aspirez 16 microlitres de cyanoborohydride de sodium de 24 millimillilaires et de cyanoborodeuteride de sodium millimolaire des rangées un et deux de la plaque de réagent trois, puis distribuez les réagents aux rangées une et deux de la plaque d’échantillon pour commencer la réaction de diméthylation. Déchargez les pointes et utilisez le shaker orbital pour effectuer une secousse minuterie pendant 15 minutes à 1800 RPM. Chargez ensuite deux rangées de 90 pointes de microlitres et aspirez 32 microlitres de 1 % d’ammoniac provenant des rangées trois et quatre de la plaque de rééditage trois.

Distribuez-le en rangées une et deux de la plaque d’échantillonnage deux pour arrêter la réaction. Combinez des volumes égaux de peptides dimethylated légers et lourds dans une nouvelle plaque de puits profonde de deux millilitres pour le desalting. Après avoir desalcé les peptides légers et lourds combinés, séchez les peptides et effectuez le marquage isobarique.

Reconstituer les peptides avec 100 microlitres de tampon bicarbonate de triethylmonium de 100 millimlaires sur un shaker orbital. Ensuite, utilisez 90 pointes de microlitres pour aspirer 25 microlitres des peptides dimethylated combinés et les distribuer à la première rangée de la plaque de traitement TMT. Chargez une rangée de 90 pointes de microlitres et aspirez 10 microlitres de TMT.

Distribuez-le dans la première rangée de la plaque de traitement TMT, déchargez les pointes, puis effectuez un shake expiré pendant une heure à 1800 RPM. Aspirez huit microlitres d’hydroxylamine de la deuxième rangée de la plaque TEAB et distribuez-la pour ramer l’une des plaques de traitement TMT. Après une secousse de 15 minutes à 18 h RPM, transférez 30,5 microlitres des peptides étiquetés TMT dans un tube de 1,5 millilitre.

Procédez ensuite à l’acquisition et à l’analyse des données selon les directives manuscrites. Les données représentatives de MS d’un peptide identifié dans les 22 canaux d’ion de reporter d’un étiquetage isotopique combiné de précurseur de 22 Plex et de l’expérience isobaric de marquage sont montrées ici. La séquence du peptide correspond à la bêtaine-homocystéine S-méthyltransferase.

Les ions fragmentaires les plus intenses pour les pics de diméthylated légers et lourds ont été encore plus isolés pour la fragmentation de MS3. Les intensités d’ion de journaliste sont directement proportionnées à l’abondance de peptide dans l’échantillon. Dans l’ensemble, cette expérience combinée d’étiquetage isotopique des précurseurs et d’étiquetage isobarique a réduit les délais de traitement de l’échantillon et permis de visualiser l’expression des protéines à travers plusieurs canaux ou conditions.

L’intrigue de la boîte de journal 10 abondance par rapport à l’intensité totale reporter ion à travers l’ensemble des 22 canaux montre moins inter-puits ou inter-échantillon variabilité. L’évaluation de l’automatisation totale a été effectuée en examinant l’erreur dans l’abondance des ion des journalistes dans chaque protéine dans les 22 échantillons. Le traitement de l’échantillon avec la plate-forme robotique a entraîné de très faibles coefficients de variation.

Dans les 3098 peptides, le coefficient moyen de variation de l’abondance des ions des journalistes était de 12,36 et 15,03 % respectivement pour les peptides d diméthylés légers et lourds. Lorsque vous essayez ce protocole, il est important de garder à l’esprit que les niveaux isotopiques et isobariques sont utilisés dans une seule expérience. Par conséquent, une planification minutieuse doit être effectuée pour désigner chaque échantillon avec les étiquettes destinées à être utilisées dans l’expérience.

Cette méthode peut être facilement intégrée dans d’autres systèmes robotiques, et elle peut être appliquée à une variété de tissus, tels que les lysates tissulaires ou cellulaires et d’autres biofluides.