Digestion des yeux de souris entières pour l’analyse cytométrique de flux multi-paramètres des phagocytes mononucléaires

Ce protocole est conçu pour digérer des yeux de souris entiers en une suspension cellulaire unique pour la cytométrie en flux multiparamétrique des phagocytes mononucléaires qui comprennent les macrophages, les monocytes, les cellules microgliales et les cellules dendritiques. Le principal avantage de cette technique est la possibilité d’utiliser l’analyse quantitative avec l’intensité des fluorophores pour différencier des types de cellules étroitement apparentés en utilisant l’expression de marqueurs de surface cellulaire. Notre protocole est optimisé pour l’analyse de l’hétérogénéité des macrophages, y compris les populations résidentes et infiltrantes dans le modèle de néovascularisation choroïdienne induite par laser.

Cependant, ces concepts et techniques peuvent également être appliqués à d’autres modèles tels que la rétinopathie diabétique, l’uvéite auto-immune expérimentale, ainsi que les manifestations du lupus. Lorsque vous essayez ce protocole, la compréhension de la configuration de votre cytomètre est un point de départ essentiel, car tous les cytomètres ne sont pas configurés exactement de la même manière. Ainsi, il peut être nécessaire de titrer des volumes d’anticorps conjugués par fluorescence et/ou d’ajuster les fluorophores pour optimiser le protocole en fonction de la configuration de votre cytomètre.

Commencez par préparer le tampon de digestion selon les instructions du manuscrit. À l’aide d’un microscope de dissection et d’un grossissement total de 10X, retirez la conjonctive et le nerf optique restants des yeux. Déplacez les yeux propres vers une boîte de dissection sèche ou un petit bateau de pesée, puis faites deux plaies perforantes avec un angle de 90 degrés entre elles à travers l’axe visuel.

À l’aide d’une seringue munie d’une aiguille de calibre 30, injectez de 0,15 à 0,2 millilitre de tampon de digestion dans la cavité vitrée de chaque œil. Émincez les yeux avec des ciseaux à ressort et des pinces fines, puis dissociez le tissu de la lentille avec une perturbation mécanique contondante pour éviter de boucher les pointes de pipette lors des étapes suivantes. Rincez la pince et les ciseaux avec 0,75 millilitre de tampon de digestion et replacez le plat pour chaque échantillon.

À l’aide d’une pipette P1000, transférez le contenu de la coupelle dans un tube de dissociation sur de la glace, en prenant soin de ne pas perdre de matière. Rincez le plat avec 1,5 millilitres supplémentaires de tampon de digestion et ajoutez-le dans le tube de dissociation, ce qui porte le volume total entre 3,25 et 3,5 millilitres. Dissociez le tissu sur un dissociateur électronique comme décrit dans le manuscrit du texte, en vous assurant que tout le tissu se trouve au fond du tube de dissociation inversé et en contact avec le tampon de digestion.

Ensuite, incubez le tube de dissociation à 37 degrés Celsius et 200 tr/min pendant 30 minutes. Répétez la dissociation tissulaire deux fois de plus, en incubant l’échantillon à 37 degrés Celsius et 200 tr/min pendant 30 minutes entre les dissociations. Pour arrêter la réaction, ajoutez 10 millilitres de tampon d’écoulement à froid et placez les tubes d’échantillon sur de la glace.

Pour créer une suspension unicellulaire, filtrez la réaction de digestion oculaire arrêtée à travers un filtre de 40 micromètres placé sur le dessus d’un tube de centrifugation conique de 50 millilitres. Utilisez le piston d’une seringue de 2,5 millilitres pour pousser les morceaux restants de tissu oculaire non digéré à travers le filtre. Lavez le tube de dissociation avec 10 millilitres de tampon d’écoulement et rincez le filtre.

Ensuite, utilisez le même piston pour faire passer à nouveau les morceaux de tissu oculaire non digérés à travers le filtre. Répétez ce processus avec cinq millilitres de tampon d’écoulement. Ensuite, lavez le tube de dissociation et filtrez avec un dernier tampon d’écoulement de 10 millilitres.

Centrifugez le tube conique à 400 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et décantez le surnageant sans perturber la pastille cellulaire. Brisez la pastille en projetant le tube contre un autre tube. Ajoutez ensuite un millilitre de solution de lyse et faites tourner le tube à température ambiante pendant 30 secondes pour lyser les globules rouges.

Arrêtez la réaction avec 20 millilitres de tampon d’écoulement et centrifugez le tube conique à 400 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Décantez le surnageant sans perturber la pastille cellulaire. Retournez le tube contre un autre tube.

Ajoutez ensuite cinq millilitres de HBSS froid. Répétez la centrifugation et retirez le surnageant. Ajoutez 0,5 millilitre de colorant mort vivant à chaque échantillon à l’aide d’une pipette P1000, en veillant à dissocier complètement la pastille.

Transférez les échantillons dans des tubes de microtitration de 1,2 millilitre et incubez-les pendant 15 minutes dans l’obscurité. Pendant ce temps, comptez une aliquote de 10 microlitres de l’échantillon avec du bleu de trypan et un hémocytomètre. Après l’incubation, lavez chaque échantillon en ajoutant 400 microlitres de tampon d’écoulement à froid.

Centrifugez les tubes dans un support de tubes de microtitration à 400 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et aspirez le surnageant sans perturber la pastille cellulaire. Remettez complètement les cellules en suspension dans 500 microlitres de tampon d’écoulement à froid. Répétez ensuite la centrifugation et retirez le surnageant.

Bloquez jusqu’à cinq millions de cellules vivantes dans 50 microlitres de bloc FC. Dissociez complètement la pastille cellulaire et incubez-la à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Ajoutez ensuite 50 microlitres de solution de coloration d’anticorps à chaque échantillon.

Mélangez-le complètement et incubez-le pendant encore 30 minutes à quatre degrés Celsius. Les propriétés de la zone de diffusion vers l’avant par rapport à la zone de diffusion latérale pour tous les événements analysés à partir des deux yeux d’une seule souris sont illustrées ici. Le comptage des billes a été nettoyé et confirmé en traçant l’EP sur APC-Cy7, créant ainsi un groupe serré d’événements positifs et négatifs pour l’APC-Cy7.

Ensuite, des singlets dans des cellules vivantes ont été identifiés à partir de tous les événements. Les singlets étaient positivement corrélés en termes de hauteur de diffusion vers l’avant par rapport à la zone de diffusion vers l’avant, tandis que les cellules doublet et triplet avaient une plus grande surface de diffusion vers l’avant que la hauteur de diffusion vers l’avant. Les cellules vivantes ont une zone de diffusion vers l’avant positive et une tache morte vivante négative.

La stratégie initiale de déclenchement pour la délimitation des phagocytes mononucléaires à partir de cellules singulet vivantes est présentée ici. Les singlets vivants ont été visualisés à l’aide d’un graphique CD45 par rapport à CD11b. L’absence de cellules CD45 positives dans l’OVM CD45 a confirmé la sélection de la porte.

Ensuite, les neutrophiles, les éosinophiles, les lymphocytes B, les lymphocytes K et les lymphocytes T ont été exclus en traçant les singlets vivants CD45 positifs avec porte de lignée par rapport à CD11b. Les cellules CD45-dim ont été différenciées des cellules CD45-haut. Des sous-ensembles de macrophages ont également été identifiés.

Des microglies ont été délimitées dans les cellules CD45-dim avec une faible coloration au CMC2 positif CD64. Les macrophages CMC2 négatifs ont été identifiés comme étant CD64 positifs pour le CMC2. Les macrophages CD11c négatifs et CD11c positifs se sont révélés être des CD11c négatifs CD64.

et CD64 positif CD11c positif dans les cellules MHC2 positives. Il a été constaté que le traitement au laser augmentait la quantité de macrophages CMH2 négatifs, CD11c négatifs et CD11c positifs. Le nombre de cellules dendritiques a également été régulé à la hausse par le traitement au laser, tandis que le nombre de cellules microgliales et monocytaires n’a pas été affecté.

La perfusion systémique n’a eu aucun effet sur le nombre de macrophages. Suite à cette procédure, le tri cellulaire activé par la florescence plutôt que l’analyse seule permet de caractériser l’hétérogénéité des macrophages et son impact sur la fonction via des études transcriptomiques ou protéomiques.