Un pipeline utilisant l’électroporation bilatérale in utero pour interroger les influences génétiques sur le comportement des rongeurs

L’utilisation de cette méthode peut permettre de découvrir comment certains changements d’expression génique peuvent être attribués à des pathologies associées à des maladies neurologiques. L’avantage de cette technique est qu’elle évite la nécessité de créer ou d’acheter des lignées animales génétiques, ce qui peut prendre des années à créer et à valider. Cette technique permet d’étudier les gènes impliqués dans les troubles neurologiques.

Déterminer comment des gènes spécifiques contribuent à la pathologie est une étape importante dans le développement de nouvelles thérapies. L’avantage de ce protocole est d’apprendre à manipuler les embryons afin que l’expérimentateur accomplisse l’étape de transfert de gènes sans diminuer les taux de survie. La démonstration visuelle de cette méthode est importante car les embryons sont très fragiles, il est donc utile d’observer comment un expérimentateur expérimenté les manipule pendant la procédure.

Apportez les mères enceintes dans la zone chirurgicale au moins 30 minutes avant la chirurgie. Stérilisez l’ensemble du site chirurgical à l’aide de lingettes germicides stérilisées, puis de 70 % d’éthanol. Stérilisez ensuite les outils de l’autoclave dans un stérilisateur à billes de verre.

Transférez le PBS stérile dans des tubes coniques de 50 millilitres et placez les tubes dans un bain-marie chauffé à 38 à 40 degrés Celsius. Vérifiez la température de la solution saline stérile à l’aide d’un thermomètre. Allumez la pompe de circulation du chauffage de l’eau de manière à ce qu’elle soit chauffée à 37 degrés Celsius.

Allumez ensuite l’injecteur de pression et l’électroporateur et assurez-vous qu’ils fonctionnent correctement. Faites tourner brièvement la solution d’ADN plasma sur une centrifugeuse de table et placez-la sur de la glace. Tirez les pipettes en verre sur un extracteur de pipette de sorte que la pointe de la pipette en verre tirée ait un diamètre d’environ 50 micromètres.

Remplissez ensuite la pipette avec 20 à 40 microlitres de solution d’ADN. Installez tous les articles nécessaires à la chirurgie, y compris la lotion dépilatoire, l’iode, l’éthanol à 70 %, les cotons-tiges, les gouttes ophtalmiques, les sutures et la gaze. Préparez une feuille de chirurgie et remplissez les informations nécessaires.

Pesez la souris avant l’opération et notez le poids. Après avoir anesthésié la souris, administrez des analgésiques préopératoires et retirez la fourrure de l’abdomen à l’aide d’une crème dépilatoire ou d’un rasoir. Stérilisez l’abdomen en l’écouvillonnant trois fois avec de la povidone iodée et de l’éthanol à 70 %.

Créez un champ stérile autour de l’abdomen avec de la gaze stérile et des drapés. Faites une incision médiane dans la peau abdominale tout en soulevant la peau avec des pinces pour éviter de couper le muscle. Ensuite, soulevez le muscle et coupez-le en prenant soin d’éviter de couper les organes vitaux.

Retirez délicatement les cornes utérines du barrage à l’aide d’une pince annelée et placez-les doucement sur le champ stérile en vous assurant qu’elles sont soutenues par un rembourrage et qu’elles ne s’éloignent pas trop du barrage. Gardez la corne utérine humidifiée tout au long du reste de la chirurgie avec le PBS stérile préchauffé. Positionnez un embryon avec une pince ou des doigts, puis insérez soigneusement la pipette en verre tiré dans la verticale latérale et injectez deux à trois microlitres dans chaque ventricule en insérant la pipette dans l’un puis dans l’autre ventricule.

Le ventricule a été ciblé avec succès si une forme de croissant est présente après l’injection. Pour transfecter des cellules bilatéralement dans le cortex frontal, placez les deux électrodes négatives sur les côtés de la tête de l’embryon juste latéralement et légèrement caudale par rapport aux ventricules latéraux et placez l’électrode positive entre les yeux juste devant le museau en développement. Assurez-vous que l’embryon est généreusement humidifié et appliquez quatre impulsions carrées.

Injectez et électroporatez tous les embryons, en allant un par un de sorte que chaque embryon soit électroporé immédiatement après l’injection de la solution d’ADN. Une fois que tous les embryons ont été électroporés, réinsérez soigneusement les cornes utérines dans la cavité abdominale. Enduisez la cavité abdominale de PBS stérile pour faciliter la mise en place de la corne utérine.

Remplissez la cavité abdominale avec du PBS stérile afin qu’il ne reste aucune poche d’air une fois la suture terminée. Suturez le muscle avec des sutures résorbables et la peau avec des sutures non résorbables en soie. Laissez le barrage se rétablir complètement dans une chambre chauffée pendant au moins une heure.

Vérifiez régulièrement les barrages dans les prochaines 48 heures. Au fur et à mesure que le barrage se remet de l’anesthésie et reprend conscience, il commence à bouger et à fouetter. Cette méthode a été utilisée pour transfecter environ 5 000 neurones pyramidaux de couche 2/3 avec le plasmide pCAG-GFP.

La plupart de ces cellules étaient localisées dans les régions corticales frontales. Un exemple représentatif montre la distribution caudale rostrale des neurones transfectés chez une souris témoin adulte, confirmant la capacité des EIU bilatéraux à cibler et à marquer génétiquement de grandes populations de neurones pyramidaux dans le cortex frontal. La première partie de la tâche d’interaction maternelle teste la capacité des souris témoins transfectées P18 à trouver la litière du nid.

Les souris témoins ont passé plus de temps à explorer la litière de leur nid qu’à explorer la litière fraîche, ce qui suggère qu’elles ont des capacités sensori-motrices intactes et un comportement exploratoire. La deuxième partie de la tâche tire parti de la tendance des souris à être motivées à interagir avec leur mère. Dans cette tâche, les chiots passaient la plupart de leur temps près de leur mère tout en passant beaucoup moins de temps à explorer la tasse vide ou la litière du nid.

Les souris témoins adultes ont passé environ 35 % de leur temps à explorer un nouvel objet. Lorsqu’on leur présentait un roman et un objet familier, les souris adultes passaient plus de temps à explorer le nouvel objet. Dans la tâche de sociabilité, des souris adultes témoins ont passé autant de temps à explorer une nouvelle souris et une tasse vide.

Ce comportement a été automatiquement suivi avec le logiciel DeepLabCut en étiquetant divers points sur une souris, notamment les membres, le centroïde, la tête et les oreilles. Le logiciel a également été utilisé pour déterminer quand les souris se relevaient en examinant la longueur du corps de la souris, car cette distance devient plus courte lorsque la souris se cabre. À la suite de cette procédure, de nombreuses questions moléculaires cellulaires peuvent être résolues en examinant le tissu et en dosant différentes mesures telles que la densité de la colonne vertébrale ou les niveaux d’expression de diverses protéines.