Ouverture de la barrière hémato-encéphalique induite par ultrasons focalisés pour cibler les structures cérébrales et évaluer la neuromodulation chimiogénétique

Ce protocole décrit les étapes nécessaires à l’administration du gène par l’ouverture de la barrière hémato-encéphalique (BHE) par ultrasons focalisés, l’évaluation de l’expression génique résultante et la mesure de l’activité de neuromodulation des récepteurs chimiogénétiques par des tests histologiques.

Notre protocole permet un ciblage de précision submillimétrique des ultrasons focalisés chez la souris. Il nous permet de cibler les ultrasons à l’aide de pièces imprimées en 3D peu coûteuses sans avoir besoin d’utiliser une intervention chirurgicale ou un équipement à ultrasons compatible avec l’IRM. L’ouverture de la barrière hémato-encéphalique par ultrasons focalisés peut être assez délicate au début.

Il est essentiel que le transducteur soit correctement couplé à l’animal à l’aide de gel dégazé ou d’eau et que les microbulles ne s’effondrent pas lors de l’injection. Richard Li, un étudiant diplômé de Caltech, fera la démonstration de la procédure. Après avoir confirmé une absence de réponse au réflexe de pédale chez une souris anesthésiée, utilisez 10 unités par millilitre de solution saline héparinée pour laver un cathéter propre de calibre 25 à 35 et utilisez un tampon à l’éthanol pour désinfecter la queue de l’animal.

Insérez le cathéter dans une veine latérale de la queue et utilisez de la colle à tissu pour fixer le cathéter en place. Si l’aiguille a été placée correctement, un reflux de sang sera observé dans le cathéter. Lorsque la colle a séché, retirez les poils de la tête de l’animal avec de la crème épilatoire et placez la souris dans un chariot IRM imprimé en 3D, en montant les dents de devant sur une barre de morsure avec la tête à l’intérieur d’un cône nasal.

Fixez les barres émoussées au crâne avec une pression sécuritaire et observez la respiration pendant 30 secondes pour confirmer que l’animal respire librement à un rythme d’une respiration par seconde. Connectez le guide de ciblage aux barres d’oreille et vérifiez à nouveau la respiration. Placez le chariot d’IRM dans un support d’IRM et placez le support à l’intérieur de l’alésage d’un aimant.

Ensuite, acquérez une séquence IRM pour localiser la souris dans le scanner, en utilisant la séquence de prise de vue rapide en contre-plongée 3D pour imager l’ensemble du cerveau. Pour effectuer un ciblage guidé par IRM, placez le chariot dans un instrument stéréotaxique et utilisez un bloc métallique avec du ruban adhésif double face pour fixer le bloc en place contre deux poteaux de support de l’instrument stéréotaxique. Transférez les images IRM sur un ordinateur avec un logiciel de guidage par ultrasons focalisés en cours d’exécution et ouvrez les images.

Lorsque toutes les images ont été chargées, cliquez avec le bouton droit de la souris et cliquez sur Reformater pour reformater l’image sur trois axes. Cliquez avec le bouton droit de la souris pour localiser la sonde dans le guide de ciblage circulaire. Dans la vue sagittale, ajustez la position verticale de la sonde virtuelle pour tenir compte de l’épaisseur du bain-marie et du boîtier de la sonde.

Indiquez les zones à cibler dans le planificateur de trajectoire et notez les coordonnées dans un tableur. Composez la profondeur de ciblage souhaitée et notez les coordonnées comme indiqué précédemment. Cliquez ensuite sur envoyer la trajectoire et exécuter pour cibler chacun des points.

Pour corréler les coordonnées d’une IRM avec le cadre stéréotaxique, placez la sonde montée sur mesure sur un guide de ciblage et déplacez-la jusqu’à ce que chacun des trois boulons de visée puisse passer à travers le support de la sonde et le guide de ciblage. Vérifiez que les boulons ne sont pas sous tension ou ne s’inclinent pas et faites glisser la sonde de 10,56 millimètres vers l’avant dans la direction antéro-postérieure jusqu’à ce que la sonde soit située à l’endroit où le centre d’un guide de ciblage apparaît sur l’IRM. Déterminez ensuite la distance entre le centre de la sonde virtuelle et la région ciblée et utilisez le cadre pour déplacer la sonde vers ces coordonnées.

Pour préparer la solution d’injection, chargez 800 microlitres de solution saline et 100 microlitres d’agent de contraste IRM dans un tube de 1,5 millilitre avec mélange. Ensuite, amenez une solution de microbulles non activées à température ambiante, avant d’activer les microbulles pendant 45 secondes dans un dispositif d’activation de microbulles. Après l’activation, chargez lentement 100 microlitres de microbulles du milieu de la solution dans une seringue à tuberculine d’un millilitre équipée d’une aiguille de calibre 21, et ajoutez 80 microlitres de microbulles dans la solution d’agent de contraste.

Mélangez la solution préparée en inversant doucement le tube de 1,5 millilitre pendant 15 secondes pour éviter la flottaison. À la fin du mélange, chargez 200 microlitres de la solution de microbulles dans une seringue sans aiguille et retournez la seringue. Appuyez et rétractez le piston pour mélanger et fixez une aiguille de calibre 30 à la seringue pendant qu’elle est encore inversée.

Ensuite, poussez lentement la solution de microbulles jusqu’à ce que des gouttelettes apparaissent à l’extrémité de l’aiguille. Dès que les microbulles sont prêtes, réglez la durée de l’impulsion pour l’insonation à 10 millisecondes, avec 120 répétitions par seconde, avec 0,3 à 0,45 méga pascals de pression au niveau du crâne. Retirez le guide de ciblage et appliquez du gel à ultrasons dégazé sur la tête de la souris en prenant soin d’éviter les bulles.

Abaissez le transducteur jusqu’à ce qu’il soit placé directement sur la partie plate du support de barre d’oreille et composez les coordonnées dans les instruments stéréotaxiques. Diluez le virus adéno-associé d’intérêt à une concentration de 0,5 à 2 fois 10 à 10 par gramme de concentration de poids corporel, et chargez les particules virales dans une seringue d’un millilitre munie d’une aiguille de calibre 30. Injectez la solution dans le cathéter veineux de la queue et injectez 80 microlitres de la solution de microbulles dans la souris.

Pour évaluer l’ouverture de la barrière hémato-encéphalique par IRM, enregistrez une séquence de prise de vue rapide en contre-plongée comme illustré. Pour la stimulation DREADD, dissolvez le N-oxyde de clozapine dans une solution saline stérile à une concentration d’un milligramme par millilitre et injectez-le par voie intrapéritonéale. 15 à 45 minutes après l’accouchement, commencez à enregistrer l’activité comportementale de l’animal.

Pour l’analyse de l’activation neuronale, utilisez le tissu cérébral. En suivant le protocole tel qu’il a été démontré, une augmentation du signal T1 peut être obtenue dans la région de l’hippocampe et dans d’autres parties du cerveau. Comme observé, l’immunocoloration contre mCherry conduit à une détection plus fiable de l’expression de DREADD Dans cette procédure, n’oubliez pas de manipuler les micro-bulles avec douceur et de vous assurer que l’animal est stable pendant l’imagerie IRM et l’insonation.