Caractérisation des cellules immunitaires et des médiateurs pro-inflammatoires en milieu pulmonaire

Ce protocole peut être utilisé pour étudier les altérations de l’environnement pulmonaire à la suite d’un AVC ischémique. Cette méthode permet d’identifier 13 types de cellules immunitaires pulmonaires et 13 cytokines et chimiokines différentes chez la même souris par analyse cytométrique en flux. Cette méthode a été utilisée pour évaluer les altérations de l’environnement pulmonaire après un AVC ischémique.

Cependant, il peut également servir à étudier les changements lors d’une réponse allergique ou d’une infection. Pour effectuer une perfusion transcardique du corps entier, confirmez une absence de réponse à la réflexion de la pédale chez une souris anesthésiée et fixez la souris à une plate-forme chirurgicale. Mouillez la fourrure avec de l’éthanol à 70 % pour réduire la distribution de la fourrure dans la cavité corporelle et faites une incision cutanée verticale médiane pour exposer le péritoine intact, en arrêtant l’incision dès que la cavité thoracique a été atteinte.

Utilisez des ciseaux de dissection fins pour faire une incision médiane du péritoine en s’arrêtant au niveau de la cavité thoracique avant et utilisez des pinces pour saisir l’extrémité distale du sternum. Utilisez les ciseaux pour couper le diaphragme sans endommager le cœur, les poumons ou le système vasculaire. Lorsque les tissus sous-jacents sont visibles, faites une incision à travers la cage thoracique et fixez les côtés des côtes de manière à ce que le cœur et les poumons soient complètement exposés.

Faites soigneusement une petite incision dans l’oreillette droite près de l’arc aortique pour servir d’écoulement pour la perfusion et insérez rapidement mais doucement une aiguille de calibre 25 dans la surface supérieure distale du ventricule gauche. Une fois l’aiguille en place, rincez doucement 10 millilitres de PBS froid dans le cœur. Le tissu devrait commencer à se débarrasser du sang.

Lorsque tout le volume a été distribué, perfuser une deuxième aliquote de 10 millilitres de PBS froid jusqu’à ce que le foie présente une apparence brun clair et que les poumons soient passés d’un rose rougeâtre à une couleur principalement blanche. À l’aide d’une pince et de ciseaux de dissection fine, retirez soigneusement tous les tissus environnants avant de séparer les lobes pulmonaires et de les placer dans une boîte de Pétri contenant un à deux millilitres de cellules pulmonaires froides, milieu sur glace. Pour préparer le tissu pulmonaire aux réseaux de billes multiplexes, ajoutez 200 microlitres de tampon d’homogénéisation à froid à un tube de deux millilitres contenant trois billes stériles de zircone/silice de 2,3 millilitres, et pesez le lobe pulmonaire d’intérêt.

Transférez 50 à 100 milligrammes de tissu pulmonaire dans le tube de billes pré-refroidi et le tampon d’homogénéisation et homogénéisez le lobe à l’aide d’un homogénéisateur à base de billes à 4 000 rotations par minute pendant au moins deux minutes. Lorsque le tissu a été complètement homogénéisé, centrifugez le tube pour sédimenter le tissu et transférez le super natant dans un microtube pré-refroidi de 1,5 millilitre sur de la glace. Pour la dissociation du tissu pulmonaire, décantez soigneusement le milieu cellulaire pulmonaire du lobe pulmonaire restant et insérez une aiguille de calibre 25 dans le tissu.

Injectez 200 à 250 volumes de tampon de dissociation dans chaque lobe pulmonaire pour gonfler les poumons jusqu’à ce que chacun des lobes ait été injecté deux à trois fois. Après une incubation de deux minutes à température ambiante, utilisez des ciseaux de dissection fine pour hacher les poumons en petits morceaux et transférez la solution tissulaire dans un tube chronique de 15 millilitres. Ajoutez six millilitres de tampon de dissociation supplémentaire à l’échantillon et agitez vigoureusement pendant une minute.

Ensuite, incubez les morceaux de tissu pendant 45 minutes à 37 degrés Celsius, en tourbillonnant toutes les sept à huit minutes. À la fin de l’incubation, agitez vigoureusement l’échantillon pendant une minute et passez-le dans une passoire cellulaire de 100 microns pour éliminer tout tissu conjonctif et interstitiel indésirable résiduel. Prélever le tissu par centrifugation et le remettre en suspension dans la pastille avec cinq millilitres de milieu pulmonaire froid.

Centrifugez à nouveau l’échantillon et remettez la pastille en suspension dans un millilitre de milieu pulmonaire froid avec un léger vortex. Ensuite, filtrez les cellules à travers une passoire de 100 microns avant de compter. Pour évaluer les populations de cellules immunitaires dans le tissu pulmonaire isolé, ensemencez une à deux fois 10 à la sixième cellules de puissance de l’anticorps dans le nombre approprié de puits avec une plaque inférieure ronde de 96 puits et disposez les cellules au fond de la plaque par centrifugation.

Ajoutez 25 microlitres du cocktail d’anticorps approprié dans un tampon FACS froid dans chaque puits et mélangez en tapotant doucement la pipe. Après 20 minutes, remettez les cellules en suspension dans 100 microlitres de tampon FACS froid par puits et transférez les échantillons dans des tubes individuels à fond rond en polystyrène de cinq millilitres contenant 150 microlitres de tampon FACS supplémentaire par tube. Ensuite, analysez immédiatement les échantillons sur un cytomètre en flux selon les protocoles d’analyse standard de la cytométrie en flux.

Dans cette analyse représentative, 13 populations différentes de cellules immunitaires ont été identifiées dans les poumons à l’aide de trois séries de cinq à sept combinaisons d’anticorps. Les cellules mortes ont été exclues à l’aide d’une coloration morte vivante et les différents types de cellules immunitaires ont été distingués à l’aide des anticorps et des marqueurs énumérés dans le tableau. Des macrophages alvéolaires et interstitiels, des cellules dendritiques CD103 positives et CD11B positives et des éosinophiles ont été identifiés dans la première série.

Des monocytes et des neutrophiles pro-inflammatoires ont été identifiés dans la deuxième série et des lymphocytes T CD4 positifs et CD8 positifs, des cellules B, des cellules dendritiques plasmacytoïdes, des cellules NK et des cellules NKT ont été identifiés dans la troisième série. Le nombre total de cellules viables, le pourcentage de cellules CD45 positives et le nombre total de cellules CD45 positives obtenues étaient similaires entre les populations cellulaires isolées, comme cela a été démontré, et les populations cellulaires isolées à l’aide d’un dissociateur tissulaire disponible dans le commerce. De plus, le pourcentage de mort cellulaire parmi les cellules CD45 positives était inférieur à 10 % pour les deux protocoles, ce qui suggère que le protocole démontré facilite une récupération cellulaire à haut rendement et de haute qualité sans l’aide d’un dissociateur tissulaire automatisé.

De plus, l’utilisation d’un test multiplex disponible dans le commerce couplé à une analyse cytométrique en flux permet de déterminer la concentration de chimiokine dans chaque échantillon par milligramme de tissu. La concentration de collagénase D, le temps d’incubation et la température utilisés lors de l’isolement de la cellule unique ont un impact critique sur la récupération des cellules immunitaires.