Biofonctionnalisation des nanomatériaux magnétiques
16 juillet 2020
Dans ce travail, nous proposons un protocole permettant de biofonctionnaliser des nanomatériaux magnétiques avec des anticorps pour un ciblage cellulaire spécifique. À titre d’exemple, nous utilisons des nanofils de fer pour cibler les cellules cancéreuses.
La principale caractéristique de ce protocole est qu’il peut être appliqué sur une large gamme de nanomatériaux d’oxyde de fer et de fer. En outre, il peut être appliqué sur des nanomatériaux multi-segmentés, tels que des nanofils de fer-or. Ce protocole peut être exécuté en toute sécurité dans n’importe quel laboratoire biologique standard.
Les principaux avantages de cette technique de biofonctionnalisation sont la capacité de produire un nanomatériau spécifiquement ciblé basé sur une forte liaison covalente entre le nanofil et les anticorps. Commencez par couper les disques d’aluminium en petits morceaux à l’aide d’une lame à un seul tranchant et d’un petit marteau. Placez les morceaux coupés dans un tube de deux millilitres et remplissez-le d’un millilitre d’hydroxyde de sodium d’une molaire, en vous assurant que tous les morceaux d’aluminium sont couverts.
Laissez le tube à température ambiante dans une hotte chimique pendant 30 minutes. Après l’incubation, retirez les morceaux d’aluminium à l’aide d’une pince à épiler et conservez les nanofils libérés dans de l’hydroxyde de sodium pendant 30 minutes supplémentaires. Placez le tube dans une grille sèche magnétique, attendez deux minutes et remplacez la solution par de l’hydroxyde de sodium frais.
Sonicez le tube de deux millilitres avec les nanofils pendant 30 secondes et laissez-le pendant une heure à l’intérieur d’une hotte chimique. Répétez cette étape au moins quatre fois. Lorsque vous avez terminé, placez le tube de deux millilitres dans le support magnétique, jetez l’hydroxyde de sodium et remplacez-le par un millilitre d’éthanol absolu.
Soniquez les nanofils pendant 30 secondes, placez le tube dans le support magnétique et remplacez l’éthanol. Répétez le lavage à l’éthanol au moins quatre fois. Après avoir lavé les nanofils, transférez-les dans un tube en verre de cinq millilitres à l’aide d’une pipette d’un millilitre.
Ajoutez 100 microlitres d’APTES à la solution de nanofils et faites tourbillonner le tube de verre pendant 20 secondes. Placez le tube dans un bain à ultrasons et sonicez-le pendant une heure. Ensuite, sortez le tube du bain et ajoutez 400 microlitres d’eau déminéralisée et 20 microlitres d’hydroxyde de sodium à une molaire.
Répétez la sonication d’une heure. Après avoir sorti le tube de verre du bain à ultrasons, placez-le à côté d’un aimant pour recueillir les nanofils. Remplacez le surnageant par un millilitre d’éthanol absolu frais et sonicez le tube pendant 10 secondes.
Répétez deux fois le lavage à l’éthanol et la sonication. Dissoudre 0,4 milligramme d’EDC et 1,1 milligramme de Sulfo-NHS et un millilitre de MES dans un tube de deux millilitres. Dans un autre tube de deux millilitres, ajoutez 960 microlitres de PBS 0,1 molaire et ajoutez-y 30 microlitres d’anticorps anti-CD44.
Ensuite, ajoutez 10 microlitres du mélange EDC/Sulfo-NHS préalablement préparé dans ce tube. Placez le tube d’anticorps dans un shaker et agitez-le à 10 fois G pendant 15 minutes à température ambiante. Pendant ce temps, placez un aimant à côté du tube avec les nanofils recouverts d’APTES pendant deux minutes, jetez l’éthanol et remplacez-le par du PBS.
Sonicez les nanofils pendant 10 secondes. Après le dernier lavage avec du PBS, récupérez les nanofils et transférez la solution d’anticorps activés dans le tube des nanofils. Ensuite, sonicez-le pendant 10 secondes.
Replacez le tube dans le rotateur pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, récupérez les nanofils avec l’aimant et jetez le surnageant. Ajoutez un millilitre de BSA à 2 % et incubez le tube pendant une heure à quatre degrés Celsius pour bloquer la réaction.
La spectroscopie de perte d’énergie électronique ou les cartes EELS peuvent être utilisées pour visualiser les atomes de silicium à la surface du nanofil et confirmer la présence du revêtement APTES. Sur les nanofils non revêtus, les atomes de fer apparaissent en bleu foncé et les atomes mélangés de fer et d’oxygène sont bleu clair. La cartographie EELS correspondante des nanofils non revêtus montre une intensité plus élevée de fer par rapport à l’oxygène au centre qu’à la surface, indiquant une structure d’oxyde de fer-fer.
La cartographie a démontré que la couche d’oxyde de fer est constituée de plus d’oxyde de fer(II, III) que d’oxyde de fer(III). L’antigénicité des anticorps fixés a été confirmée à l’aide des tests d’immunoprécipitation et de transfert Western. Le test BCA a été utilisé pour quantifier le nombre d’anticorps sur les nanofils.
La mesure du potentiel zêta a été utilisée pour élucider la fonctionnalisation de surface. Le groupe amine terminal sur APTES a réduit la charge négative par rapport aux nanofils non enrobés. La fonctionnalisation des anticorps a encore réduit la charge.
Le ciblage cellulaire spécifique des nanofils fonctionnalisés par l’anticorps a été confirmé à l’aide de la microscopie confocale. Les figures A et B représentent les images de microscopie à fond clair des échantillons C et D respectivement. La couleur rouge correspond à la représentation de la membrane cellulaire, le bleu représente le noyau et les amas verts représentent la présence de nanofils CD44 attachés et ciblés.
De plus, le test de viabilité cellulaire a été utilisé pour vérifier que les nanofils non enrobés, enrobés d’APTES et enrobés d’anticorps étaient biocompatibles. Dans le revêtement du procédé APTES, il est très important d’ajouter de l’eau déminéralisée avant la solution d’hydroxyde de sodium pour améliorer la liaison entre la molécule APTES et les nanofils. De plus, pendant le processus de biofonctionnalisation, il est nécessaire de laver le nanofil avec un tampon PBS à plusieurs reprises pour améliorer la liaison covalente entre l’anticorps et les nanofils.
Aperçu
Cette étude présente un protocole de biofonctionnalisation de nanomatériaux magnétiques à l'aide d'anticorps afin d'obtenir un ciblage cellulaire spécifique, en utilisant particulièrement des nanofils de fer pour cibler les cellules cancéreuses.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Nanotechnologie
- Biomatériaux
- Biologie cellulaire
Contexte
- Les nanomatériaux magnétiques présentent des applications potentielles dans la délivrance ciblée de médicaments.
- La biofonctionnalisation améliore la spécificité des nanomatériaux vis-à-vis de types cellulaires particuliers.
- Les nanofils de fer peuvent être modifiés pour améliorer leurs capacités de ciblage.
- Comprendre l'interaction entre les nanomatériaux et les systèmes biologiques est essentiel à leur utilisation.
Objectif de l'étude
- Développer un protocole fiable pour la biofonctionnalisation de nanofils de fer.
- Démontrer l'efficacité des nanofils fonctionnalisés par des anticorps pour cibler les cellules cancéreuses.
- Évaluer la biocompatibilité des nanofils modifiés.
Méthodes utilisées
- Préparation de nanofils de fer par des procédés chimiques.
- Revêtement des nanofils avec de l'APTES pour faciliter l'attachement des anticorps.
- Utilisation de l'EDC/Sulfo-NHS pour activer les anticorps.
- Caractérisation des nanofils par spectroscopie de perte d'énergie des électrons et mesures de potentiel zêta.
Résultats principaux
- Le protocole a permis de produire avec succès des nanofils de fer fonctionnalisés par des anticorps.
- La microscopie confocale a confirmé le ciblage spécifique des cellules cancéreuses par les nanofils modifiés.
- Les essais de biocompatibilité ont indiqué que les nanofils étaient sûrs pour des applications cellulaires.
- La fonctionnalisation de surface a été validée au moyen de diverses techniques de caractérisation.
Conclusions
- Cette technique de biofonctionnalisation permet la délivrance ciblée d'agents thérapeutiques.
- Le protocole peut être adapté à divers types de nanomatériaux.
- Des applications futures pourraient inclure des thérapies anticancéreuses ciblées utilisant ces nanofils.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Ce protocole permet la production de nanomatériaux magnétiques spécifiquement ciblés grâce à l'attachement covalent d'anticorps, soutenant ainsi le développement de thérapeutiques et de diagnostics de précision. En améliorant la spécificité du ciblage et en permettant un contrôle magnétique à distance, cette méthode contribue à la réduction des risques mécanistiques dans les programmes d'oncologie précliniques. L'approche renforce la fiabilité prédictive des interventions basées sur des nanomatériaux en validant à la fois l'efficacité du ciblage et la biocompatibilité.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques grâce au ciblage spécifique de marqueurs de surface cellulaire, comme la surexpression de CD44 dans les cellules cancéreuses.
- Valeur opérationnelle : Contribue à la détection biologique des risques en confirmant l'antigénicité des anticorps fixés par immunoprécipitation et immunobuvardage (western blot).
- Valeur prédictive : Facilite le tri du portefeuille en démontrant un ciblage spécifique et une biocompatibilité dans des modèles cellulaires pertinents.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Produit des systèmes biologiques validés prêts pour des procédés en aval, avec une fonctionnalisation de surface confirmée par spectroscopie de perte d'énergie des électrons (EELS) et des mesures de potentiel zêta.
- Valeur opérationnelle : Permet la standardisation et la reproductibilité des tests grâce à des étapes de liaison covalente contrôlée et de blocage utilisant l'albumine de sérum bovin (BSA).
- Valeur en termes de montée en échelle : Permet la réutilisation de la plateforme sur des nanomatériaux à base de fer-oxyde de fer et sur des nanostructures segmentées, notamment des nanofils fer-or.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur translationnelle : Démontre une continuité allant de la découverte à la validation préclinique par le suivi en microscopie confocale et les tests de viabilité cellulaire.
- Progression ajustée au risque : Guide les décisions de poursuite ou d'abandon en vérifiant la biocompatibilité des nanomatériaux non revêtus, revêtus d'APTES et revêtus d'anticorps.
- Réduction du risque mécanistique : Diminue l'ambiguïté concernant les mécanismes de ciblage en associant l'attachement d'anticorps à une liaison cellulaire spécifique observée en imagerie.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation de cible à l'identification de composés d'intérêt, permettant une évaluation fiable des composés grâce à des nanomatériaux quantifiables et sensibles aux champs magnétiques.
- Biologie de la découverte : Facilite la validation d'hypothèses et l'élucidation des voies en permettant une livraison spécifique aux cellules cancéreuses positives pour CD44.
- Screening : Assure la disponibilité des tests et fournit des résultats quantitatifs grâce aux variations du potentiel zêta et à la modification de surface confirmée par spectroscopie de perte d'énergie des électrons (EELS).
- Analytique : Fournit des mesures quantifiables telles que la quantité d'anticorps par dosage BCA et l'absorption cellulaire par microscopie confocale.
- Recherche translationnelle : S'inscrit dans une continuité préclinique grâce à la biocompatibilité démontrée et au ciblage spécifique dans des modèles cellulaires.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une capacité réutilisable pour générer des nanomatériaux ciblés dans divers projets et formats de nanomatériaux.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive, validation des cibles, réduction de l'ambiguïté mécanistique dans les interactions entre les nanomatériaux et les cellules.
- Valeur opérationnelle : Normalisation, reproductibilité et évolutivité de la biofonctionnalisation dans différents environnements de laboratoire.
- Valeur stratégique : Meilleures décisions de poursuite ou d'abandon, efficacité du capital et réduction des risques biologiques en phase avancée du développement de nanotherapies.
- Impact sur le portefeuille : Priorisation et décisions d'avancement ajustées au risque, fondées sur des profils de ciblage et de sécurité validés.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la manipulation des nanomatériaux, la conjugaison d'anticorps et les techniques de caractérisation de surface.
- Dépend de l'accès à des bains ultrasoniques, des supports magnétiques et des instruments pour l'analyse par spectroscopie de perte d'énergie des électrons (EELS), le potentiel zêta et le western blot.
- Implique une standardisation interéquipes des protocoles de lavage, de blocage et d'incubation afin d'assurer une cohérence entre les lots.
- Suppose des adaptations lors de l'application de la méthode à différentes formes, compositions ou chimies de surface des nanomatériaux.
- Comprend des limites pratiques, telles que la nécessité d'une séquence rigoureuse des réactifs (par exemple, eau déionisée avant l'hydroxyde de sodium) pour améliorer la liaison de l'APTES.
