Name: Visualisation de la dégénérescence synaptique chez les adultes Drosophila en association avec la neurodégénérescence (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-13T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Découvrez une technique de dissection du muscle dorsal longitudinal chez Drosophila melanogaster pour évaluer l'intégrité des jonctions neuromusculaires. Cette méthode permet d'étudier la dégénérescence synaptique dans les maladies neurodégénératives.

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Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health (R01 NS10727) à D.T.B.

1. Génération de mouches transgéniques
<ol><li>Pour générer des mouches transgéniques pour cette expérience, collectez OK371-Gal425 mouches femelles vierges et mâles de UAS-TDP-43M337V 26 (Figure 1A) en anesthésiant les mouches avec du CO2 sur un tampon à trier.</li>
	<li>Trier les mouches anesthésiées dans des flacons avec des supports standard Drosophila pour la croix. Placer les flacons étiquetés à 25 °C pour que la prochaine génération émerge. REMARQUE : Dégagez les adultes des flacons avant l’émergence de la progéniture pour assurer le génotype approprié.</li>
	<li>Une fois que la progéniture émerge, recueillir les mouches transgéniques dans les flacons et trier par sexe pour commencer à vieillir pour des conditions expérimentales.</li>
	<li>Une fois que les mouches sont recueillies, transférer les mouches à la nourriture fraîche tous les 2 jours jusqu’à ce que les mouches sont 21 jours.</li>
</ol>2. Préparation de dissection
<ol><li>Pour se préparer aux dissections, obtenir la solution saline tamponnée de phosphate à température ambiante (1x PBS), un plat de dissection de 10 cm recouvert d’un élastomère en silicone, ciseaux de dissection de bord droit, un ensemble de forceps émoussés de dissection, une pipette et des pointes de pipette de P200, des tubes de microcentrifuge de 2.0 mL, des ciseaux de bureau standard, 70% d’éthanol, une boîte de Petri de 6 cm, et 32% de formaldéhyde dilué à 4% avec 1x PBS.</li>
	<li>Étiqueter les tubes pour chaque génotype ou condition et ajouter 900 μL de 1x PBS (température ambiante) et 150 μL de formaldéhyde de 32 % à chaque tube. Portez des gants et des lunettes de sécurité lors de la préparation du fixatif de 4 %.</li>
	<li>Anesthétiser 6\u201210 vole par groupe directement à partir du flacon avec du CO2 et submerger les mouches dans une boîte de Pétri de 6 cm avec 70% d’éthanol. Appuyez sur les mouches dans l’éthanol à l’aide d’un pinceau pour s’assurer que les spécimens sont complètement submergés. Cela permettra d’enlever la couche d’huile sur la cuticule externe.</li>
</ol>3. Isolation et fixation du thorax
<ol><li>Avant de disséquer chaque spécimen, ajouter environ 7\u201210 mL de 1x PBS au plat de dissection recouvert d’élastomère en silicone. Ce volume doit s’assurer que les échantillons de tissus sont complètement submergés.</li>
	<li>Transférer une mouche vers le plat de dissection à partir de l’éthanol à 70 % à l’aide de forceps émoussés et en saisissant les ailes ou les jambes.</li>
	<li>Concentrez l’échantillon dans le plat de dissection sous un microscope de dissection. Ensuite, submergez l’échantillon dans 1x PBS, et retirez soigneusement les ailes à l’aide de Dumont émoussé #5 forceps fins.</li>
	<li>À l’aide de ciseaux de dissection à bord droit Vannas, retirez les jambes en créant une petite incision dans le côté ventral de la cuticule. À l’étape 3.8, cette incision permettra au formaldéhyde de pénétrer dans le tissu.</li>
	<li>Prenez les ciseaux dans une main et maintenez les forceps dans l’autre pour positionner le côté ventral de mouche vers le haut. Tout en maintenant le spécimen en place avec les forceps émoussés, retirez la tête et l’abdomen avec les ciseaux de dissection.</li>
	<li>Transférer le thorax isolé à l’aide de la pointe de pipette modifiée dans le tube étiqueté, à partir de l’étape 3.2. REMARQUE : Réglez la pipette à 40 μL pour éviter d’ajouter 1 x PBS supplémentaire au fixatif.</li>
	<li>Répétez les étapes 3.2\u20123.6 ci-dessus pour chaque spécimen.</li>
	<li>Fixer les échantillons pendant 30 min à température ambiante.</li>
	<li>Retirez le correctif à l’aide d’une pipette Pasteur et jetez-la dans le contenant de déchets approprié sous le capot de fumée. Rincer les échantillons trois fois avec 1,5 mL de 1x PBS chacun à l’aide d’une pipette Pasteur. Effectuez un quatrième rinçage en utilisant seulement 750 μL et laissez les tissus dans 1x PBS. REMARQUE : À ce stade, les échantillons de tissus peuvent rester à 4 °C jusqu’à 3 jours avant de passer aux étapes suivantes.</li>
</ol>4. Gel éclair et bisection de thorax
<ol><li>Avant de commencer les bisections, remplissez une fiole Dewar d’azote liquide portant des gants cryo-protecteurs appropriés et des lunettes de sécurité. Obtenez un disjoncteur de lames, des lames de plumes, une paire de forceps fins, de la glace, un PBS glacé et une pince cryogénique.</li>
	<li>Préparer un seau à glace pour garder 1x PBS glacé.</li>
	<li>Utilisez le disjoncteur de lame pour saisir la lame de plume à un angle, et pliez la lame afin de briser un petit morceau. Le disjoncteur de lame peut alors verrouiller la lame en position pour une utilisation comme petit scalpel. REMARQUE : Une lame doit durer pour tous les groupes. Changez si la lame se brise ou devient terne.</li>
	<li>Ajouter une pointe de pipette propre au P200 et retirer1/5 e de la pointe pour transporter les échantillons.</li>
	<li>Préparer un nouveau tube de microcentrifuge pour chaque groupe et ajouter 200 μL de 1x PBS à chaque tube. Ce deuxième tube sera utilisé pour recueillir les préparations finales DLM.</li>
	<li>Retirez tous les tubes 1x PBS à l’aide d’une pipette Pasteur.</li>
	<li>En portant un équipement de protection approprié, submergez le tube dans la fiole d’azote liquide pendant 10 s avec la pince cryogénique. REMARQUE : Les tubes doivent être fermés hermétiquement pour empêcher le tube d’exploser.</li>
	<li>Retirer le tube de l’azote liquide et ajouter environ 300 μL de 1x PBS glacés aux échantillons à l’aide d’une pipette Pasteur. Gardez les échantillons sur la glace.</li>
	<li>Ajouter le 1x PBS glacé au plat de dissection de 10 cm recouvert d’élastomère en silicone et distribuer le premier thorax avec la pipette modifiée de 200 μL.</li>
	<li>Placez le côté ventral du thorax vers le haut. Dans une main utiliser une paire terne de forceps pour positionner le thorax et dans l’autre utiliser une belle paire de forceps pour enlever une partie du ganglion thoracique pour exposer la ligne médiane du thorax.</li>
	<li>Utilisez la ligne médiane du thorax comme guide pour faire une coupe peu profonde à travers 1/3rd du thorax avec la lame.</li>
	<li>Retirer la lame du thorax et positionner le thorax à un angle de 45° avec les forceps émoussés. Réinsérer la lame et couper directement sur la ligne médiane du thorax. Cela se traduira par deux hemithoraces.</li>
	<li>Prenez un hemithorax à la fois et enlever l’excès de tissu sous la fibre musculaire DLM F (Figure 1B), la fibre la plus ventrale. Utilisez la lame pour faire soigneusement une ou deux coupures pour enlever l’excès de tissu sans endommager les DLM.</li>
	<li>Une fois isolé, transférer l’hémithorax dans le tube correct avec 1x PBS.</li>
	<li>Répétez les étapes 4.6\u20124.14 jusqu’à ce que 10 hémithores disséquées par groupe soient faites.</li>
</ol>5. Coloration structurelle
<ol><li>Après avoir coupé en deux les échantillons de thorax, placez le tissu dans le tampon de blocage (1x PBS avec 0,1% de sérum de chèvre normal, et 0,2% Triton X-100 à pH 7.4) pour perméabiliser le tissu et prévenir les taches non spécifiques. Utilisez une pipette Pasteur pour enlever l’excès de 1x PBS et ajoutez 1,5 ml de tampon de blocage à chaque tube. Bloquer les tissus pendant au moins 1 h à 4 °C.</li>
	<li>Préparer les échantillons pour la coloration structurelle à l’aide d’un anticorps fluorescent conjugué, peroxydase de raifort 488 (anti-HRP-488) à une dilution de 1:200 et Phalloidine-647 à une dilution de 1:1000 dans le tampon de blocage pour tacher les neurones moteurs et les tissus musculaires, respectivement. Faire assez de tache pour avoir 150 μL par tube. Conserver la tache à 4 °C recouverte de papier d’aluminium ou dans une boîte sombre jusqu’à ce qu’elle soit prête à être tachée.</li>
	<li>Après le blocage, retirez l’excès de tampon de blocage à l’aide d’une pipette Pasteur en verre.</li>
	<li>Avant de distribuer la tache structurelle, vortex la tache. Ajouter 150 μL de la tache à chaque tube. Placez les échantillons dans une boîte sombre sur le rotateur à température ambiante pendant 2 h.</li>
	<li>Retirez la tache et lavez les tissus quatre fois en 1,5 mL de température ambiante 1x PBS avec 0,3% Triton X-100 pendant 5 min sur le rotateur dans une boîte sombre. Les échantillons sont maintenant prêts à monter à une diapositive.</li>
</ol>6. Tissu de montage
<ol><li>Après avoir lavé des échantillons dans PBST, préparer une lame de microscope pour monter le tissu pour la coloration. Préparez des fournitures supplémentaires, y compris des bordereaux de couverture en verre, une pipette P200, des pointes de pipette de 200 μL, des ciseaux, des renforts clairs, des forceps de bord droit, des supports fluorescents anti-fade, du vernis à ongles et une boîte sombre pour couvrir les diapositives.</li>
	<li>Étiqueter la diapositive pour identifier les échantillons et nettoyer la lame avec des kimwipes pour vous assurer qu’il n’y a pas de taches.</li>
	<li>Pour s’assurer que les échantillons d’hémithorax ne sont pas endommagés par le glissement de couverture, construisez un « pont » à l’aide d’étiquettes de renfort. Prenez une étiquette de renfort, coupez-la en deux et placez chaque moitié à environ 15 mm l’une de l’autre. Cette distance doit être plus petite que la largeur du couvercle. Répétez cette étape quatre fois pour compléter un « pont » de 5 étiquettes de haut.</li>
	<li>Prenez la pipette P200 et modifiez une pointe en coupant1/5 e de la pointe pour transférer les échantillons à la glissière. Les échantillons doivent être transférés sur la glissière au centre du pont.</li>
	<li>Prenez le bord d’une lingte de laboratoire et retirez tout excès de PBST. À l’aide de forceps, disposez les DLM de telle sorte que tous les échantillons sont orientés côté muscle vers le haut et côté cuticule vers le bas.</li>
	<li>À l’aide d’une pointe standard de pipette P200, appliquez 70 μL de support de montage sur la glissière, en évitant les bulles d’air. Distribuez les supports dans un motif circulaire à l’intérieur des renforts à partir de l’extérieur dans le centre.</li>
	<li>Placez un couvercle sur les renforts.</li>
	<li>Utilisez du vernis à ongles pour enrober les bords extérieurs autour du périmètre du couvercle. Appliquer généreusement pour former un joint complet du tissu.</li>
	<li>Placez la lame sur une surface plane dans l’obscurité, permettant au moins 10 min de sécher et d’éviter le photo-blanchiment ou la perte de fluorescence. Les diapositives peuvent maintenant être utilisées pour l’imagerie immédiatement, ou autrement stockées dans un dossier de diapositive à -20 °C pour une visualisation ultérieure.</li>
</ol>7. Alternative : Coloration avec des anticorps primaires
REMARQUE : Cette section est facultative et doit être utilisée directement entre les sections 4 et 5 si vous le souhaitez.
<ol><li>Pour tacher le tissu avec des anticorps primaires, submerger le tissu dans le tampon de blocage pendant au moins 1 h.</li>
	<li>Préparer l’anticorps primaire avec une dilution appropriée dans le blocage de la mémoire tampon. Au minimum, préparer suffisamment de mélange d’anticorps pour avoir 150 μL par groupe. Notez que les échantillons sont conservés immobiles. Conserver à 4 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi.</li>
	<li>Retirez la mémoire tampon de blocage excédentaire à l’aide d’une pipette Pasteur. Vortex brièvement l’anticorps primaire et ajouter 150 μL de mélange d’anticorps à chaque groupe et placer les échantillons à 4 °C pendant la nuit.</li>
	<li>Le lendemain, retirer l’anticorps primaire et laver les tissus 4 fois avec pbst pendant 5 min chacun sur un rotateur.</li>
	<li>Préparer la tache secondaire dans la mémoire tampon de blocage. Ajouter la tache secondaire à l’échantillon, puis la garder à température ambiante pendant 2 h dans une boîte sombre sur le rotateur. REMARQUE : La coloration secondaire peut également inclure HRP et phalloïdine.</li>
	<li>Après l’incubation de 2 h, enlever le tissu secondaire de lavage de tache 4 fois pendant 5 min avec PBST et procéder au montage.</li>
</ol>

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<li>Marrus, S. B., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+localization+of+glutamate+receptors+opposite+sites+of+high+presynaptic+release%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Preferential localization of glutamate receptors opposite sites of high presynaptic release.</a> Current Biology. 14, 924-931 (2004).</li>
<li>Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+recordings+from+the+giant+fiber+pathway+of+D.+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological recordings from the giant fiber pathway of D. melanogaster.</a> Journal of Visualized Experiments. , e2412(2011).</li>
<li>Maccioni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+phytotherapic+extracts+rescue+anomalous+locomotion+and+electrophysiological+responses+of+TDP-43+Drosophila+melanogaster+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Standardized phytotherapic extracts rescue anomalous locomotion and electrophysiological responses of TDP-43 Drosophila melanogaster model of ALS.</a> Scientific Reports. 8, 16002(2018).</li>
<li>Siddiqi, O., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurophysiological+defects+in+temperature-sensitive+paralytic+mutants+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Neurophysiological defects in temperature-sensitive paralytic mutants of Drosophila melanogaster.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73, 3253-3257 (1976).</li>
<li>Wang, Z. H., Clark, C., Geisbrecht, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+clueless+is+involved+in+Parkin-dependent+mitophagy+by+promoting+VCP-mediated+Marf+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Drosophila clueless is involved in Parkin-dependent mitophagy by promoting VCP-mediated Marf degradation.</a> Human Molecular Genetics. 25, 1946-1964 (2016).</li>
<li>O'Sullivan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+Wing+Motor+Control+of+Song+and+Flight%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Multifunctional Wing Motor Control of Song and Flight.</a> Current Biology. 28, 2705-2717 (2018).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont pas de conflits d’intérêts à divulguer.

En utilisant les méthodes décrites dans ce protocole, nous fournissons une approche simple pour la dissection du tissu de DLM et démontrons comment ceci peut être appliqué pour évaluer l’intégrité synaptique par la coloration structurelle et les marqueurs synaptiques dans la Drosophila adulte. Une étape critique dans le protocole qui rend le tissu DLM plus facile à disséquer est la congélation éclair avec de l’azote liquide. Sans cette étape, le tissu est moins ferme et plus difficile à couper précisément comme observé à la figure 3. Ce protocole s’appuie sur des méthodes de dissection antérieures pour permettre la préservation des neurones moteurs et des tissus musculaires18,19,20,21,22,23. Une limitation de ce protocole est que lors de la réduction de la ligne médiane pour la bisection, il peut être difficile d’obtenir deux préparations propres par thorax. Une façon d’assurer au moins un hemithorax par mouche, vous pouvez délibérément couper d’un côté du thorax pour obtenir une préparation propre. Avec cette modification, il peut également être nécessaire d’enlever l’excès de tissu de la coupe pour nettoyer l’échantillon avec le disjoncteur de lame. Pour ceux qui sont nouveaux dans cette technique, avec la pratique continue, la précision de la bisection augmentera.
La méthode décrite ici permet aux chercheurs d’évaluer facilement l’intégrité structurelle des DJ adultes de DLM à tout moment de leur durée de vie. Un avantage majeur de ce protocole est la capacité d’accéder à l’intégrité synaptique dans les modèles de maladies neurodégénératives en utilisant des marqueurs synaptiques. Nous démontrons que cette application peut aider à visualiser les changements dans la morphologie brute avec la coloration structurelle (Figure 1C\u2012H). En outre, l’intégrité synaptique peut être évaluée avec la coloration des marqueurs présynaptiques, y compris, mais sans s’y limiter, la synapsine28 (figure 2A\u2012F),syntaxine29 (figure 2G\u2012L) et BRP30 (figure 2M\u2012R). Le tissu musculaire postsynaptique peut également être évalué à l’aide de l’anticorps de sous-unité31 du récepteur du glutamate III(figure 2S\u2012X),démontrant l’utilité de ce protocole.
Les chercheurs peuvent également utiliser cette méthode de dissection pour compléter les données fonctionnelles afin d’examiner de façon exhaustive l’intégrité structurelle des synapses associées à une grande variété de maladies. Ces synapses permettent également l’analyse fonctionnelle par le biais d’enregistrements électrophysiologiques32,33,34 et l’essai de vol10. Ce protocole peut également faciliter l’accès au tissu pour de nombreuses applications et tests. Les études futures, par exemple, pourraient utiliser ce protocole pour quantifier les changements synaptiques par la quantification de la densité et du nombre de synapses15,16. Alors que le protocole décrit ici examine spécifiquement l’intégrité synaptique des neurones moteurs, des protocoles complémentaires pour évaluer la perte de cellules musculaires peuvent également être effectués avec cette dissection en utilisant tunel coloration35. Pour examiner la perte neuronale, la dissection du ganglion thoracique36 pourrait également être employée avec la coloration tunel. Nous nous attendons à ce que la dissection décrite ici aura plus d’applications aux études futures évaluant les pathologies liées à l’âge ainsi que les maladies neurodégénératives.

Le dysfonctionnement synaptique est parmi les premières caractéristiques connues de la plupart des maladies neurodégénératives majeures1,2,3,4,5,6. Cependant, on sait très peu de choses quant à la façon dont ces déficiences structurelles et fonctionnelles se rapportent aux stades ultérieurs de la progression de la maladie. Drosophila s’est avéré être un système de modèle utile pour comprendre la croissance et le développement de la synapse à l’aide de NMJslarvaires 7,8,9. Cependant, le troisième stade d’étoile larvaire ne dure que quelques jours, limitant leur utilité dans l’étude progressive, la neurodégénérescence dépendante de l’âge. Une alternative à l’évaluation des NMJ larvaires consiste à examiner les structures synaptiques chez les Drosophilaadultes, telles que les synapses formées sur les muscles longitudinals dorsaux (DLM) qui sont nécessaires pour le vol10,11,12,13,14,15,16. Ces synapses tripartites sont structurellement organisées de la même manière que les synapses de mammifères17,offrant un avantage unique pour évaluer les modèles de maladies neurodégénératives.
Ici, nous décrivons une méthode simple pour analyser l’intégrité structurelle des NMJ adultes dans un modèle Drosophila de neurodégénérescence. Les méthodes et les études précédentes de dissection de DLM ont souligné l’importance de préserver le tissu musculaire pour une variété d’applications18,19,20,21,22,23. Notre protocole fournit une méthode complète pour préserver les tissus neuronaux et musculaires pour étudier les maladies neurodégénératives. Un autre élément important de l’étude de ces maladies est la capacité de comprendre la perte neuronale d’une manière dépendante de l’âge. Les travaux précédents fournissent une compréhension critique et approfondie de la façon dont les NMJ DLM sont formés au cours de la métamorphose au début de l’âge adulte11,12,14,15,16,24. Notre protocole établit une méthode pour s’appuyer sur ce travail pour étudier les NMJ de DLM d’une manière dépendante de l’âge dans les maladies vieillissantes et neurodégénératives.

<table><tbody><tr><td>32 % Formaldéhyde</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>15714</td><td>Préservation des tissus</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 chèvre anti souris</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11031</td><td>Étiquettes anticorps primaires. Utilisé à une concentration de 1:200.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 chèvre anti lapin</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11036</td><td>Étiquettes anticorps primaires. Utilisé à une concentration de 1:200.</td></tr><tr><td>anticorps anti-Bruchpilot (BRP)</td><td>Études développementales Banque d’hybridomes</td><td>NC82</td><td>Colore les zones actives dans les neurones présynaptiques. Utilisé à une concentration de 1:25.</td></tr><tr><td>anticorps anti-GluRIII</td><td>Cadeau d’Aaron DiAntonio</td><td>N/A</td><td>Labels sous-unités du récepteur du glutamate. Utilisé à une concentration de 1:1000.</td></tr><tr><td>Anticorps anti-Synapsine</td><td>Études développementales Banque d’hybridomes</td><td>3C11</td><td>Marque la protéine synaptique synapsine. Utilisé à une concentration de 1:50.</td></tr><tr><td>Études</td><td>développementales Hybridoma Bank</td><td>8C3</td><td>marque la protéine synaptique syntaxine. Utilisé à une concentration de 1:10.</td></tr><tr><td>BenchRocker</td><td>Genesee Scientific</td><td>31-302</td><td>Rotation des échantillons pendant la coloration</td></tr><tr><td>Blade Breaker</td><td>Fine Science Tools</td><td>10053-09</td><td>Utilisé pour tenir</td></tr><tr><td>les lamelles de couvre-lame</td> de plume <td>Fisher Scientific</td><td>12548A</td><td>Pour le montage de</td></tr><tr><td>tissus Gants cryogéniques</td><td>VWR</td><td>97008-198</td><td>Protéger les mains de l’azote liquide</td></tr><tr><td>Pince à épiler cryogénique</td><td>VWR</td><td>82027-432</td><td>Tenir un tube de 2,0 mL dans un</td>flacon de dewar à l’azote</tr><tr><td>liquide-1900 mL</td><td>Thomas Scientific</td><td>5028M54</td><td>Tenir l’azote liquide</td></tr><tr><td>Lames de plumes</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>72002-01</td><td>Lames de scalpel</td></tr><tr><td>Forecps fins x 2</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>11252-20</td><td>Une paire fine pour dégager la ligne médiane du thorax. L’autre paire peut être émoussée à l’aide d’une pierre à aiguiser.</td></tr><tr><td>L’anti-HRP conjugué à la FITC</td><td>Jackson Laboratories</td><td>123-545-021</td><td>colore les motoneurones. Utilisé à une concentration de 1:100</td></tr><tr><td>boîte de congélation (noir)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14100F</td><td>Protège les échantillons de la lumière</td></tr><tr><td>pipettes pasteur en verre</td><td>VWR</td><td>14637-010</td><td>Utilisé pour le transfert d’échantillons</td></tr><tr><td>lames de verre</td><td>Fisher Scientific</td><td>12550143</td><td>Pour le montage</td></tr><tr><td>de supports de montage de tissus (vectashield) anti-décoloration</td><td>VWR</td><td>101098-042</td><td>Supports de montage vernis à</td></tr><tr><td>ongles</td> de signalisation fluorescente <td>Microscopie électronique Sciences</td><td>72180</td><td>Sceaux lames de microscope</td></tr> sérum <tr><td>de chèvre normal</td><td>Fisher Scientific</td><td>PCN5000</td><td>Empêche la liaison non spécifique des anticorps</td></tr><tr><td>pinceau</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-204</td><td>Transfert de</td></tr><tr><td>mouches PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-010-023</td><td>Solution saline pour la dissection et la coloration</td></tr><tr><td>Phalloïdine 647</td><td>Abcam</td><td>AB176759</td><td>Colore l’actine F dans le tissu musculaire. Utilisé à une concentration de 1:1000</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri en plastique (100 mm)</td><td>VWR</td><td>25373-100</td> Étiquettes de renforcement de <td>la boîte de dissection</td></tr><tr><td></td><td>W.B. Mason</td><td>AVE05722</td><td>Fournit un support pour lamelle en verre sur le</td></tr><tr><td>bloc d’affûtage de</td> tissu monté <td>Grainger</td><td>1RDF5</td><td>Maintien de l’affûtage des pinces fines et émoussement également de la chemise à lames à paire séparée</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>10126-326</td><td>Échantillon </td></tr><tr><td>ciseaux de bureau standard</td> de stockage <td>W.B. Mason</td><td>ACM40618</td><td>Étiquettes de renfort de coupe</td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>24236-10</td><td>Revêtement pour plat de dissection</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>22140</td><td>Aide à perméabiliser les tissus</td></tr><tr><td>Vannas Séseaux de dissection</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>1500-00</td><td>Ued pour enlever les pattes de mouche et faire une incision sur le thorax</td></tr></tbody></table>

visualisation de la dégénérescence synaptique chez les adultes drosophila en association avec la neurodégénérescence

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

Drosophila sert de modèle utile pour évaluer la structure synaptique et la fonction associée aux maladies neurodégénératives. Bien que beaucoup de travail se soit concentré sur les jonctions neuromusculaires (NMJ) chez les larves de Drosophila, l’évaluation de l’intégrité synaptique chez les adultes Drosophila a reçu beaucoup moins d’attention. Ici, nous fournissons une méthode simple pour la dissection des muscles longitudinals dorsaux (DLM), qui sont nécessaires pour la capacité de vol. En plus du vol comme lecture comportementale, cette dissection permet aux deux synapses DLM et le tissu musculaire d’être adapté à l’analyse structurelle en utilisant des anticorps fluorescents étiquetés pour les marqueurs synaptiques ou les protéines d’intérêt. Ce protocole permet l’évaluation de l’intégrité structurelle des synapses chez les Drosophila adultes pendant le vieillissement pour modéliser la nature progressive et dépendante de l’âge de la plupart des maladies neurodégénératives.

La génération de mouches transgéniques exprimant la protéine humaine tar-binding de 43 kDa mutant (TDP-43M337V) est représentée par le schématique (Figure 1A). Cela démontre l’application du système binaire Gal4/UAS dans Drosophila27. L’illustration dépeint un hemithorax avec six fibres musculaires, A\u2012F allant de la fibre la plus dorsale A à la plus ventrale F (Figure 1B)11,12. Pour évaluer l’intégrité synaptique, les NMJ ont été tachés de HRP et de Phalloidin (Figure 1C\u2012E). Les neurones moteurs des mutants TDP-43M337V (Figure 1F)ont peu ou pas de taches HRP au jour 21, tandis que WT (Oregon-R) reste intact (figure 1C). Il n’y a pas de différences visibles dans la coloration musculaire (Figure 1D,G). Les changements de morphologie brute observés chez les mutants TDP-43M337V démontrent comment l’intégrité synaptique peut être impliquée dans un modèle de maladie neurodégénérative de la sclérose latérale amyotrophique (SLA) à l’aide du modèle DLM adulte. En plus de la coloration structurelle, la coloration des NMJ DLM peut également fournir une évaluation de l’intégrité synaptique avec des marqueurs presynaptiques (Figure 2A\u2012R) et post synaptiques (Figure 2S\u2012X). Ensemble, ces résultats illustrent comment ce protocole de dissection pourrait être appliqué à l’étude du tissu de DLM dans les maladies neurodégénératives.
Un aspect clé de cette dissection est l’application de l’azote liquide pour clignoter geler le tissu pour rendre la bisection plus facile. L’utilité de l’azote liquide est démontrée chez les mouches WT avec de l’azote liquide où le tissu musculaire n’a pas de dommages ou de fibres entaillées (Figure 3A\u2012C). Sans azote liquide, le tissu peut être plus difficile à disséquer. Par exemple, en suivant ce protocole et en sautant l’étape de congélation éclair d’azote liquide permet au tissu d’être plus sensible aux dommages causés par les outils de dissection tels que les neurones endommagés (Figure 3D) ou les fibres musculaires endommagées (Figure 3E). L’application de l’azote liquide aide à prévenir les lésions tissulaires qui pourraient survenir lorsque vous travaillez avec le tissu DLM, quel que soit le génotype du spécimen (figure 3C et 3F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61363/61363fig1.jpg"> Figure 1 : Dénervation progressive des synapses DLM dans un modèle de Drosophila de la SLA. (A) La génération de mouches transgéniques de la SLA exprimant une forme mutante humaine de protéine tar-binding de 43 kDa (TDP-43) est présentée dans le schéma. (B) L’illustration dépeint la forme et l’orientation d’un hémithorax dans un Drosophilaadulte . En utilisant le protocole, nous pouvons observer la perte progressive de l’intégrité synaptique des synapses DLM NMJ par la coloration structurelle des neurones moteurs avec HRP (vert) et le tissu musculaire avec la phaloïdine (magenta). Notre modèle dépeint la perte d’intégrité synaptique dans un modèle adulte de la SLA à travers la génération de mouches adultes exprimant un mutant de l’homme TDP-43M337V dans les neurones moteurs (Figure 1F\u2012H) par rapport à WT (Figure 1C\u2012E) mouches dans la fibre musculaire C. Arrows mettre en évidence des exemples d’une synapse WT (Figure 1C) et un exemple de perte d’intégrité synaptique. Barre d’échelle =20 μm au grossissement de 63x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61363/61363fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61363/61363fig2.jpg"> Figure 2 : Évaluation de l’intégrité synaptique à l’aide de marqueurs présynaptiques chez les NMJ adultes. L’intégrité synaptique peut également être évaluée à l’aide de marqueurs presynaptiques et postsynaptiques chez les mouches WT qui ont 14 jours dans la fibre musculaire C. Les marqueurs présynaptiques Synapsine (B), Syntaxine (H) et Bruchpilot (BRP) (N) sont co-tachés avec HRP (A, G, M). La coloration représente la localisation de ces marqueurs aux terminaux présynaptiques (C, I, O). Au grossissement plus élevé, les images illustrent la localisation de Synapsin (E), Syntaxin (K), et BRP (Q) avec HRP (D, J, et P) plus en détail (Figure F, L, et R). Nous montrons également un marqueur postsynaptique Glutamate Receptor III (GluRIII) (T) co-taché avec HRP (S). La co-coloration démontre l’utilité de ces marqueurs (U). Au grossissement plus élevé, les images représentatives illustrent la localisation (X) de GluRIII (W) et HRP (V) au tissu musculaire postsynaptique et aux terminaux presynaptiques, respectivement. La barre d’échelle pour les panneaux A\u2012C, G-I, M\u2012O, S\u2012U représente 20 μm au grossissement 63x. La barre d’échelle pour les panneaux D\u2012F, 2J-2L, 2P-2R et 2V-2X représente 10 μm au grossissement 63x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61363/61363fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61363/61363fig3.jpg"> Figure 3 : Utilité de l’azote liquide pour les dissections DLM. Pour démontrer l’utilité de l’azote liquide pour les dissections DLM, nous montrons une comparaison du jour 21 WT vole avec et sans azote liquide de la fibre musculaire C. Avec l’azote liquide, la phalloïdine (B) reste intacte et ne compromet pas la coloration HRP (A, C). Sans azote liquide, le tissu musculaire devient filandreux et difficile à couper en deux (E) et la coloration HRP (D, F) devient compromise en raison d’une erreur technique. Les flèches blanches montrent une zone sans dommages musculaires avec de l’azote liquide (B) et des tissus musculaires endommagés (E). Barre d’échelle = 20 μm au grossissement de 63x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61363/61363fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

Le but de cette procédure est de disséquer le tissu longitudinal dorsal (DLM) pour évaluer l’intégrité structurelle des jonctions neuromusculaires DLM (NMJs) dans les modèles de maladies neurodégénératives utilisant Drosophila melanogaster.

Visualisation de la dégénérescence synaptique chez les adultes Drosophila en association avec la neurodégénérescence

Drosophila serves as a useful model for assessing synaptic structure and function associated with neurodegenerative diseases. While much work has focused ...

Un protocole fournit un modèle simple pour évaluer l’intégrité synaptique d’une manière dépendante de l’âge. Ainsi, nous pouvons étudier les maladies neurodégénératives dans les tissus qui sont utilisables à la fois à l’analyse structurelle et fonctionnelle. Cette technique facilite la préservation des tissus neuronaux et musculaires des jonctions neuromusculaires longitudinales dorsales du muscle.Étudier en profondeur la fonction synaptique au fil du temps et les tissus qui sont difficiles à travailler avec. Cette méthode peut être appliquée à l’étude des maladies neurodégénératives, y compris la SLA, la maladie de Parkinson, la maladie de Huntington et la maladie d’Alzheimer. Avant de commencer, la dissection a coupé environ 10 millimètres de la pointe d’une pipette de 200 microlitres.Après l’administration de l’anesthésie, jouer six à 10 mouches dans une boîte de Six centimètres Petri contenant 70% d’éthanol et utiliser un pinceau pour siroter doucement fusionner chaque mouche. Après une à deux minutes, utiliser des forceps pour transférer une mouche par les jambes ou les ailes à un plat de dissection enduit d’élastomer en silicone contenant de sept à 10 millilitres de PBS sous un microscope disséquant. Avec la mouche immergée dans le PBS, utilisez des forceps de recherche Dumont émoussés numéro cinq pour enlever soigneusement les ailes et utiliser des ciseaux de dissection de ressort à bord droit pour faire une petite incision dans le côté ventral de la cuticule pour enlever les jambes.En tenant les ciseaux de dissection dans une main et les forceps contondants dans l’autre, placez le côté ventral de mouche vers le haut et maintenez le spécimen en place avec les forceps, enlevez la tête et l’abdomen avec les ciseaux. Utilisez une pipette de 200 microlitres réglée sur 40 microlitres et la pointe de pipette modifiée pour recueillir les thoraciques et placer les échantillons de tissus isolés dans un tube dûment étiqueté contenant 900 microlitres de PBS et 150 microlitres de formaldéhyde à 32 %. Après 30 minutes à température ambiante, utiliser une pipette Pasteur pour enlever le fixatif et rincer les plis trois fois avec 1,5 millilitres de PBS par lavage.Avant de commencer les bisections Don cryo gants de protection et des lunettes de sécurité et remplir un flacon de tournée avec de l’azote liquide. Utilisez un disjoncteur à lame pour saisir une lame de plume à un angle et plier la lame pour détacher un petit morceau. Utilisez le disjoncteur à lame pour verrouiller la lame en position et utilisez une pipette Pasteur en verre pour retirer tous les PBS des tubes de l’échantillon.Utilisez des pinces cryogéniques pour plonger les tubes dans le flacon d’azote liquide. Après 10 secondes, utilisez une pipette Pasteur pour ajouter environ 300 microlitres de PBS glacé à chaque tube sur la glace, et placez un côté ventral axe pauvre vers le haut dans un plat de dissection enduit d’élastomer de silicone de 10 centimètres contenant du PBS glacé. Utilisez une paire terne de forceps pour positionner le thorax et pour trouver la paire de forceps, pour enlever une partie des ganglions thoraciques pour exposer la ligne médiane du thorax.En utilisant la ligne médiane du thorax comme guide, utilisez le jeu pour faire une coupe peu profonde à travers un tiers du thorax et utiliser les forceps contondants pour positionner le thorax à un angle de 45 degrés. Utilisez la lame pour couper directement la ligne médiane du thorax pour obtenir deux hémithoraces et pour faire soigneusement une ou deux coupures pour enlever l’excès de tissu sans endommager les muscles longitudinals dorsal. Placez ensuite les échantillons de tissu musculaire dans un tube de PBS dûment étiqueté.Lorsque tous les échantillons de thorax ont été coupés en deux perméabilize les tissus en bloquant tampon pendant au moins une heure à quatre degrés Celsius. À la fin de l’incubation, vortex fraîchement préparé solution de tache structurelle et ajouter 150 microlitres de la tache à chaque échantillon pour une incubation de deux heures sur un rotateur à température ambiante dans l’obscurité. Après avoir souillé laver les échantillons dans PBST, et placer cinq étiquettes de renforcement empilées et coupées en deux de 15 millimètres l’un de l’autre sur une lame de microscope en verre.Utilisez une pointe de micro pipette modifiée pour transférer les Thoraces sur chaque glissière et utilisez un lingette de laboratoire pour éliminer tout excès de PBST. Utilisez des forceps pour organiser les échantillons de sorte que les Thoraces sont face côté muscle vers le haut. Lorsque les échantillons sont correctement orientés, utilisez une pointe de pipette de 200 microlitres pour appliquer 70 microlitres de milieu de montage à chaque glissière et couvrir chaque glissière d’un glissement de couvercle.Ensuite, utilisez du vernis à ongles pour enrober généreusement les bords extérieurs des feuillets de couverture pour obtenir un joint complet autour de chaque tissu. Évaluer l’intégrité synaptique. Les jonctions neuromusculaires peuvent être tachées de peroxidase de raifort et d’étain Floe Les motoneurones dans la protéine liant le goudron de 43 moutons kilodaltons ont peu ou pas de taches de peroxyde de raifort au jour 21, tandis que la protéine de type sauvage reste intacte.Aucune différence visible dans la coloration musculaire n’est observée. En plus de la coloration structurale dorsal l’étiquetage longitudinal de jonction neuromusculaire de muscle peut également fournir une évaluation de l’intégrité synaptique avec des marqueurs pré synaptiques et post-synaptiques. Notez que le gel par flash d’azote liquide facilite une bisection réussie car les tissus congelés non flash sont plus sensibles aux dommages pendant la dissection.Suivant cette procédure, les échantillons de conserve peuvent être analysés par microscopie confocale pour mesurer un aspect spécifique de la structure synaptique.

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Dissection et immunofluorescence souillant de champignon corps et photorécepteur de neurones dans le cerveau adulte Drosophila melanogaster

Nous avons développé un workflow simple et adaptable pour extraire des données quantitatives d’études biologiques de fluorescence dotés d’imagerie cellulaire d’agrégation des protéines et du flux autophagie dans le système nerveux central de Drosophila modèles de neurodégénérescence.

Biologie cellulaire quantitative de neurodégénération chez la drosophile grâce à l’analyse impartiale des protéines fluorescent étiquetées à l’aide de ImageJ

Nous décrivons ici un protocole afin de visualiser le ciblage axonale avec une protéine fluorescente dans jambes adultes de la drosophile par fixation, montage, imagerie et imageries après étapes.

Visualiser les Drosophila jambe axones des motoneurones à travers la cuticule de l’adulte

Ici, nous fournissons des protocoles pour effectuer trois simples essais de dégénérescence d’axone induits par les blessures (mort d’axone) dans Drosophila melanogaster pour évaluer la préservation morphologique et fonctionnelle des axones coupés et de leurs synapses.

Évaluation morphologique et fonctionnelle des axones et de leurs Synapses pendant la mort d’Axon dans Drosophila melanogaster

Découvrez une technique de dissection du muscle dorsal longitudinal chez Drosophila melanogaster pour évaluer l'intégrité des jonctions neuromusculaires. Cette méthode permet d'étudier la dégénérescence synaptique dans les maladies neurodégénératives.

Visualisation de la dégénérescence synaptique chez les adultes Drosophila en association avec la neurodégénérescence

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