Approche génétique avancée des cellules vivantes pour identifier et isoler les mutants du développement dans chlamydia trachomatis

Ce protocole fournit un outil unique pour la génération et l’isolement de la chlamydia avec des profils développementaux modifiés, permettant finalement l’identification des gènes qui régulent le cycle développemental. Les principaux avantages de cette méthode sont la capacité de suivre le développement des cellules de chlamydia en temps réel et la capacité d’isoler la chlamydia, avec modifier les programmes de développement. Pour mutagenize un journaliste de trachomatis de chlamydia, a vu un stock chlamydial contenant approximativement trois fois 10ème aux septièmes corps élémentaires.

Transformée avec le plasma reporter d’intérêt et de granulés, la pensée est approvisionnée par centrofugation. utiliser la sonication à 10% de puissance pendant 10 secondes, pour résuspendre les corps élémentaires dans 100 microlitres de tampon métabolisme accidentel et diviser la suspension du corps élémentaire résultant également, entre deux tubes de micro centrifugeuse de 1,5 millilitre. Ajouter 50 microlitres de solution de métabolisme du SME fraîchement préparée dans les aliquots chlamydia pour la mutagenèse et 50 microlitres de tampon métabolisme vaccinal à l’aliquot chlamydia que pour la mutagenèse des stocks et incuber les deux échantillons pendant 20 minutes, à température ambiante.

Le SME est un gants d’usure cancérigène connu pendant la manipulation et trempez tout l’équipement et le milieu contaminés par le SMU dans un hydroxyde de sodium molaire pendant 24 heures avant l’élimination. Mettre en place une culture de gros, pour l’imagerie et l’isolement des tracradiomètres mutigenized chlamydia. Graine six plaques de fond en verre bien, avec six fois 10 à la cinquième coût sept cellules, en deux millilitres de milieu complet par puits et la graine d’une plaque de polystyrène 24 puits avec 10 à la cinquième cause sept cellules dans un millilitre de milieu complet par puits.

Pour infecter la culture cellulaire hôte avec mutagenized nie chlamydia trachomatis infecter, cinq puits d’une plaque de verre à fond avec environ six fois 10 à la cinquième, des corps élémentaires mutagenized. Dans 1,5 millilitres de HBSS glacé par puits. et infecter le puits restant, avec environ deux fois 10 à la cinquième maquette mutagenized corps élémentaires dans 1,5 millilitres de HBSS glacé par puits, après une incubation de 15 minutes à 37 degrés Celsius, avec basculement, laver les cellules infectées avec 37 degrés Celsius HBSS complété par un milligramme par millilitre d’héparine, suivie immédiatement d’un rinçage HBSS.

laver les cellules avec de l’héparine à nouveau, suivie immédiatement de deux rinçages avec HBSS seul pour s’assurer que toute l’héparine est enlevée. Après le dernier lavage, ajouter quatre millilitres de 37 degrés Celsius milieu d’imagerie, à chaque puits. Et remplissez les espaces inter puits avec 37 degrés Celsius d’eau déionisée, puis placez les plaques dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 10 heures.

À la fin de l’incubation a fixé l’incubateur de stade microscope à 5% de dioxyde de carbone, et 37 degrés Celsius. Et placez les six plaques de fond en verre du puits.dans l’incubateur de scène. Dans le logiciel d’imagerie, utilisez le plugin de criblage à contenu élevé pour sélectionner le modèle de six plaques de puits, et générer une liste de position d’imagerie composée de 12 champs de vue par puits utiliser l’option autofocus pour mettre l’accent sur l’imagerie automatisée et définir l’exposition à 250 millisecondes à une intensité de 4% dans le canal GFB et une densité de 18% dans le canal RFP.

Donc, au cycle d’imagerie pendant 24 heures, avec des intervalles de 30 minutes, pour capturer la cinétique du cycle de développement et définir la capture d’image pour inclure plusieurs piles Z avec une gamme de mise au point qui se termine de chaque côté de la tranche InFocus, puis sélectionnez Z relatif pour l’imagerie, plusieurs tranches dans la fenêtre d’acquisition et utiliser l’option fichier pile d’images. pour définir les images à enregistrées sous forme de fichiers de pile TIFF. Pour identifier les pistes d’inclusion, avec modifier les profils de développement, utilisez la cellule d’importation dans l’écran EMS, markdown Python notebook, pour importer les données de suivi d’inclusion à partir des taches dans les statistiques de suivi, fichiers CSV dans le cadre de données du Panda.

Utilisez la cellule de calcul pour calculer le temps d’avoir une expression maximale pour les journalistes précoces et tardifs pour chaque piste et utilisez le paquet de traçage bokeh, dans la cellule de complot demi-max, pour visualiser le temps deux demi-expression max à la moitié de l’expression maximale par rapport à celle du bal hctB. Utilisez la piste interactive bokeh ID Explorer, pour identifier les inclusions de la population mutante, qui tombent en dehors du nuage de dispersion traité simulé. Pour visualiser les changements dans l’expression de promoteur cinétique dynamiquement dans le graphique animé de cellule de sang les intensités d’expression du bal d’EOU contre le bal de hctB.

Visualisez ensuite un instantané à partir du graphique animé, dans la cellule de localisation d’inclusion. Pour isoler les Newtons développementaux, des inclusions d’intérêt, positionner le champ de vision sur un puits avec une inclusion identifiée, et passer l’aiguille au-dessus de la source de lumière de canal de lumière blanche de contraste de contraste de phase, pour visualiser l’aiguille, employer le nanomètre 595, canal d’excitation, pour visualiser les corps élémentaires pour l’extraction. Et utiliser le réglage fin et le micro manipulateur, pour manœuvrer l’aiguille capillaire à l’inclusion, rompre l’inclusion avec l’aiguille, et utiliser le micro injecteur pour attirer les corps élémentaires dans la pointe de l’aiguille capillaire.

Expulser les corps élémentaires extraits, de l’aiguille capillaire dans un seul puits, de la plaque de polystyrène préparé à 24 puits, et utiliser une nouvelle aiguille capillaire pour la prochaine extraction. Après une expansion suffisante de chaque isolat, perturbez le monocouche infecté avec une pointe de micropipède d’un millilitre et transférez les débris des cellules moyennes et la chlamydia libérée dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre. Pelleter la chlamydia récoltée par centrifugation, et resuspendre la pastille dans 75 microlitres de froid glacé, tampon glutamate phosphate saccharose, puis diviser la suspension d’inclusion également, entre trois nouveaux tubes de 1,5 millilitre bouchon à vis micro centrifugeuses, et stocker les tubes à moins 80 pour lire Celsius.

Pour mettre en place une culture cellulaire hôte pour l’imagerie de mutagen ISED isole les graines d’une plaque de fond en verre de 96 puits avec 1,6 fois 10 à la quatrième coût sept cellules, en 100 microlitres de milieu complet par puits. Une fois que le monocouche des cellules hôtes aura atteint le dégel de la confluence, les clones mutants récoltés et les stocks de chlamydia de type sauvage sur la glace et utiliser une colonne par isolat pour effectuer, une dilution en série double de chaque isolat mutant. Infecter, la colonne restante avec chlamydia de type sauvage, à une multiplicité d’infection d’environ 0,5, et placer une plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 10 heures à la fin de l’incubation, sélectionner trois puits par isolat mutant qui correspondent à une multiplicité d’infection de moins d’un, et de générer une liste de position d’imagerie.

composé de deux champs de vision par puits. Dans ce scatterplot, le temps à la moitié de l’expression maximale de l’EOU et hctB promoteurs d’isolats chlamydiaux individuels peuvent être observés clones A3667 et B3858 a été élu pour l’isolement car ils ont produit des temps plus courts pour avoir une expression maximale, du promoteur EOU et plus de fois quatre hctB. Des inclusions avec la cinétique altérée peuvent être identifiées basées sur la visualisation, de l’expression dynamique de gène des deux promoteurs, et un instantané du graphique animé peut être employé, pour identifier l’endroit des inclusions d’intérêt.

Dans ces visualisations représentatives, un total de 24 inclusions ont été identifiées pour l’isolement, 10 dont ont exhibé la cinétique différentielle, après retestage dans trois catégories phénotypiques différentes, huit isolats ont exhibé l’expression diminuée de promoteur d’EOU à environ 24 heures après infection. Comme l’a démontré le clone de l’A3667, l’isolat B3858 a également montré une diminution de l’expression du promoteur de l’EOU, à environ 24 heures après l’infection. Mais une augmentation globale de l’expression du promoteur hctB, alors que l’isolat B3662, a exprimé des niveaux accrus de florescence du promoteur de l’EOU suivis d’une perte soudaine d’expression chez les deux promoteurs.

L’analyse des micrographes cellulaires vivants pour le mutant B3662, révèle que la lyse des cellules hôtes s’est produite, dans les cellules infectées par ce mutant, beaucoup plus tôt que dans les cellules infectées de type sauvage. Le rétablissement déficient de chlamydia de développement de type cellulaire, peut ne pas être possible, car ces cellules ne peuvent pas réinfecter l’hôte. Les études d’association à l’échelle du génome peuvent être utilisées après isolement, afin d’identifier les gènes de développement, par corrélation statistique, avec l’incorporation de journalistes promoteurs alternatifs.

Cette méthode peut être étendue, à l’enquête de nombreuses voies génétiques, dans la dissection des mécanismes de circuit génétique, et d’autres pathogènes intracellulaires.