Application de la microdissection laser pour découvrir la transcriptomics régionale dans le tissu rénal humain
9 juin 2020
Nous décrivons un protocole pour la microdissection laser des sous-segments du rein humain, y compris le glomerulus, le tubule proximal, le membre ascendant épais, le conduit de collecte et l’interstitium. L’ARN est ensuite isolé des compartiments obtenus et le séquençage de l’ARN est effectué pour déterminer les changements dans la signature transcriptomique dans chaque sous-segment.
La microdissection laser permet l’analyse transcriptomique de régions spatialement définies dans les échantillons de tissus rénaux. Cela nous donne l’occasion unique d’identifier des structures d’intérêt même après que des changements induits par la maladie aient eu lieu. Les principaux avantages de cette méthodologie sont sa complémentarité avec d’autres technologies omiques, telles que le séquençage de l’ARN sur cellule unique.
Il offre une économie tissulaire remarquable et permet même de détecter des transcrits faiblement exprimés. Après avoir acquis l’échantillon de tissu, utilisez un cryostat réglé à moins 20 degrés Celsius pour couper l’échantillon à une épaisseur de 12 micromètres et utilisez l’adaptateur de lame pour fixer l’échantillon à une lame de microdissection laser spécialisée. Dans les 10 jours suivant la cryosection, mélangez 89,2 microlitres de 10 % BSA sans RNase dans du PBS avec quatre microlitres de phalloidine FITC, 1,5 microlitre de DAPI, deux microlitres de l’anticorps d’intérêt directement conjugués à Alexa Fluor 546 et 3,3 microlitres d’inhibiteur de RNase.
Lavez la lame à moins 20 degrés Celsius 100 % acétone pendant une minute et placez la lame dans une chambre d’humidité. Lavez le haut de la lame deux fois avec du PBS frais sans RNase pendant 30 secondes par lavage, suivi de deux lavages de 30 secondes avec 10 % de BSA dans du PBS sans RNase. Après le dernier lavage, traitez l’échantillon avec la solution d’anticorps préparée pendant cinq minutes à température ambiante avant de laver deux fois de plus avec 10 % BSA dans du PBS sans RNase.
Après le deuxième lavage, faites sécher la lame à l’air libre pendant cinq minutes dans une hotte de culture tissulaire avant de charger la lame sur la plate-forme de découpe par microdissection laser. Installez sur le dispositif des tubes de prélèvement de micro-centrifugeuse de 500 microlitres autoclavés, adaptés aux travaux de PCR, contenant 50 microlitres de tampon d’extraction d’un kit d’isolement d’ARN. Après le chargement, identifiez les régions d’intérêt dans l’échantillon par coloration, morphologie et emplacement.
Utilisez l’immunofluorescence pour délimiter au moins 500 000 micromètres de segments carrés d’intérêt. Lancez ensuite la microdissection laser pour exciser la région à l’aide d’une puissance laser supérieure à 40. Une fois le processus de microdissection au laser terminé, bouchez les tubes de collecte de la microcentrifugeuse et agitez vigoureusement les tubes pour vous assurer que le contenu se déplace des bouchons vers le fond des tubes.
Après la centrifugation, incubez les tubes dans un bain-marie à 42 degrés Celsius pendant 30 minutes avant de centrifuger à nouveau les tubes. Transférez ensuite les surnageants dans de nouveaux tubes de 500 microlitres à partir d’un stockage à moins 80 degrés Celsius. L’identification des sous-segments tubulaires dans le rein est réalisée par coloration par anticorps de marqueurs tubulaires uniques en plus de la morphologie cellulaire et des repères structurels.
Le marquage par fluorescence en conjonction avec les caractéristiques morphologiques des tissus et le positionnement spatial des structures d’image facilite la visualisation des sous-segments rénaux avec un haut degré de confiance. Dans cette analyse de séquençage en aval représentative, le taux de réussite du respect de l’entrée minimale de la zone de dissection était supérieur à 90 %, ce qui a permis d’obtenir une quantité totale élevée d’ARNm disponible pour la détection des gènes. Dans cette analyse, 100 % des échantillons ont atteint le seuil de détection minimum d’au moins 10 000 gènes.
Après microdissection laser, l’analyse d’enrichissement de l’expression génique de marqueurs connus peut être comparée à celles d’autres compartiments. Dans cette analyse, un marqueur pour chaque sous-segment a été identifié par transcriptomique régionale de microdissection laser qui a également produit une coloration immunohistochimique spécifique du sous-segment de néphron correspondant. Il est important de noter que la microdissection laser s’appuie fortement sur l’expertise de l’utilisateur pour identifier précisément les structures d’intérêt à disséquer.
Cette technique permet d’étudier des signatures d’expression génique régionales spécifiques qui peuvent être utilisées pour évaluer les voies potentielles impliquées dans la progression de la maladie, ainsi que la biologie des tissus sains.
Consultez la transcription complète et accédez à des milliers de vidéos scientifiques
Aperçu
Cette étude présente un protocole de microdissection laser de sous-segments spécifiques dans le tissu rénal humain, notamment le glomérule et le tubule proximal. L'ARN isolé à partir de ces compartiments permet une analyse transcriptomique afin de révéler les modifications des profils d'expression génique associées aux différentes structures rénales.
Composantes clés de l'étude
Domaine de recherche
- Analyse transcriptomique
- Biologie rénale
- Étude de la progression de la maladie
Contexte
- Importance de l'étude des sous-segments rénaux
- Difficultés liées à l'analyse des structures spatialement définies après une maladie
- Complémentarité avec d'autres technologies omiques
Méthodes utilisées
- Microdissection laser
- Échantillons de tissu rénal humain
- Isolation et séquençage de l'ARN
Résultats principaux
- Taux de réussite élevé pour la dissection et la récupération d'ARN
- Identification de marqueurs d'expression génique pour les sous-segments rénaux
- Mise en évidence de voies potentielles liées à la progression de la maladie
Conclusions
- Ce protocole décrit une méthode efficace pour étudier l'expression génique régionale dans le rein.
- Les résultats contribuent à la compréhension de la biologie rénale et des mécanismes pathologiques potentiels.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
La microdissection laser permet un profilage transcriptomique résolu spatialement de tissu rénal humain, comblant ainsi un manque critique en biologie de la découverte, où les méthodes basées sur la dissociation perdent le contexte anatomique. Cette approche facilite la validation de cibles en associant des signatures d'expression génique à des sous-segments précis du néphron, renforçant ainsi la dé-risque mécanistique dans les modèles de maladies rénales. La méthode offre une confiance prédictive pour l'interrogation des voies biologiques et la priorisation des portefeuilles dans les flux de travail de découverte précoce.
Applications stratégiques en R-D biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en cartographiant l'expression des gènes vers des compartiments rénaux définis sur le plan anatomique.
- Valeur opérationnelle : Favorise la détection biologique des risques grâce à des signatures transcriptomiques ancrées spatialement, qui préservent le contexte tissulaire.
- Valeur prédictive : Facilite la confiance dans la cible en corrélant l'expression des marqueurs régionaux à l'identité fonctionnelle des sous-segments.
Développement de tests et de criblages
- Valeur scientifique : Prépare des systèmes biologiques validés pour des protocoles omiques en aval en isolant des ARN de haute intégrité à partir de régions microdisséquées.
- Valeur opérationnelle : Garantit la standardisation et la reproductibilité des tests grâce à des paramètres de contrôle qualité évaluant l'adéquation des échantillons et les taux de réussite de la microdissection.
- Extensibilité : Permet une évaluation fiable de composés en fournissant des données transcriptomiques quantitatives et résolues spatialement pour des campagnes de criblage.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Relie les découvertes à la validation préclinique par la modélisation de systèmes pertinents pour la maladie, utilisant des sous-segments rénaux humains.
- Alignement des biomarqueurs : Favorise le développement de biomarqueurs translationnels en identifiant des profils d'expression génique spécifiques à chaque compartiment, détectables dans les tissus.
- Progression ajustée au risque : Éclaire la prise de décision préclinique en révélant l'activité des voies biologiques dans des régions anatomiquement précises affectées par la maladie.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La microdissection au laser s'inscrit dans le continuum de la découverte, allant de la vérification d'hypothèses à l'identification de candidats, en permettant un profilage moléculaire résolu spatialement qui fait le lien entre l'imagerie et les approches omiques.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses et la clarification des voies biologiques en reliant l'expression génique à des repères structuraux dans le tissu rénal.
- Écrantage : Assure la préparation des tests grâce à une dissection à haut taux de réussite (>90 %) et un rendement suffisant en ARN pour des applications de séquençage.
- Analytique : Fournit des mesures quantitatives de variables dépendantes (seuils de détection de gènes ≥10 000 gènes), permettant des comparaisons entre différentes conditions.
- Recherche translationnelle : Favorise la continuité préclinique en préservant le contexte spatial perdu avec les méthodes basées sur la dissociation.
- Réutilisation en entreprise : Fonctionne comme une capacité réutilisable sur divers types de tissus par substitution de marqueurs anticorps, soutenant une adoption généralisée sur l'ensemble de la plateforme.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive en réduisant l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles rénales.
- Valeur opérationnelle : Renforce la standardisation et la reproductibilité grâce à des paramètres de flux de travail définis et des points de contrôle qualité.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions de poursuite ou d'abandon en permettant une priorisation ajustée au risque selon la biologie spécifique à chaque sous-segment.
- Impact sur le portefeuille : Favorise l'efficacité du capital en éliminant précocement les risques associés aux cibles rénales à l'aide de données spatialement résolues.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en coloration par immunofluorescence et en identification morphologique des sous-segments rénaux.
- Dépend de plateformes de microdissection laser et de kits d'isolement d'ARN compatibles avec des échantillons à faible quantité.
- Exige une standardisation interéquipes des protocoles de coloration, des seuils de dissection et des métriques de contrôle qualité.
- L'adaptation à différents modèles nécessite la validation des marqueurs d'anticorps et des repères structuraux dans les tissus cibles.
- Les limites pratiques incluent la précision dépendante de l'utilisateur dans l'identification des régions et le maintien de l'intégrité de l'ARN durant le traitement.
