Application de la microdissection laser pour découvrir la transcriptomics régionale dans le tissu rénal humain

La microdissection laser permet l’analyse transcriptomique de régions spatialement définies dans les échantillons de tissus rénaux. Cela nous donne l’occasion unique d’identifier des structures d’intérêt même après que des changements induits par la maladie aient eu lieu. Les principaux avantages de cette méthodologie sont sa complémentarité avec d’autres technologies omiques, telles que le séquençage de l’ARN sur cellule unique.

Il offre une économie tissulaire remarquable et permet même de détecter des transcrits faiblement exprimés. Après avoir acquis l’échantillon de tissu, utilisez un cryostat réglé à moins 20 degrés Celsius pour couper l’échantillon à une épaisseur de 12 micromètres et utilisez l’adaptateur de lame pour fixer l’échantillon à une lame de microdissection laser spécialisée. Dans les 10 jours suivant la cryosection, mélangez 89,2 microlitres de 10 % BSA sans RNase dans du PBS avec quatre microlitres de phalloidine FITC, 1,5 microlitre de DAPI, deux microlitres de l’anticorps d’intérêt directement conjugués à Alexa Fluor 546 et 3,3 microlitres d’inhibiteur de RNase.

Lavez la lame à moins 20 degrés Celsius 100 % acétone pendant une minute et placez la lame dans une chambre d’humidité. Lavez le haut de la lame deux fois avec du PBS frais sans RNase pendant 30 secondes par lavage, suivi de deux lavages de 30 secondes avec 10 % de BSA dans du PBS sans RNase. Après le dernier lavage, traitez l’échantillon avec la solution d’anticorps préparée pendant cinq minutes à température ambiante avant de laver deux fois de plus avec 10 % BSA dans du PBS sans RNase.

Après le deuxième lavage, faites sécher la lame à l’air libre pendant cinq minutes dans une hotte de culture tissulaire avant de charger la lame sur la plate-forme de découpe par microdissection laser. Installez sur le dispositif des tubes de prélèvement de micro-centrifugeuse de 500 microlitres autoclavés, adaptés aux travaux de PCR, contenant 50 microlitres de tampon d’extraction d’un kit d’isolement d’ARN. Après le chargement, identifiez les régions d’intérêt dans l’échantillon par coloration, morphologie et emplacement.

Utilisez l’immunofluorescence pour délimiter au moins 500 000 micromètres de segments carrés d’intérêt. Lancez ensuite la microdissection laser pour exciser la région à l’aide d’une puissance laser supérieure à 40. Une fois le processus de microdissection au laser terminé, bouchez les tubes de collecte de la microcentrifugeuse et agitez vigoureusement les tubes pour vous assurer que le contenu se déplace des bouchons vers le fond des tubes.

Après la centrifugation, incubez les tubes dans un bain-marie à 42 degrés Celsius pendant 30 minutes avant de centrifuger à nouveau les tubes. Transférez ensuite les surnageants dans de nouveaux tubes de 500 microlitres à partir d’un stockage à moins 80 degrés Celsius. L’identification des sous-segments tubulaires dans le rein est réalisée par coloration par anticorps de marqueurs tubulaires uniques en plus de la morphologie cellulaire et des repères structurels.

Le marquage par fluorescence en conjonction avec les caractéristiques morphologiques des tissus et le positionnement spatial des structures d’image facilite la visualisation des sous-segments rénaux avec un haut degré de confiance. Dans cette analyse de séquençage en aval représentative, le taux de réussite du respect de l’entrée minimale de la zone de dissection était supérieur à 90 %, ce qui a permis d’obtenir une quantité totale élevée d’ARNm disponible pour la détection des gènes. Dans cette analyse, 100 % des échantillons ont atteint le seuil de détection minimum d’au moins 10 000 gènes.

Après microdissection laser, l’analyse d’enrichissement de l’expression génique de marqueurs connus peut être comparée à celles d’autres compartiments. Dans cette analyse, un marqueur pour chaque sous-segment a été identifié par transcriptomique régionale de microdissection laser qui a également produit une coloration immunohistochimique spécifique du sous-segment de néphron correspondant. Il est important de noter que la microdissection laser s’appuie fortement sur l’expertise de l’utilisateur pour identifier précisément les structures d’intérêt à disséquer.

Cette technique permet d’étudier des signatures d’expression génique régionales spécifiques qui peuvent être utilisées pour évaluer les voies potentielles impliquées dans la progression de la maladie, ainsi que la biologie des tissus sains.