Livraison d’anticorps dans le cerveau à l’aide d’ultrasons à balayage focalisé

Seule une petite fraction des anticorps thérapeutiques est absorbée par le cerveau. En utilisant notre méthode, les anticorps sont délivrés dans le cerveau en ouvrant transitoirement la barrière hémato-encéphalique. Cette technique nous permet de délivrer des anticorps dans le cerveau de la souris de manière non invasive.

Pour effectuer le contrôle de la qualité des microbulles à l’aide d’un compteur de cellules, retirez la solution de microbulles de l’amalgamateur et utilisez une aiguille de calibre 19 pour percer le septum du flacon de solution de microbulles. À l’aide d’une seringue d’un millilitre munie d’une aiguille de calibre 19, diluer 100 microlitres de microbulles dans cinq millilitres de solution à écoulement filtré et pipeter 100 microlitres de solution à bulles diluée dans 10 millilitres de solution à écoulement filtré dans une cuvette. Verrouillez la cuvette en place sur la plate-forme du compteur de cellules et assurez-vous qu’une ouverture de 30 microns sera utilisée pour l’acquisition de l’échantillon.

Dans le logiciel, chargez la méthode de fonctionnement standard et sélectionnez Modifier la méthode de fonctionnement standard et la concentration. Entrez 5 000 fois pour la dilution et cliquez sur appliquer et OK. Cliquez sur Modifier les informations pour sélectionner un nom de fichier approprié. Sélectionnez Aperçu et vérifiez que la concentration de l’échantillon de microbulles est inférieure à 10 %Sélectionnez Démarrer et OK pour commencer l’acquisition de l’échantillon.

Après la mesure, rincez l’ouverture du compteur de cellules avec une solution d’écoulement filtrée. Sonicez la cuvette de solution de microbulles diluée pendant 30 secondes dans un bain-marie. Mesurez la solution de microbulles soniquées comme indiqué et cliquez sur Modifier les informations pour étiqueter les données comme vides.

Après avoir mesuré l’ébauche, soustrayez la lecture finale de la lecture initiale pour exclure toutes les particules qui ne sont pas des microbulles. Pour étiqueter les sections avec un anticorps IgG anti-souris fluorescent, étiquetez un milligramme d’anticorps IgG de souris avec Alexa Flour 647 dans un tampon de bicarbonate de sodium de 0,1 molaire selon les instructions du fabricant pendant 15 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, chargez la solution d’anticorps marquée par fluorescence sur une colonne de centrifugation et purifiez l’anticorps par centrifugation.

Ensuite, utilisez un spectrophotomètre pour mesurer la concentration en protéines. Pour configurer le système d’échographie à balayage focalisé, ajoutez un espace de cinq millimètres au bolus d’eau pour positionner le foyer d’échographie à neuf millimètres sous le bas du bol d’eau. Remplissez le bolus d’eau avec environ 300 millilitres d’eau dégazée déminéralisée et placez le réseau annulaire dans le bolus d’eau rempli.

Utilisez un miroir dentaire pour vérifier qu’il n’y a pas de bulles d’air à la surface et lancez le logiciel d’application. Dans le menu de la forme d’onde, sélectionnez définir le rapport cyclique de la forme d’onde et réglez la fréquence de répétition des impulsions sur 10 Hertz, le rapport cyclique sur 10 %, la mise au point sur 80 millimètres, la fréquence centrale sur un mégahertz, l’amplitude sur 0,65 mégapascal et l’indice mécanique sur 0,65. Appuyez sur set pour définir la forme d’onde et stocker la forme d’onde en mémoire.

Après avoir sélectionné le plan de traitement, ouvrez l’onglet de balayage dans la fenêtre du contrôleur de mouvement et entrez les valeurs de début, d’arrêt et d’incrément pour le mouvement dans la dimension X et les valeurs de démarrage, d’arrêt et d’incrément pour le mouvement dans la direction Y. Pour définir les actions des sites de traitement, cliquez sur événement et ouvrez la fenêtre d’édition du script. Sélectionnez une liste d’actions qui seront exécutées dans l’ordre sélectionné sur chaque site de traitement et définissez le type de mouvement sur grille raster.

Dans l’onglet événements, sélectionnez Ajouter des actions et déplacez les actions ARB de démarrage synchronisé du déclencheur de démarrage ARB d’attente et d’arrêt du déclencheur vers le panneau de script. Cliquez ensuite sur l’action d’attente et sélectionnez un temps d’attente de 6 000 millisecondes. Pour préparer un animal à l’analyse, après avoir confirmé une absence de réponse au pincement des orteils chez une souris anesthésiée, utilisez un marqueur permanent pour étiqueter le centre de la tête, puis collez une pellicule plastique au fond d’un petit bateau de pesée avec la coupe de fond et remplissez le bateau de pesée avec du gel à ultrasons.

Pour un traitement par ultrasons focalisés, inversez le flacon de microbulles et chargez doucement un microlitre de solution par gramme de poids corporel de la souris dans une seringue à insuline de calibre 29. Ajoutez 100 microlitres d’anticorps marqués par fluorescence dans la seringue et retournez doucement et roulez la seringue entre le pouce et l’index pour mélanger l’anticorps et les microbulles à l’intérieur de la seringue. Injectez soigneusement et lentement 150 microlitres de la solution de microbulles et d’anticorps dans la souris et réglez une minuterie sur deux minutes.

Appliquez une pommade ophtalmique, puis placez la souris dans le support de tête et fixez son nez dans le support. Placez le petit bateau de pesée rempli de gel à ultrasons sur le dessus de la tête et abaissez le bolus d’eau jusqu’à ce qu’il repose sur le gel à ultrasons à l’intérieur du bateau de pesée. Utilisez ensuite le joystick pour aligner visuellement la mise au point du transducteur au centre de la tête.

Lorsque la minuterie se déclenche, dans l’onglet mouvement du logiciel, sélectionnez réinitialiser l’origine et sélectionnez un balayage complet. Une fois le traitement terminé, appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux de l’animal et placez la souris dans une chambre de récupération chauffée. Ici, les résultats représentatifs des mesures du compteur de culture de la taille et de la concentration qui peuvent être obtenues lorsque les microbulles sont produites correctement sont présentés.

L’absorption d’anticorps par le cerveau peut être facilement visualisée dans l’ensemble du cerveau ou des coupes de tissus à l’aide d’un scanner infrarouge ou d’une microscopie fluorescente des sections. Comme le démontrent ces images, la coloration représentative des marqueurs microgliaux peut être utilisée pour déterminer si les microglies deviennent plus phagocytaires après l’administration de l’anticorps. Il est important d’assurer le bien-être et la sécurité des animaux, en particulier lors de la réalisation des injections rétro-orbitales et de l’application du transducteur au-dessus de la tête des souris.

Cette méthode permet l’application de divers modèles de balayage pour cibler différentes régions du cerveau, telles que l’hippocampe, le cortex ou des hémisphères cérébraux individuels. Cette technique peut être utilisée pour mettre au point de nouvelles thérapies et de nouveaux médicaments qui pénètrent la barrière hémato-encéphalique et pour étudier le mécanisme de formation et d’ouverture de la barrière hémato-encéphalique.