Techniques de microinjection embryonnaire pour une mutagénèse efficace spécifique au site chez Culex quinquefasciatus

Les techniques de micro-injection d’embryons ont ouvert la voie au développement de nombreux outils de lutte antivectorielle basés sur la génétique. Bien que de nombreuses espèces d’insectes aient des protocoles déjà bien développés, Culex quinquefasciatus reste relativement peu étudié. Ce protocole de micro-injection a été spécialement conçu pour s’adapter aux caractéristiques biologiques uniques de Culex quinquefasciatus, y compris la collecte d’œufs, la séparation des radeaux d’œufs et les procédures post-injection.

Cette méthode peut probablement être adaptée à n’importe quelle espèce de Culex d’intérêt, et peut être utilisée pour étudier la fonction des gènes ou pour générer des technologies de contrôle basées sur la génétique pour les espèces de Culex. Commencez par séparer les œufs des radeaux. À l’aide d’une pince ou d’un pinceau, appuyez sur le radeau et séparez les œufs individuels.

Alignez les œufs sur une fine bande de ruban adhésif double face placée sur le dessus d’une lame de verre, en faisant un effort pour pointer le côté antérieur de chaque œuf dans la même direction. Préparez le mélange d’halocarbures en mélangeant doucement les réactifs d’halocarbure avec de l’eau et en incubant le mélange à 25 degrés Celsius pendant la nuit. Recouvrez les œufs alignés avec le mélange d’huile d’halocarbure.

Pour générer des aiguilles pour les micro-injections, placez un verre capillaire en aluminosilicate dans un extracteur d’aiguille, en suivant les instructions du fabricant. Réglez la chaleur sur 560, la vitesse sur 100, le retard sur 70, la traction sur 97 et la pression sur 500. Activez ensuite l’extracteur d’aiguille.

Touchez doucement la pointe de l’aiguille tirée sur la plaque abrasive diamantée rotative pendant environ 10 secondes à un angle de 50 degrés pour biseauter la pointe de l’aiguille. Enfoncez des aiguilles tirées et biseautées dans des lignes d’argile de modéliste dans une boîte de Pétri. Préparez le mélange d’injection composé de réactifs de modification du génome et stockez-le sur de la glace.

À l’aide d’un embout de microchargeur, chargez deux microlitres de mélange d’injection dans l’aiguille d’injection. Placez l’aiguille d’injection remplie dans un micromanipulateur relié à un micro-injecteur électronique et placez la lame de verre avec les œufs alignés sur la platine d’un microscope composé. À l’aide du micromanipulateur, alignez l’aiguille pour viser l’extrémité postérieure de l’embryon à un angle de 25 à 35 degrés.

Insérez soigneusement l’aiguille dans l’embryon et injectez le mélange à une quantité d’environ 10 % du volume de l’embryon. Injectez 20 ovules à la fois, puis arrêtez et effectuez les procédures de récupération d’embryons. Dans les 20 minutes suivant l’injection, retirez soigneusement l’huile d’halocarbure des œufs en les brossant légèrement avec un pinceau propre.

Soulevez les œufs avec le pinceau et placez-les dans une tasse d’eau distillée doublement, en prenant soin de garder les œufs à la surface. Au cours des sept prochains jours, vérifiez quotidiennement les œufs pour l’éclosion et suivez les procédures normales d’élevage des larves. Dépister les moustiques injectés pour les phénotypes mutants à l’aide d’un stéréoscope.

Cette méthode a été utilisée pour générer avec succès des mutations somatiques et germinales d’un gène essentiel au développement de la pigmentation de l’œil foncé. Les mutations somatiques générées par CRISPR-Cas9 ont été notées par dépistage de la perte de pigmentation dans les yeux au stade pupillaire des individus injectés. Les mutations somatiques étaient généralement présentes sous forme de phénotypes en mosaïque, où certaines cellules mais pas toutes ont le phénotype mutant.

Les taux de mutation germinale ont été déterminés en croisant des individus en mosaïque G zéro et en notant par progéniture aux yeux complètement blancs. Ces expériences ont abouti à un taux de survie embryonnaire de 64 à 82 %, à un taux de mutagénèse somatique de 37 à 57 % et à un taux de mutagénèse germinale supérieur à 61 %. En multiplexant les ARNsg pour cibler plusieurs loci dans le même gène, les taux de mutagenèse somatique et germinale ont augmenté jusqu’à 86 %.

Pour optimiser les taux de survie et de mutagénèse, tous les matériaux, y compris l’huile d’halocarbure, le liquide d’injection et les aiguilles, doivent être correctement préparés avant de tenter des micro-injections. Cela permettra un processus de micro-injection plus rationalisé et plus ciblé.