Techniques de microinjection embryonnaire pour une mutagénèse efficace spécifique au site chez Culex quinquefasciatus
24 mai 2020
Ce protocole décrit les procédures de micro-injection pour les embryons de Culex quinquefasciatus qui sont optimisées pour fonctionner avec les outils d’édition de gènes CRISPR/Cas9. Cette technique peut générer efficacement des mutations germinales héréditaires spécifiques au site qui peuvent être utilisées pour construire des technologies génétiques dans ce vecteur de maladie peu étudié.
Les techniques de micro-injection d’embryons ont ouvert la voie au développement de nombreux outils de lutte antivectorielle basés sur la génétique. Bien que de nombreuses espèces d’insectes aient des protocoles déjà bien développés, Culex quinquefasciatus reste relativement peu étudié. Ce protocole de micro-injection a été spécialement conçu pour s’adapter aux caractéristiques biologiques uniques de Culex quinquefasciatus, y compris la collecte d’œufs, la séparation des radeaux d’œufs et les procédures post-injection.
Cette méthode peut probablement être adaptée à n’importe quelle espèce de Culex d’intérêt, et peut être utilisée pour étudier la fonction des gènes ou pour générer des technologies de contrôle basées sur la génétique pour les espèces de Culex. Commencez par séparer les œufs des radeaux. À l’aide d’une pince ou d’un pinceau, appuyez sur le radeau et séparez les œufs individuels.
Alignez les œufs sur une fine bande de ruban adhésif double face placée sur le dessus d’une lame de verre, en faisant un effort pour pointer le côté antérieur de chaque œuf dans la même direction. Préparez le mélange d’halocarbures en mélangeant doucement les réactifs d’halocarbure avec de l’eau et en incubant le mélange à 25 degrés Celsius pendant la nuit. Recouvrez les œufs alignés avec le mélange d’huile d’halocarbure.
Pour générer des aiguilles pour les micro-injections, placez un verre capillaire en aluminosilicate dans un extracteur d’aiguille, en suivant les instructions du fabricant. Réglez la chaleur sur 560, la vitesse sur 100, le retard sur 70, la traction sur 97 et la pression sur 500. Activez ensuite l’extracteur d’aiguille.
Touchez doucement la pointe de l’aiguille tirée sur la plaque abrasive diamantée rotative pendant environ 10 secondes à un angle de 50 degrés pour biseauter la pointe de l’aiguille. Enfoncez des aiguilles tirées et biseautées dans des lignes d’argile de modéliste dans une boîte de Pétri. Préparez le mélange d’injection composé de réactifs de modification du génome et stockez-le sur de la glace.
À l’aide d’un embout de microchargeur, chargez deux microlitres de mélange d’injection dans l’aiguille d’injection. Placez l’aiguille d’injection remplie dans un micromanipulateur relié à un micro-injecteur électronique et placez la lame de verre avec les œufs alignés sur la platine d’un microscope composé. À l’aide du micromanipulateur, alignez l’aiguille pour viser l’extrémité postérieure de l’embryon à un angle de 25 à 35 degrés.
Insérez soigneusement l’aiguille dans l’embryon et injectez le mélange à une quantité d’environ 10 % du volume de l’embryon. Injectez 20 ovules à la fois, puis arrêtez et effectuez les procédures de récupération d’embryons. Dans les 20 minutes suivant l’injection, retirez soigneusement l’huile d’halocarbure des œufs en les brossant légèrement avec un pinceau propre.
Soulevez les œufs avec le pinceau et placez-les dans une tasse d’eau distillée doublement, en prenant soin de garder les œufs à la surface. Au cours des sept prochains jours, vérifiez quotidiennement les œufs pour l’éclosion et suivez les procédures normales d’élevage des larves. Dépister les moustiques injectés pour les phénotypes mutants à l’aide d’un stéréoscope.
Cette méthode a été utilisée pour générer avec succès des mutations somatiques et germinales d’un gène essentiel au développement de la pigmentation de l’œil foncé. Les mutations somatiques générées par CRISPR-Cas9 ont été notées par dépistage de la perte de pigmentation dans les yeux au stade pupillaire des individus injectés. Les mutations somatiques étaient généralement présentes sous forme de phénotypes en mosaïque, où certaines cellules mais pas toutes ont le phénotype mutant.
Les taux de mutation germinale ont été déterminés en croisant des individus en mosaïque G zéro et en notant par progéniture aux yeux complètement blancs. Ces expériences ont abouti à un taux de survie embryonnaire de 64 à 82 %, à un taux de mutagénèse somatique de 37 à 57 % et à un taux de mutagénèse germinale supérieur à 61 %. En multiplexant les ARNsg pour cibler plusieurs loci dans le même gène, les taux de mutagenèse somatique et germinale ont augmenté jusqu’à 86 %.
Pour optimiser les taux de survie et de mutagénèse, tous les matériaux, y compris l’huile d’halocarbure, le liquide d’injection et les aiguilles, doivent être correctement préparés avant de tenter des micro-injections. Cela permettra un processus de micro-injection plus rationalisé et plus ciblé.
Aperçu
Ce protocole décrit des techniques de microinjection pour des embryons de Culex quinquefasciatus, optimisées pour l'édition génique par CRISPR/Cas9. Il permet de générer efficacement des mutations germinales héréditaires pour la recherche génétique et les technologies de contrôle des vecteurs.
Composants clés de l'étude
Domaine scientifique
- Génie génétique
- Biologie des vecteurs
- Technologie CRISPR/Cas9
Contexte
- Culex quinquefasciatus est un vecteur de maladies peu étudié.
- Les techniques de microinjection sont essentielles au développement d'outils de contrôle génétique.
- Les protocoles existants pour d'autres espèces d'insectes sont bien établis.
- Cette méthode tient compte des caractéristiques biologiques uniques des espèces de Culex.
Objectif de l'étude
- Développer un protocole de microinjection pour Culex quinquefasciatus.
- Faciliter les études sur la fonction des gènes et les technologies de contrôle génétique.
- Optimiser les taux de survie et de mutagenèse chez les embryons injectés.
Méthodes utilisées
- Techniques de collecte des œufs et de séparation des radeaux.
- Préparation de l'huile d'halocarbone et du mélange d'injection.
- Microinjection d'embryons à l'aide d'un micromanipulateur.
- Recherche de phénotypes mutants après l'injection.
Résultats principaux
- Taux de survie des embryons atteint de 64 à 82 %.
- Les taux de mutagenèse somatique variaient de 37 à 57 %.
- Les taux de mutagenèse germinale dépassaient 61 %.
- La multiplexion des ARNsg augmentait les taux de mutagenèse à 86 %.
Conclusions
- Le protocole génère avec succès des mutations somatiques et germinales.
- Des lignées homozygotes viables de mutants ont été maintenues en laboratoire.
- Une préparation adéquate des matériaux améliore le processus de microinjection.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'injection microscopique d'embryons efficace permet une mutagenèse ciblée chez Culex quinquefasciatus, un vecteur clé de maladies telles que le virus du Nil occidental et la filariose lymphatique. Cette capacité soutient la validation ciblée et la réduction des risques mécanistiques en phase de découverte précoce, en générant des mutations héréditaires pour des études fonctionnelles des gènes. Le protocole surmonte les obstacles propres à l'espèce, améliorant ainsi la fiabilité prédictive dans l'identification des cibles de lutte antivectorielle et le développement de modèles précliniques.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet d'interroger des hypothèses thérapeutiques grâce à une invalidation génique précise chez un vecteur insecte pertinent pour la maladie.
- Valeur opérationnelle : Fournit une méthode reproductible pour générer des mutations germinales afin de valider fonctionnellement des cibles impliquées dans la transmission des agents pathogènes.
- Valeur prédictive : Facilite le tri du portefeuille de projets en associant la perturbation génique à des résultats phénotypiques essentiels pour la compétence vectorielle.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Produit des données quantifiables de mutagenèse (taux somatiques et germinaux) pour évaluer l'efficacité d'édition selon les conceptions d'ARN guide.
- Valeur opérationnelle : Standardise la manipulation des embryons et les conditions d'injection, améliorant la reproductibilité du test entre les lots expérimentaux.
- Extensibilité : Permet la livraison multiplexée d'ARNg pour augmenter les taux de mutagenèse, facilitant le criblage à haut débit de cibles.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Génère des mutants à yeux blancs héréditaires afin d'établir des lignées génétiques stables pour des études phénotypiques et d'analyse de transmission à long terme.
- Valeur opérationnelle : Atteint des taux de survie des embryons de 64 à 82 %, assurant ainsi un nombre suffisant de mutants viables pour le criblage phénotypique ultérieur.
- Continuité translationnelle : Préserve des stocks viables de mutants homozygotes d'une génération à l'autre, permettant l'évaluation préclinique de stratégies de contrôle génétique.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de la découverte, allant de l'hypothèse sur une cible à l'identification d'un candidat, en permettant la génomique fonctionnelle dans une espèce vectorielle peu étudiée.
- Découverte biologique : Soutient la vérification d'hypothèses par mutagenèse médiée par CRISPR/Cas9 afin de clarifier la fonction des gènes dans les interactions pathogène-vecteur.
- Criblage : Fournit des taux de mutagenèse quantitatifs (37–57 % somatiques, >61 % germinaux) pour comparer l'efficacité des ARN guide et optimiser les conditions d'édition.
- Analytique : Permet l'évaluation des phénotypes mutants par criblage stéréoscopique, fournissant des données mesurables pour la validation des résultats positifs.
- Recherche translationnelle : Facilite la transition de la découverte génique au développement de modèles précliniques en générant des lignées mutantes stables.
- Réutilisation en milieu professionnel : Met en place un protocole standardisé de microinjection adaptable à différentes espèces de Culex, réduisant ainsi le développement redondant de protocoles.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique en permettant un lien direct entre génotype et phénotype dans un modèle de maladie transmise par vecteur.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité grâce à des étapes standardisées d'alignement des œufs, de recouvrement par halocarbure et de préparation des aiguilles.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'aller/arrêt en fournissant une validation fonctionnelle des cibles essentielles à la survie du vecteur ou à la transmission de l'agent pathogène.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des cibles en fonction des taux de mutation héréditaires et de la gravité phénotypique.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la manipulation des embryons, la micromanipulation et l'observation en fluorescence ou en stéréoscopie.
- Dépend de la préparation du tire-lame, du microinjecteur et de l'huile d'halocarbure pour la viabilité des embryons.
- Exige une standardisation inter-équipes des techniques de collecte des œufs et de séparation des radeaux.
- L'adaptation à différentes espèces de Culex peut nécessiter des ajustements du volume d'injection et de la géométrie de l'aiguille.
- Les limitations pratiques incluent la fragilité des embryons et la nécessité d'une récupération immédiate après l'injection pour maintenir les taux de survie.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:51
Alignment of C. quinquefasciatus Pre-blastoderm Stage Embryos
1:46
Embryo Microinjection
3:32
Embryo Recovery and Hatching
4:08
Results: Survival and Mutation Rates of Embryos Injected with Single and Multiplexed gRNAs Targeting White
5:25
Conclusion
