Méthode de détection quantitative de microARN dans le rein d’un modèle murin de lésion rénale ischémique

L’expression modifiée des microARN dans l’IRA peut être utile pour les biomarqueurs et le traitement. Ce protocole est simple et permet d’obtenir des résultats constants entre les laboratoires. L’IRI du rein représente l’un des principaux facteurs de risque d’IRA. La quantification des microARN modifiés par l’IRI permet d’établir un diagnostic. Les microARN purifiés à partir d’un échantillon de rein sont appliqués à d’autres systèmes. Surveillez attentivement l’hypothermie, l’hydratation intestinale et la profondeur de l’anesthésie tout au long de la procédure. En effet, il existe de nombreuses techniques manuelles auxquelles il faut s’habituer.

[Narrateur] Après avoir confirmé l’absence de réponse au pincement de l’orteil, placez la souris anesthésiée sur un coussin chirurgical chauffé en position couchée. Après avoir pratiqué une incision abdominale médiane, utilisez un coton-tige imbibé de PBS pour pousser doucement l’intestin vers le côté gauche de la cavité abdominale supplémentaire afin d’exposer le rein droit et l’uretère et utilisez une pince coudée pour soulever l’uretère droit. Lissez l’uretère à deux endroits avec des sutures tressées en soie 4-0, en laissant des liens plus longs pour la suture qui est plus proche du rein, et coupez entre les sutures. En tenant soigneusement la suture restante, disséquez brutalement le tissu conjonctif et la graisse le long du rein et identifiez un vaisseau sanguin qui n’est pas les artères ou les veines rénales qui fournissent du sang au rein droit. Lister le vaisseau et, lorsque le rein droit a été suffisamment détaché, ligaturer la veine rénale et l’artère. À l’aide d’un coton-tige imbibé de PBS, poussez doucement l’intestin vers le côté droit de la cavité abdominale supplémentaire pour exposer le rein gauche et couvrez l’intestin avec un drap humidifié. Après avoir préparé le rein gauche comme démontré, clampez l’artère rénale et la veine à un centimètre du rein pour induire une ischémie rénale gauche. Une ischémie réussie peut être confirmée visuellement par un assombrissement progressif et uniforme du tissu rénal. Lorsque l’ischémie est confirmée, retournez le tissu intestinal dans la cavité abdominale, en prenant soin d’éviter la torsion intestinale, et fermez et drapez temporairement la peau abdominale. Après 25 à 45 minutes, retirez la pince et confirmez que la reperfusion du flux sanguin et la couleur des reins s’améliorent. Après avoir confirmé que l’intestin n’est pas tordu, instillez le PBS intrapéritonéal et fermez le muscle abdominal et la peau en deux couches à l’aide de sutures en nylon 4-0. 24 heures après l’induction d’une lésion ischémique, rouvrez l’incision médiane et utilisez une aiguille de calibre 27 pour prélever le sang de la veine cave inférieure. Faites une incision médiane dans la paroi thoracique et insérez une aiguille de calibre 23 dans le ventricule gauche. Après avoir confirmé le reflux dans l’aiguille, faites une incision dans le lobe droit du foie et injectez 20 millilitres de PBS. Le foie passera du rouge au rose, confirmant qu’une quantité suffisante de sang a été drainée. Utilisez des pinces et des ciseaux pour retirer le rein gauche et lavez le tissu excisé dans une boîte de PBS. Ensuite, utilisez la pince pour retirer le fascia rénal sans dessécher le rein et coupez le rein en deux le long de la ligne médiane verticale. Pour la purification des microARN, placez 30 milligrammes de l’échantillon de rein congelé dans un homogénéisateur en verre contenant 700 microlitres de réactif de lyse à base de phénylguanidine sur de la glace et tournez lentement et à plusieurs reprises le pilon pour homogénéiser complètement l’échantillon. Lorsque le tissu a été complètement dissocié, transférez le lysat homogénéisé dans le système de broyage de biopolymères dans une colonne de centrifugation microcentrifuge dans un tube de collecte de deux millilitres et collectez l’échantillon au fond du tube par centrifugation. Transférez le lysat dans un nouveau microtube à centrifuger contenant 140 microlitres de chloroforme et mélangez le tube par inversion pendant 15 secondes avec le capuchon bien serré. Après une incubation de deux à trois minutes à température ambiante, sédimentez l’échantillon par centrifugation et transférez le surnageant dans un nouveau tube de micro-centrifugeuse contenant 1,5 fois le volume d’éthanol à 100 % sans perturber la pastille. Mélangez l’échantillon pendant cinq secondes par vortex avant de transférer 700 microlitres de l’échantillon dans une colonne de centrifugation à base de membrane de silice dans un tube de collecte de deux millilitres. Après une brève centrifugation, jeter le flux continu et laver l’échantillon deux fois avec 500 microlitres de tampon de lavage 2 dans une nouvelle colonne d’essorage à base de membrane de silice par lavage pour éliminer toute trace de sel. Après le deuxième lavage, centrifugez à nouveau la colonne de centrifugation à base de membrane de silice et, après avoir jeté le flux, transférez la colonne dans un nouveau tube de collecte de 1,5 millilitre. Ajoutez 25 microlitres d’eau sans RNase dans la colonne et incubez l’échantillon pendant cinq minutes à température ambiante avant de le centrifuger à nouveau. Transférez ensuite l’éluite contenant des microARN de 25 microlitres dans un nouveau tube à micro-centrifuger. Dans cette étude, sept microARN exprimés chez l’homme et régulés à la hausse dans les reins de souris atteintes d’insuffisance rénale aiguë ont été étudiés. Les niveaux de six des microARN se sont avérés significativement augmentés dans les reins des souris ayant subi des lésions d’ischémie et de reperfusion par rapport à ceux des souris simulacres utilisant la PCR quantitative en temps réel, comme cela a été démontré. Les taux sériques d’urée, d’urée, d’azote et de créatinine dans le sang et la nécrose tubulaire aiguë ont également été significativement régulés à la hausse.

Les biomarqueurs pour le diagnostic de l’IRI et le traitement spécifique de l’IRA restent incertains. J’espère que la recherche sur les microARN fera progresser et contribuera au diagnostic et au traitement de l’IRA.