Évaluation quantitative en temps réel du PCR des expressions microARN dans le rein de souris avec obstruction urérale unilatérale
27 août 2020
Nous décrivons une méthode pour évaluer l’expression de microARN dans les reins des souris avec l’obstruction ureterale unilatérale (UUO) par la réaction quantitative de la chaîne de transcription inverse-polymérase. Ce protocole convient pour étudier les profils d’expression de microARN de rein chez les souris avec UUO et dans le contexte d’autres conditions pathologiques.
Cette méthode permet de fournir l’expression de microARN dans les reins des souris avec un large éventail de conditions pathologiques, telles que la fibrose rénale. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet le profilage d’expression microARN avec une grande précision et sensibilité en utilisant un processus simple qui permet de gagner du temps et d’éviter les erreurs techniques. Pour effectuer la chirurgie simulée, utilisez des ciseaux chirurgicaux et des pinces à épiler pour faire une incision dans la peau à l’abdomen et couper le muscle et la membrane péritonéale de la vessie au bord inférieur gauche des côtes.
Humidifier deux cotons-tiges avec PBS et tirer soigneusement les intestins sur le côté. Placez les écouvillons humidifiés pour identifier le rein gauche et l’uretrée. Fermer la membrane péritonéale, puis l’incision avec du nylon 4-0.
Pour effectuer l’obstruction urétrale unilatérale, ou UUO, faire une incision dans la peau à l’abdomen et couper le muscle et la membrane péritonéale comme démontré pour la chirurgie simulée. Placez une seringue de 2,5 millilitres sous la souris. Humidifiez deux cotons-tiges avec du PBS, puis tirez soigneusement les intestins sur le côté avec les pinces et placez les écouvillons pour identifier l’uretères gauche.
Utilisez la pince à épiler pour soulever le rein gauche. Utilisez de la soie 4-0 pour ligate l’uretier gauche à deux endroits à environ un centimètre l’un de l’autre. Couper l’uretère au point central des deux ligatures, puis utiliser des sutures de nylon 4-0 pour fermer la membrane péritonéale et l’incision.
Après avoir coupé la membrane péritonéale, comme démontré précédemment, soulevez-la avec des pinces à épiler et utilisez des ciseaux chirurgicaux pour faire une incision latérale au bord supérieur, puis continuez l’incision le long du bord le plus bas des côtes. Identifiez le rein gauche et reflux avec PBS jusqu’à ce que le rein devient jaune-blanc. Retirez le rein en coupant l’artère rénale gauche et la veine avec les ciseaux chirurgicaux et placez-le dans une boîte de Pétri, puis lavez-le soigneusement avec PBS.
Couper le rein en échantillons d’environ 10 milligrammes avec les ciseaux chirurgicaux et les pinces à épiler, mettre chaque morceau du rein dans son propre tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre et fermer le bouchon du tube. Mettre un échantillon de rein dans l’homogénéiseur en silicone et ajouter 700 microlitres d’un phényle / guanidine à base de lyse reagent. Appuyez lentement et tordez le pilon de l’homogénéisateur contre l’échantillon rénal pour l’homogénéiser.
Répétez le pressage et la torsion jusqu’à ce que l’échantillon soit complètement dissous dans le reagent de lyse. Pour homogénéiser davantage l’échantillon, transférez le lysate homogénéisé à la colonne de spin biopolymère et tournez-le à 14 000 fois G pendant trois minutes, puis transférez le lysate précipité dans un tube de microcentrifugeuse inutilisé de 1,5 millilitre. Mélanger le lysate dans le tube avec 140 microlitres de chloroforme et bien capifier le tube.
Pour mélanger le lysate et le chloroforme, inverser le tube 15 fois. Incuber les échantillons pendant deux à trois minutes à température ambiante, puis les faire tourner à 12 000 fois G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Sans perturber le précipité, transférez le supernatant dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre et ajoutez 1,5 fois son volume de 100 % d’éthanol.
Vortex le mélange pendant cinq secondes. Chargez 700 microlitres de l’échantillon sur une colonne de spin à ancrage membranaire dans un tube de collecte de deux millilitres. Fermez le capuchon de colonne et faites tourner la colonne à 15 000 fois G pendant 15 secondes, puis jetez le lysate précipité dans le tube de collecte.
Lavez soigneusement l’échantillon en ajoutant 700 microlitres de tampon de lavage un à la colonne de spin ancré par membrane dans un tube de collecte de deux millilitres. Répétez ensuite la centrifugation et jetez le tube de collecte. Répétez le lavage deux fois avec 500 microlitres de tampon de lavage deux par lavage.
Après le dernier lavage, faites tourner la colonne de spin ancrée dans un tube de collecte de deux millilitres à 15 000 fois G pendant une minute et jetez le lysate précipité. Transférer la colonne de spin ancré par membrane dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. Dissoudre l’ARN total en ajoutant 30 microlitres d’eau sans RNase à la colonne, fermer le bouchon de colonne et le laisser pendant cinq minutes à température ambiante.
Ensuite, faites tourner la colonne à 15 000 fois G pendant une minute. Transférer l’échantillon contenant l’ARN total dans un nouveau tube de microcentrifugeuse sur la glace et mesurer la concentration totale d’ARN par spectrophotométrie. Préparez une solution de mélange maître selon les instructions manuscrites et ajoutez huit microlitres à chaque tube d’une bande de tube de huit puits.
Après ajustement de la densité totale de l’ARN, placez un aliquot de 12 microlitres d’ARN total dans chaque tube et fermez le bouchon. Centrifuger les tubes pendant 15 secondes. Mettez les tubes dans le thermocycleur et incubez-les pendant 60 minutes à 37 degrés Celsius.
Une fois terminés, incubez-les immédiatement pendant cinq minutes à 95 degrés Celsius pour la synthèse de l’ADN. Transférer l’ADRC dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre et le diluer 10 fois avec de l’eau distillée. Vortex et centrifugeuse du tube pendant cinq secondes, puis effectuer quantitative en temps réel PCR, tel que décrit dans le manuscrit du texte.
Ce protocole a été employé pour créer un modèle unilatéral de souris d’obstruction urétrale par ligature urétrale gauche dans les souris mâles de huit semaines pesant 20 à 25 grammes. Les uretères ont été complètement obstrués par la double ligature avec des sutures de soie 4-0. Des reins ont été rassemblés à huit jours après chirurgie.
Les données qRT-PCR de microARN ont indiqué que le niveau de microARN 3070-3p a été sensiblement augmenté et les niveaux de microARN, 7218-5p et microARN 7219-5p ont été diminués dans les reins des souris d’UUO comparées aux contrôles. Lorsque vous essayez ce protocole, n’oubliez pas de répéter la torsion de l’échantillon de rein jusqu’à ce qu’il soit complètement dissous dans le reagent de lyse à base de phényle/guanidine pour obtenir une bonne extraction d’ARN.
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Aperçu
Cet article décrit une méthode d'évaluation de l'expression des microARN dans les reins de souris présentant une obstruction unilatérale de l'uretère (UUO) à l'aide de la réaction de polymérisation en chaîne par transcription inverse quantitative. Cette technique permet une grande précision et sensibilité dans l'analyse de l'expression des microARN dans diverses conditions pathologiques.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie
- Pathologie rénale
Contexte
- Les microARN jouent un rôle essentiel dans la régulation des gènes.
- L'obstruction unilatérale de l'uretère (UUO) constitue un modèle pour l'étude des maladies rénales.
- La compréhension des profils de microARN peut fournir des informations sur la fibrose rénale.
- Les méthodes actuelles peuvent manquer de sensibilité et de précision.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode fiable pour évaluer l'expression des microARN dans les tissus rénaux.
- Faciliter la recherche sur les maladies rénales et leurs mécanismes sous-jacents.
- Améliorer la compréhension des rôles des microARN dans les conditions pathologiques.
Méthodes utilisées
- PCR quantitatif en temps réel après transcription inverse (qRT-PCR).
- Chirurgie factice pour préparer le modèle murin.
- Utilisation d'instruments chirurgicaux pour la manipulation des tissus.
- Application de PBS pour la manipulation des tissus.
Résultats principaux
- La méthode permet un profilage précis des microARN.
- Sensibilité élevée pour la détection des niveaux de microARN dans les tissus rénaux.
- Facilite l'étude de diverses pathologies rénales.
- Réduit les erreurs techniques par rapport aux méthodes traditionnelles.
Conclusions
- Cette méthode fournit un outil précieux pour la recherche sur le rein.
- Elle améliore la compréhension des fonctions des microARN dans les maladies rénales.
- Des études futures pourront exploiter cette technique pour des applications plus larges.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les cadres
Le profilage précis de l'expression des microARN dans les modèles de fibrose rénale soutient la validation des cibles et la réduction des risques mécanistiques dans la découverte de médicaments pour les maladies rénales. Cette méthode de qRT-PCR permet une quantification reproductible des microARN associés à la maladie, offrant une confiance prédictive pour l'interrogation des voies biologiques et l'alignement des biomarqueurs. Elle comble un manque critique dans l'analyse des tissus rénaux, facilitant les tests d'hypothèses en phase précoce et la priorisation des portefeuilles de recherche.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en quantifiant la dysrégulation des miARN dans la fibrose rénale induite par l'obstruction unilatérale de l'uretère (UUO).
- Valeur opérationnelle : Fournit un protocole fiable pour l'isolement et la mesure des miARN à partir de tissu rénal, réduisant ainsi la variabilité technique.
- Valeur prédictive : Facilite la validation fonctionnelle des cibles en associant les variations d'expression des miARN à des voies biologiques pertinentes pour la maladie.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Génère des données quantitatives normalisées d'expression des miARN, adaptées à l'optimisation des dosages et à la préparation au criblage.
- Valeur opérationnelle : Offre une haute sensibilité et spécificité dans la détection des miARN, permettant une évaluation fiable de l'effet des composés.
- Extensibilité : Utilise un procédé d'extraction simplifié et de RT-qPCR compatible avec des applications à débit moyen.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Relie les découvertes initiales sur les miARN à la validation préclinique dans un modèle de fibrose pertinent sur le plan clinique.
- Alignement sur les biomarqueurs : Permet l'évaluation des miARN-3070-3p, miARN-7218-5p et miARN-7219-5p comme biomarqueurs translationnels potentiels.
- Progression ajustée au risque : Soutient les décisions d'aller ou de ne pas aller plus loin en fournissant des lectures moléculaires reproductibles à partir de tissus rénaux malades.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant de l'identification de cibles jusqu'à l'optimisation de composés précurseurs, en fournissant des données de phénotypage moléculaire qui éclairent la prise de décisions précoces.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification d'hypothèses sur les mécanismes médiés par les miARN dans la fibrose rénale grâce à un profilage d'expression précis.
- Écrantage : Produit des résultats quantitatifs et reproductibles qui soutiennent un écrantage fiable de composés et l'analyse des relations structure-activité.
- Analytique : Fournit des valeurs de Ct normalisées et des mesures de variation d'expression permettant la comparaison entre différentes conditions et une évaluation statistique.
- Recherche translationnelle : S'inscrit dans la continuité préclinique en utilisant un modèle UUO pertinent pour la maladie afin d'évaluer les modifications des miARN associées à la pathologie.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme standardisée d'analyse des miARN applicable à plusieurs modèles et projets de maladies rénales.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant l'ambiguïté mécanistique des voies régulées par les miARN.
- Valeur opérationnelle : Garantit la standardisation et la reproductibilité entre laboratoires grâce à un protocole bien défini et contrôlé vis-à-vis des contaminations.
- Valeur stratégique : Améliore l'efficacité du capital en permettant l'élimination précoce des risques associés aux cibles, sur la base d'un phénotypage moléculaire robuste.
- Impact sur le portefeuille : Favorise une priorisation ajustée au risque en fournissant des données quantitatives sur les miARN qui éclairent le choix et la progression des cibles.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la manipulation des ARN, la génération de modèles chirurgicaux et l'optimisation de la qRT-PCR.
- Suppose l'accès à des instruments chirurgicaux, à du matériel d'homogénéisation et à un appareillage de PCR en temps réel.
- Exige une standardisation des étapes d'extraction des ARN et de synthèse d'ADN complémentaire entre les utilisateurs et les sites.
- Implique des ajustements à prendre en compte lors de l'application du protocole à différentes régions rénales ou à divers modèles de maladie.
- Comprend des limites pratiques liées à la variabilité du rendement en ARN et à la nécessité de réplicats techniques pour assurer la robustesse des données.
